RNAi的研究進(jìn)展

1、RNAi的研究進(jìn)展RNA干擾(RNA interference ,RNAi) 現(xiàn)象是一種進(jìn)化上保守的抵御轉(zhuǎn)基因或外來病毒侵犯的防御機(jī)制。將與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 存在同源互補(bǔ)序列的雙鏈RNA(double strand RNA ,dsRNA) 導(dǎo)入細(xì)胞后,能特異性地降解該mRNA ,從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失,這一過程屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制( posttranscriptional gene siliencing , PTGS) 范疇。RNAi 廣泛存在于生物界,從低等原核生物,到植物,真菌,無脊椎動(dòng)物,甚至近來在哺乳動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)了此種現(xiàn)象,只是機(jī)制也更為復(fù)雜。一RNAi的發(fā)現(xiàn)早在1990

2、 年進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物有關(guān)研究時(shí)偶然發(fā)現(xiàn),將全長(zhǎng)或部分基因?qū)胫参锛?xì)胞后某些內(nèi)源性基因不能表達(dá),但這些基因的轉(zhuǎn)錄并無任何影響,并將這種現(xiàn)象稱為基因轉(zhuǎn)錄后沉默(posttranscriptional gene silencing ,PTGS) . 1996 年在脈孢菌屬(Neurospora) 中發(fā)現(xiàn)了相似現(xiàn)象,只不過將這種現(xiàn)象命名為基因表達(dá)的阻抑作用(quelling) . 首次發(fā)現(xiàn)dsRNA 能夠?qū)е禄虺聊木€索來源于線蟲Caenorhabditis elegans 的研究。1995年康乃爾大學(xué)的研究人員Guo 和Kemphues 嘗試用反義RNA 去阻斷par1 基因的表達(dá)以探討該基因的功能

3、,結(jié)果反義RNA 的確能夠阻斷par21基因的表達(dá),但是奇怪的是,注入正義鏈RNA 作為對(duì)照,也同樣阻斷了基因的表達(dá)。這個(gè)奇怪的現(xiàn)象直到3年后才被解開華盛頓卡耐基研究院的Andrew Fire 和馬薩諸塞大學(xué)癌癥中心的Craig Mello 首次將雙鏈dsRNA 正義鏈和反義鏈的混合物注入線蟲,結(jié)果誘發(fā)了比單獨(dú)注射正義鏈或者反義鏈都要強(qiáng)得多的基因沉默。實(shí)際上每個(gè)細(xì)胞只要很少幾個(gè)分子的雙鏈RNA 已經(jīng)足夠完全阻斷同源基因的表達(dá)。后來的實(shí)驗(yàn)表明在線蟲中注入雙鏈RNA 不單可以阻斷整個(gè)線蟲的同源基因表達(dá),還會(huì)導(dǎo)致其第一代子代的同源基因沉默。他們將這種現(xiàn)象稱為RNA 干擾。過去認(rèn)為, 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不

4、存在RNAi 現(xiàn)象,因?yàn)檩^長(zhǎng)的dsRNA 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能誘導(dǎo)IFN(干擾素) 生成,并激活STAT 途徑參與的PKR(dsRNA 依賴性激酶) 的轉(zhuǎn)錄,同時(shí)dsRNA 本身與PKR 結(jié)合也能令其激活,繼而磷酸化翻譯起始因子eIF2a 使之失活,導(dǎo)致非特異性的蛋白質(zhì)合成障礙;另一方面,dsRNA 又能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生多種抗病毒蛋白的2,5腺苷合成酶,生成 2,5腺苷酸,激活非特異性的RNA 酶L ,發(fā)生非特異性的RNA 降解效應(yīng)。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn), 只要dsRNA 短于30bp ,就不會(huì)促發(fā)干擾素效應(yīng),同時(shí)又能特異性地降解mRNA ,引起基因沉默,說明dsRNA 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也能發(fā)揮一定作用,為以后

5、的基因治療等RNAi 應(yīng)用領(lǐng)域提供了新的研究方向。二RNAi的作用機(jī)制近年來研究發(fā)現(xiàn),干擾性小RNA( small interfering RNA ,或short interfering RNAs , siRNA) 是RNA 干擾作用(RNAi) 賴以發(fā)生的重要中間效應(yīng)分子. siRNA 是一類長(zhǎng)約2125 個(gè)核苷酸( nt ) 的特殊雙鏈RNA(dsRNA) 分子,具有特征性結(jié)構(gòu),即siRNA 的序列與所作用的靶mRNA 序列具有同源性; siRNA 兩條單鏈末端為5端磷酸和3端羥基. 此外,每條單鏈的3端均有23 個(gè)突出的非配對(duì)的堿基RNAi 的主要過程是,dsRNA 被核酸酶切割成212

6、5 nt 的干擾性小RNA ( siRNA) ,由siRNA 介導(dǎo)識(shí)別并靶向切割同源性靶mRNA 分子. 細(xì)胞中dsRNA的形成是RNAi 的第一步. 細(xì)胞中dsRNA 可通過多種途徑形成,如基因組中DNA 反向重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物;同時(shí)轉(zhuǎn)錄反義和正義RNA ;病毒RNA 復(fù)制中間體;以及以細(xì)胞中單鏈RNA 為模板由細(xì)胞或病毒的RNA 依賴RNA 聚合酶(RdRp) 催化合成dsRNA等. 在線蟲( C. elegans) 可以直接注射dsRNA 或把線蟲浸泡在含dsRNA 溶液中等方式引入外源dsRNA ,還可以通過喂養(yǎng)表達(dá)正義和反義RNA 的細(xì)菌獲得dsRNA.現(xiàn)已初步闡明RNAi 的作用機(jī)

7、制. RNAi 的第一步是,dsRNA 在內(nèi)切核酸酶(一種具有RNase 樣活性的核酸酶) 作用下加工裂解形成2125 nt 的由正義和反義序列組成的干擾性小dsRNA ,即siRNA.果蠅中RNase III 樣核酸酶稱為Dicer. Dicer 含有解旋酶(helicase) 活性以及dsRNA 結(jié)合域和PAZ 結(jié)構(gòu)域. 已發(fā)現(xiàn)在Arabidopsis , C. elegans , Schizosaccharomyces pombe 以及哺乳動(dòng)物中也存在Dicer 同類物. RNAi 的第二步是,由siRNA 中的反義鏈指導(dǎo)形成一種核蛋白體,該核蛋白體稱為RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體( RNA

8、 induced silencing complex , RISC) , 由RISC 介導(dǎo)切割靶mRNA 分子中與siRNA 反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域,從而達(dá)到干擾基因表達(dá)作用. RISC 由多種蛋白成分組成,包括內(nèi)切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA 鏈搜索活性等. 線蟲C. elegans中的MUT7(一種RNase D樣蛋白) 可能是一種35外切核酸酶. 此外, PAZPPiwi 蛋白家族成員可能是RISC中的構(gòu)成組分,如Arabidposis 中的AGO1 ; N.Crassa 中的QDE; C. elegans 中的RDE1 等,以上這些蛋白與翻譯因子eIF2C 同源.引自 Gregor

9、y J.Hannon(2002) Nature,418,244-251最新的研究進(jìn)一步揭示,ATP 在siRNA 介導(dǎo)的RNAi 中具有重要作用. 較長(zhǎng)dsRNA 向siRNA 的轉(zhuǎn)變要有ATP 參與. siRNA 與蛋白因子形成一個(gè)無活性的約360 kD 的蛋白PRNA 復(fù)合體;隨之, siRNA雙鏈結(jié)構(gòu)解旋并形成有活性的蛋白PRNA 復(fù)合體(RISC) ,此步具有ATP 依賴性. RISC 活性復(fù)合體對(duì)靶mRNA 的識(shí)別和切割作用,這一步可能不需ATP參與.此外,ATP 使siRNA 5端帶上磷酸分子,且對(duì)siRNA 的功能具有重要作用. 上述過程中siRNA 雙鏈結(jié)構(gòu)解旋很可能是一種穩(wěn)定

10、的結(jié)構(gòu)改變,因?yàn)閟iRNA 雙鏈體與細(xì)胞裂解物、ATP 等孵育后再除去ATP 及其它輔助因子,含有siRNA 的活性復(fù)合體仍能識(shí)別和切割靶mRNA 分子siRNA 可作為一種特殊引物,在RNA 依賴RNA聚合酶(RdRp) 作用下以靶mRNA 為模板合成dsRNA ,后者可被降解形成新的siRNA ;新生成的siRNA又可進(jìn)入上述循環(huán). 這種過程稱為隨機(jī)降解性多聚酶鏈反應(yīng)(random degradative PCR) . 新生的dsRNA 反復(fù)合成和降解,不斷產(chǎn)生新的siRNA ,從而使靶mRNA 漸進(jìn)性減少,呈現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象. RdRp 一般只對(duì)所表達(dá)的靶mRNA 發(fā)揮作用,這種在RNAi

11、 過程中對(duì)靶mRNA 的特異性擴(kuò)增作用有助于增強(qiáng)RNAi的特異性基因監(jiān)視功能. 每個(gè)細(xì)胞只需要少量dsRNA 即能完全關(guān)閉相應(yīng)基因表達(dá),可見RNAi 過程具有生物催化反應(yīng)的基本動(dòng)力學(xué)特征.miRNA 與siRNA 的區(qū)別：（1） miRNA是單鏈的，而siRNA則是雙鏈的；（2） miRNA參與正常情況下生長(zhǎng)發(fā)育基因調(diào)控，而siRNA不參與動(dòng)物體的正常生長(zhǎng)，只有在病毒或其它dsRNA誘導(dǎo)情況下才產(chǎn)生siRNA,作為miRNA的完善和補(bǔ)充；（3） miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，推測(cè)在翻譯水平也起作用，而siRNA為轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)調(diào)控；（4） Dicer酶對(duì)兩類RNA的加工過程，mi

12、RNA為不對(duì)稱性，僅來自含莖環(huán)結(jié)構(gòu)RNA前體的一側(cè)臂，剩余部分很快降解，而這種不對(duì)稱性不存在于而siRNA加工過程中。三，RNAi的應(yīng)用前景RNAi 技術(shù)中的相關(guān)問題主要涉及以下幾點(diǎn):(1) dsRNA 序列的選擇dsRNA 主要選自已知的cDNA 的開放閱讀框架(ORF) 中的基因區(qū)域。為防止mRNA 調(diào)控蛋白對(duì)RISC 與靶RNA 結(jié)合的干擾,應(yīng)避免選擇包括:1) 起始密碼子下游或終止密碼的50100 核苷酸位置以內(nèi)的區(qū)域;2) 5或3端的非翻譯區(qū)域;3) 內(nèi)含子區(qū)域。此外,序列選擇時(shí)也應(yīng)避開多聚鳥苷酸序列區(qū)( 3 個(gè)) ,因?yàn)檫@樣容易形成四聚體結(jié)構(gòu), 抑制RNAi 作用。選擇與靶mRNA

13、 上序列互補(bǔ)的2123 個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的片段,以AA 開頭為佳,因?yàn)榇朔芎?jiǎn)化dsRNA 合成過程,降低成本,而且合成的dsRNA 能更好地抵抗RNA 酶的降解。另外,盡量使dsRNA 序列中的GC含量接近50 %(45 %55 %最佳) ,高GC 含量能明顯降低基因沉默的效應(yīng)。選擇前可以搜索BLAST數(shù)據(jù)庫,保證無其他與靶基因同源的基因存在,避免引起對(duì)其他相似基因的沉默作用。并不是所有的mRNA 均對(duì)RNAi 敏感。為確保靶基因表達(dá)的有效抑制,最好同時(shí)合成兩個(gè)或以上的針對(duì)同一基因的不同靶區(qū)域的dsRNA ;而且,標(biāo)記dsRNA 正義鏈的3端對(duì)RNAi 現(xiàn)象并沒有影響,現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)尚未發(fā)現(xiàn)mRNA

14、 的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)RNAi 有任何顯著的影響。目前,RNAi 技術(shù)主要以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為對(duì)象研究其基因的功能。但> 30bp 的dsRNA 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中會(huì)引起干擾素樣效應(yīng),導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。因而直接選用其下游的產(chǎn)物分子siRNA 來代替,達(dá)到基因研究的目的。(2) dsRNA 的導(dǎo)入方法不同的生物體可以選擇不同的方法。簡(jiǎn)單生物,如單細(xì)胞生物等,可選用電穿孔的方法; 較復(fù)雜生物可選用dsRNA 微注射入生殖細(xì)胞或早期胚胎,線蟲也能采用腸道或假體腔注射的方法,與微注射相比,RNAi 效率上并無顯著差別。還有浸泡法、工程菌喂養(yǎng)法、磷酸鈣共沉淀法等。若使用的是化學(xué)法人工合成的siRNA(正義鏈和反

15、義鏈) ,還要經(jīng)過退火過程,以雙鏈的形式導(dǎo)入靶細(xì)胞。有人提出了以質(zhì)粒或病毒為載體,通過轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染途徑,在細(xì)胞內(nèi)以DNA 為模板,利用RNA 聚合酶,轉(zhuǎn)錄為siRNA(直接形成雙鏈或通過回文序列折疊后形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)) ,也能產(chǎn)生較明顯的RNAi 效應(yīng)。最近,又有一種新的導(dǎo)入方法,就是借助高壓水槍的外力將構(gòu)建的質(zhì)粒直接自小鼠的尾靜脈注入體內(nèi),觀察RNAi 在活體生物模型而不是培養(yǎng)細(xì)胞上的基因沉默效應(yīng) ,但觀察到的siRNA 的半衰期較短,而且由于使用了高壓的外力,過程較復(fù)雜,限制了其在人類疾病治療方面的應(yīng)用。而Pachuk 等則提出了肌注的方法,將針對(duì)IL12 的siRNA 的質(zhì)粒表達(dá)載體導(dǎo)入小鼠體

16、內(nèi),得到的RNAi 效應(yīng)更持久。(3) 發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的siRNA實(shí)驗(yàn)證明,發(fā)夾樣siRNA 能延長(zhǎng)在細(xì)胞內(nèi)的作用時(shí)間。此類結(jié)構(gòu)可由具有回文序列的核苷酸鏈形成。但通常回文結(jié)構(gòu)不易獲得,也可用頭碰頭的對(duì)稱序列來代替。轉(zhuǎn)錄發(fā)夾樣siRNA 的模板必須與載體轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子緊密相連,而且盡可能有最短的多聚腺苷酸尾巴,這樣才能誘導(dǎo)高效的RNAi 效應(yīng)。Paddison 等提出類似的結(jié)構(gòu)也可應(yīng)用于長(zhǎng)片段dsRNA (500bp 左右) ,而不會(huì)引起RNA 非特異性的降解。這為檢測(cè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中經(jīng)過長(zhǎng)期發(fā)育后的基因功能提供了新的途徑。RNAi 的應(yīng)用領(lǐng)域及前景：RNAi 是一種高效的特異性強(qiáng)的基因阻斷技術(shù),近年來發(fā)

17、展迅速,很快就成為功能基因組研究的有力工具。通過實(shí)驗(yàn)手段將dsRNA 分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi), 特異性地降解細(xì)胞內(nèi)與其序列同源的mRNA ,封閉內(nèi)源性基因表達(dá),從反向遺傳的角度研究人類或其他生物基因組中未知基因的功能。早期就有人應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)分離了果蠅胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通路中的各種成分。近來也有實(shí)驗(yàn)報(bào)道通過RNAi 研究細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)平衡過程中涉及的各條途徑。在這之前,曾利用反義RNA 與靶mRNA 序列互補(bǔ)的特性來抑制其表型的發(fā)生,但由于反義RNA對(duì)內(nèi)源性表達(dá)的基因抑制作用較弱,往往會(huì)產(chǎn)生一些過渡表型,易造成對(duì)基因功能判斷錯(cuò)誤,目前已通過審批認(rèn)為臨床上具有治療作用的僅有一種藥物Vitravene 。RNA

18、i 技術(shù)與之相比,特異性更高,作用更迅速,副反應(yīng)小,在有效地沉默靶基因的同時(shí),對(duì)細(xì)胞本身的調(diào)控系統(tǒng)也沒有影響。最近在人類體細(xì)胞里已經(jīng)成功地對(duì)近20 種基因功能進(jìn)行了“敲除”,尤其是因此而了解了人類空泡蛋白Tsg101 對(duì)HIV 在人體內(nèi)增殖的作用,進(jìn)一步深化了對(duì)HIV 的研究。Leonid 等以脊髓灰質(zhì)炎病毒為模型,利用RNAi 來誘導(dǎo)細(xì)胞的胞內(nèi)免疫,產(chǎn)生抗病毒效應(yīng),尤其是針對(duì)RNA 病毒。對(duì)于易突變的病毒,可設(shè)計(jì)多種靶向病毒基因保守序列的dsRNA ,減少它對(duì)dsRNA 的抵抗。Maen 等也應(yīng)用RNAi 技術(shù)成功地阻斷了MCF7 乳腺癌細(xì)胞中一種異常表達(dá)的與細(xì)胞增殖分化相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子基因Sp21 的功能。RNAi 技術(shù)的應(yīng)用,不僅能大大推動(dòng)人類后基因組計(jì)劃(蛋白組學(xué)) 的發(fā)展,還有可能設(shè)計(jì)出RNAi 芯片,高通量地篩選藥物靶基因,逐條檢測(cè)人類基因組的表達(dá)抑制情況來明確基因的功能,并且它還將應(yīng)用于基因治療、新藥開發(fā)、生物醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域,用RNAi 技術(shù)來抑制基