利腎口服液拮抗細胞因子對系膜細胞影響的研究

1、    利腎口服液拮抗細胞因子對系膜細胞影響的研究        提要探討利腎口服液治療系膜細胞增殖型腎炎的機理。以腎小球系膜細胞培養(yǎng)技術(shù)，3H-TdR摻入測定法。結(jié)果：利腎口服液高、中劑量組3H-TdR摻入值極顯著低于空白組和IL-1、IL-6、TNF組(P0.01）；IL-1、IL-6、TNF組3H-TdR摻入值極顯著高于空白組（P0.01）。提示：直接抑制系膜細胞和拮抗IL-1、IL-6、TNF刺激系膜細胞異常增殖是利腎口服液治療以系膜細胞增殖為主要病理的腎小球腎炎的機

2、理之一。主題詞利腎口服液/藥理學(xué)系膜細胞清熱利濕 腎小球系膜細胞（GMC）的增殖及其基質(zhì)的病理性聚積是腎小球硬化的主要病理。研究表明某些細胞因子在腎小球腎炎的發(fā)生發(fā)展和慢性化過程中起重要作用1；若探索出拮抗這些細胞因子的中藥，則可望在一定程度上防止腎小球病變的發(fā)生和發(fā)展。本研究觀察了利腎口服液拮抗細胞因子對GMC影響。1材料和方法1.1材料大白鼠，重200g(由華西醫(yī)科大學(xué)動物實驗室提供)，RPMI-1640(美國GIBCO公司提供)，普通胰島素(美國Sigma公司提供)，利腎口服液(由石韋、木賊、益母草等組成，本校附院制劑室提供)；1gml(相當于含生藥3g/ml），濾過除菌，無菌7.5Na

3、HCO3調(diào)pH值至7.17.4。IL-110萬u/支、IL-610萬u/支、TNF5萬u/支、地塞米松5mgml(中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供)。1.2方法24ml的懸液，轉(zhuǎn)種至96孔板，200l孔，預(yù)培24小時，使大部分細胞同步在G0期。除空白組外，其余分別再加入含IL-1、IL-6、TNF各100Uml各等份和利腎口服液高、中、低劑量組(簡稱中藥組，7.5mgml、5mgml、2.5mgml）以及地塞米松10gml的培養(yǎng)液40l。置375CO23公式計算。采用方差分析及t檢驗處理數(shù)據(jù)，統(tǒng)計軟件為SPSS。2結(jié)果2.1利腎口服液直接對GMC的抑制作用見表1。組別n劑量CPM抑制率(%)空 白 組6

4、號液20l1988.5±153.45地米組610gml1214.2±259.9839.34利腎高67.5mgml1168.0±105.2241.26利腎中65mgml1334.8±49.4432.87利腎低62.5mgml1387.2±71.0130.23     注：與空白組比較P0.05；與地米組比較P0.05，與空白組比較P0.01(下同)從表1可以看出，地塞米松能直接抑制GMC的增殖，與同類研究結(jié)果近似4。中藥高、中、低劑量組與地塞米松組CPM值均顯著低于空白組（P0.01）。提示利腎口服液可顯著

5、直接抑制GMC增殖。中藥高、中、低劑量組之間有一定的量效關(guān)系。其抑制率由強至弱的順序為利腎高劑量組地塞米松組利腎中劑量組利腎低劑量組。2.2利腎口服液拮抗IL-1刺激GMC的增殖作用見表2。從表2可以看出，加IL-1組CPM顯著高于空白組（P0.01），提示IL-1能促進GMC增殖；而在IL-1培養(yǎng)皿中加用中藥各劑量組及地塞米松組均可顯著抑制IL-1刺激GMC異常增殖作用（P0.01）。2.3利腎口服液拮抗IL-6刺激GMC的增殖作用見表3。 劑量n劑量CPM抑制率(%)空白組6號液20l1988.5±153.45IL-1組6100U3696.3±606.6885.88地米

6、組610gml1882.2±139.3949.08利腎高67.5mgml1939.2±75.9947.54利腎中65mgml1903.7±203.9848.50利腎低62.5mgml2254.5±28.3639.01     注：與IL-1組比較P0.01，與地米組比較P0.01組別n劑量CPM抑制率(%)空白組6號液20l1988.5±153.45IL-6組6100u3048.8±260.7153.32地米組610gml1665.3±109.6445.78利腎高67.5mgml131

7、1.8±61.5456.98利腎中65mgml1545.3±157.0149.31利腎低62.5mgml2229.3±357.2926.88     注：與IL-6組比較P0.05，與IL-6組比較P0.01從表3可以看出，在IL-6培養(yǎng)皿中加用中藥各劑量組及地塞米松組均可顯著抑制IL-6刺激MC異常增殖的作用（P0.01），中藥高、中、低劑量組之間有一定量效關(guān)系。2.4利腎口服液拮抗TNF刺激GMC的增殖作用見表4。 組別n劑量CPM抑制率(%)空白組6號液20l1988.5±153.45TNF組6100u294

8、9.0±595.7648.30地米組610gml1522.3±170.3448.38利腎高67.5mgml1362.8±47.2853.79利腎中65mgml2003.8±201.9832.05利腎低62.5mgml2435.8±89.4117.40     注：與TNF組比較P0.05，與TNF組比較P0.01從表4可以看出：在TNF培養(yǎng)皿中加用中藥各劑量組及地塞米松組均可顯著抑制TNF刺激MC異常增殖的作用（P0.050.01）。 3討論多種腎小球疾病發(fā)生發(fā)展的結(jié)果均可導(dǎo)致腎小球硬化，雖引起其硬化的因

9、素很多，但其中IL-1、IL-6、TNF作用于GMC使其異常增生是主因之一。人類多種腎小球疾病，如IgA腎病、膜增生性腎炎、狼瘡性腎炎、局灶性腎小球硬化等主要病變均與GMC增生密切相關(guān)。IL1、IL-6、TNF等因子可由GMC分泌產(chǎn)生，且也與GMC膜上相應(yīng)的受體結(jié)合，刺激GMC增殖，并使GMC產(chǎn)生大量的超氧陰離子損傷腎小球，以及GMC增生而致使腎小球基底膜損傷出現(xiàn)大量蛋白尿。因此，阻斷這些因子可以防止腎小球疾病的發(fā)生發(fā)展1。雖糖皮質(zhì)激素是治療腎病的常用藥之一，但療效仍不理想。國內(nèi)尚未見有關(guān)探討中醫(yī)藥復(fù)方對細胞因子影響的報道。本病中醫(yī)學(xué)多從“水腫”論治。一因外感濕熱，困阻上中下三焦，氣機不利，水濕內(nèi)停，發(fā)為水腫；二因臨床長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素，也致“藥源性濕熱證”。濕熱內(nèi)蘊，則阻礙血行。故濕熱夾瘀是導(dǎo)致腎病纏綿難愈原因之一。方中石韋清熱利濕，木賊清熱止血，益母草活血祛瘀，利尿消腫，諸藥共奏清熱利濕，化瘀消腫之功。本實驗表明外源性IL-1、IL-6、TNF可刺激GMCDNA合成增加。并進一步證實利腎口服液除能直接抑制GMC的增殖外，尚可顯著拮抗IL-1、IL-6、TNF刺激GMCDNA合成作用，且這種抑制作用隨劑量增加呈增強