強(qiáng)肌健力口服液含藥血清對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖的影響

1、強(qiáng)肌健力口服液含藥血清對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖的影響        【摘要】     ：目的 觀察強(qiáng)肌健力口服液含藥血清對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)體外增殖的影響。方法 使用密度梯度離心法分離大鼠MSCs,5-溴脫氧嘧啶(Brdu)和CD44、CD54雙重免疫組化鑒定,傳3代后的MSCs分為強(qiáng)肌健力口服液含藥血清組和空白血清對(duì)照組,四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)2組MSCs的生長(zhǎng)情況。結(jié)果 強(qiáng)肌健力口服液含藥血清組以濃度依賴方式促進(jìn)MSCs的增殖活力,與

2、相應(yīng)濃度的空白血清對(duì)照組比較差異有顯著性意義(P<0.05, P<0.01)。結(jié)論 補(bǔ)脾法(強(qiáng)肌健力口服液含藥血清)能促進(jìn)干細(xì)胞的生長(zhǎng)。     【關(guān)鍵詞】  補(bǔ)脾法強(qiáng)肌健力口服液骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞含藥血清    Effects of Serum Containing Qiangjijianli Oral Liquid on In-Vitro Proliferation of Rat Mesenchymal Stem Cells CHEN Kai-jia, LIU Xiao-bin,

3、QIU Shi-jun, et alGuangzhou University of TCM, Guangzhou 510006, ChinaAbstract：Objective To observe the effect of serum containing Qiangjijianli oral liquid in-vitro proliferation of rat mesenchymal stem cells (MSCs). Methods Rat mesenchymal stem cells dissociated from the bone marrow by density gra

4、dient method were cultured. MSCs were identified by marking of bromodeoxyuridine (Brdu) and staining of CD44, CD45. Experimental group was cultivated with serum containing Qiangjijianli oral liquid and control group with blank serum. Optical absorption value of MSCs was stained by methyl thiazolyl t

5、etrazolium (MTT). Results Serum containing Qiangjijianli oral liquid at different concentrations could promote the proliferation of MSCs, the difference being significant in comparison with the control group (P<0.01). Conclusion Invigorating the spleen (serum containing Qiangjijianli oral liquid)

6、 can enhance the proliferation of MSCs.Key words：invigorating the spleen；Qiangjijianli oral liquid；mesenchymal stem cells；serum containing drug    骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是干細(xì)胞中的一種,主要存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中,以骨髓組織中含量最為豐富。MSCs具有易分離、擴(kuò)增以及體外操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn),并能在一定的誘導(dǎo)條件下向成骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞等中胚層細(xì)胞分化,其應(yīng)用前景極其廣闊。本研究在鄧鐵濤教授“脾腎相關(guān)”的理論指導(dǎo)

7、下,探討補(bǔ)脾法(強(qiáng)肌健力口服液含藥血清)對(duì)大鼠MSCs增殖的影響。1  材料與方法1.1  動(dòng)物    純種SD大鼠,SPF級(jí),4周齡,體重90130 g,用于MSCs細(xì)胞的提?。患兎NSD大鼠,SPF級(jí),成年,體重180220 g,用于含藥血清的制備,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào)：粵鑒證字2005A031SCXK(粵)2003-0001。1.2  主要試劑    IMDM培養(yǎng)基、特級(jí)胎牛血清、胎牛血清(FBS)：美國(guó)GIBCOL公司產(chǎn)品；鏈霉親和素生物素復(fù)合物(SABC)、二氨基聯(lián)苯胺(DA

8、B)染色試劑盒、抗體CD44、抗體CD54、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、生物素化二抗(羊抗小鼠)、AEC顯色劑、BCTP/NBT顯色劑：武漢博士德公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(噻唑藍(lán),MTT)、5-溴脫氧嘧啶(Brdu)及其單克隆小鼠抗體：美國(guó)Sigma公司；D-Hanks液、TBS、PBS、2%臺(tái)盼藍(lán)染液、0.25%胰酶、馬血清：廣州威佳公司提供。1.3  強(qiáng)肌健力口服液含藥血清的制備    強(qiáng)肌健力口服液(黃芪、黨參、白術(shù)、當(dāng)歸、甘草等)由廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)中心提供,批號(hào)20040701,臨床批件號(hào)2003L00874,含原藥材1 204 g/L。采用成

9、年SPF級(jí)SD大鼠,分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組,每組5只。實(shí)驗(yàn)組每日給予強(qiáng)肌健力口服液灌胃,灌胃劑量以50 kg體重成人的常規(guī)用量,按大鼠體重轉(zhuǎn)換系數(shù)計(jì)算,含原藥材36.12 g/kg,連灌1周。對(duì)照組則給予等體積蒸餾水灌胃,連灌1周。最后1次灌胃后2 h,無菌條件下開胸取血,靜置34 h,離心分離血清,取上清液,56 水浴滅活30 min,-20 保存,制備強(qiáng)肌健力口服液含藥血清和空白對(duì)照血清。1.4  骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及體外擴(kuò)增    取4周齡SPF級(jí)SD大鼠4只,10%水合氯醛腹腔麻醉注射。無菌條件下取雙股骨及脛骨,收集骨髓腔內(nèi)組織細(xì)胞。將細(xì)胞懸液分

10、裝,2 000 r/min離心20 min,密度梯度離心2次,收取單核細(xì)胞層,加入IMDM培養(yǎng)液,打散成細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液用2%臺(tái)盼藍(lán)染液染色,計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞,調(diào)整密度,染成藍(lán)色的死細(xì)胞小于5%方可繼續(xù)實(shí)驗(yàn),計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),按1×104個(gè)/瓶密度接種于(7×5)cm2培養(yǎng)瓶中,置于37 、5%飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2 d后半量更換培養(yǎng)液,棄去未貼壁細(xì)胞。以后每3 d換液1次。細(xì)胞培養(yǎng)710 d后細(xì)胞密度較高,達(dá)90%融合后棄去培養(yǎng)液,加入D-Hanks緩沖液進(jìn)行沖洗,0.25%的胰蛋白酶37 條件下消化510 min,鏡下觀察消化控制時(shí)間。當(dāng)細(xì)胞形態(tài)開始變圓、漂浮、脫

11、壁,立即加入血清終止消化反應(yīng)。常規(guī)按12或13比例傳代。1.5  骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞雙標(biāo)免疫組化檢測(cè)    傳3代后的細(xì)胞種入裝有IMDM空白培養(yǎng)基的24孔板中,24 h后固定；0.01 mol/L TBS洗2次(10 min,5 min),3% H2O2洗滌10 min,蒸餾水洗2 min×3次；正常山羊血清封閉20 min,甩去多余液體,一抗用多克隆兔抗,CD44、CD54(1100)4 過夜(對(duì)照組不加一抗,加TBS),0.01 mol/L TBS洗2 min×3次,生物素化羊抗兔37 40 min,TBS洗2 min×

12、3,SABC-AP 37 40 min,TBS洗5 min×4次,BCTP/NBT顯色30 min,雙蒸水洗2 min×3次。雙標(biāo)阻斷液30 min,0.01 MTBS洗2 min×3次,正常山羊血清封閉20 min,一抗用Brdu(小鼠單克隆抗體)1100于37 3 h(對(duì)照組不加一抗),0.01 mol/LTBS洗2 min×3次,生物素化羊抗小鼠IgG 37 40 min,0.01 mol/L PBS洗2 min×3次,SABC試劑37 40 min,0.01 mol/L TBS洗5 min×3次,DAB顯色3040 min。中

13、性樹膠封片。1.6  MTT法細(xì)胞活性檢測(cè)     制備單細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL,接種于96孔板,1×103個(gè)細(xì)胞/孔,每孔容量200 L,實(shí)驗(yàn)組分別含強(qiáng)肌健力口服液含藥血清5、25、50、75、100 L/mL,對(duì)照組分別含空白血清5、25、50、75、100 L/mL。各組同時(shí)培養(yǎng)達(dá)72 h后每孔加入MTT(5 mg/mL)20 L,繼續(xù)在37 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h,去上清,然后每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 L,振搖10 min,用PE-1420多功能微板分析儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)光吸收值

14、(OD),以繪制增殖曲線。1.7  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法    所得數(shù)據(jù)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果用x±s表示,用t檢驗(yàn)和方差分析確定差異顯著性。2  結(jié)果2.1  骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增傳代后觀察    傳3代后的MSCs細(xì)胞,在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中均可生長(zhǎng),在空白血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較緩慢(見圖1),而在強(qiáng)肌健力口服液含藥血清中細(xì)胞生長(zhǎng)迅速,形成克隆球(見圖2)。2.2  骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞雙標(biāo)免疫組化檢測(cè)結(jié)果    鏡下可見,未使用CD44、CD54、Brdu

15、標(biāo)記的細(xì)胞未被染色,鏡下為透明的細(xì)胞(見圖3),用CD44、CD54單標(biāo)并經(jīng)BCTP/NBT染色,再經(jīng)Brdu雙標(biāo)DAB復(fù)染后的MSCs細(xì)胞表面被染成藍(lán)色,細(xì)胞核被染成棕黃色,表達(dá)率達(dá)96%以上(見圖4),表明培養(yǎng)的確是MSCs細(xì)胞。2.3  強(qiáng)肌健力口服液含藥血清對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響(見表1) 表1  強(qiáng)肌健力口服液含藥血清與空白血清組MTT比較(x±s,OD)濃度(略)注：與相應(yīng)濃度空白血清組比較,*P<0.05,*P<0.013  討論3.1  骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定    本實(shí)驗(yàn)利

16、用密度梯度離心將大部分的造血細(xì)胞和MSCs分離開來,再經(jīng)過多次體外貼壁培養(yǎng)換液去除懸浮生長(zhǎng)的造血細(xì)胞,經(jīng)嚴(yán)格控制胰蛋白酶的量和消化時(shí)間,利用MSCs較易脫落的特點(diǎn),保證MSCs在短暫的作用時(shí)間內(nèi)與培養(yǎng)瓶分開,淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞則因貼壁性強(qiáng)仍貼附于培養(yǎng)瓶,從而使MSCs得到純化。免疫細(xì)胞雙標(biāo)化學(xué)染色結(jié)果顯示,所培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)CD44和CD54(見圖4),他們都是MSCs的重要標(biāo)志物,Brdu是一種胸腺嘧啶類似物,利用Brdu標(biāo)記技術(shù)可以觀察MSCs細(xì)胞的分裂增殖情況,所培養(yǎng)的細(xì)胞同時(shí)表達(dá)Brdu和CD44、CD54,表達(dá)率達(dá)96%以上,表明所培養(yǎng)的是具有分裂和增殖能力的MSCs。3.2 

17、; 強(qiáng)肌健力口服液含藥血清對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖作用    強(qiáng)肌健力口服液是根據(jù)鄧鐵濤教授臨證經(jīng)驗(yàn)研制的治療痿證的方藥,該方取“治痿獨(dú)取陽明”之意,在補(bǔ)中益氣湯基礎(chǔ)上,重用黃芪為君,占46.5%,輔以黨參、當(dāng)歸、白術(shù)、甘草等,具有補(bǔ)脾益損的功效1。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法測(cè)量細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,其原理是活細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶能將MTT還原成不溶于水的藍(lán)色產(chǎn)物,而死細(xì)胞沒有這種功能。再用DMSO將藍(lán)色沉淀溶解,用多功能微板分析儀檢測(cè)光吸收值,因此,MTT光吸收值(OD)反映了活細(xì)胞數(shù)量多少,也反映了MSCs的增殖能力。結(jié)果表明,強(qiáng)肌健力口服液含藥血清對(duì)MSCs的增殖作用與濃度呈明顯量效依賴關(guān)系,在濃度達(dá)75100 L/mL時(shí),可以對(duì)MSCs的增殖產(chǎn)生明顯的作用,與空白對(duì)照血清比較,具有顯著性差異。表明增殖是強(qiáng)肌健力口服液藥物作用的效果。    MSCs存在于骨髓中。從中醫(yī)學(xué)而言,生理上,骨髓與腦同屬奇恒之府,與腎有密切關(guān)系,腎合骨、生髓、通腦,均同出于一源,二者來源于先天的腎之精氣,為后天水谷精氣所化生；病理上,若腎精不足,不能生髓充腦,可導(dǎo)致腦海不足諸癥,故臨床上見到骨與腦、脊髓的病變,常從腎著手治療。中醫(yī)理論也認(rèn)為,脾主肌肉,為“后天之本”,氣血生化之源。脾(胃)與腎關(guān)系極其密切,二者生理上相互滋生、相互為用,即“先