質(zhì)粒DNA的提取-鄭小煜

1、質(zhì)粒DNA的提取、純化和檢測姓名：鄭小煜學(xué)號：201100140069班級：2011級生技班組別：第二組同組者：趙莉、高瑞一、 實驗?zāi)康?、 掌握堿變性提取法的原理及各種試劑的作用。2、 掌握堿變性提取法提取質(zhì)粒DNA的方法。3、 學(xué)習(xí)并掌握凝膠的制備及電泳方法。4、 掌握凝膠的觀察方法，并學(xué)會分析。二、 實驗原理1、 質(zhì)粒(plasmid)l 質(zhì)粒是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子,為雙鏈、閉合環(huán)狀的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主的細(xì)胞質(zhì)中。l 質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。l 質(zhì)粒的存在使宿主細(xì)胞具

2、有一些額外的特性，如 對抗生素的抗性等。l 質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類型：嚴(yán)緊控制型（Strengent control）：復(fù)制受宿主細(xì)胞的嚴(yán)格調(diào)控，拷貝數(shù)低；松弛控制型（Relaxed control）：復(fù)制不受宿主細(xì)胞的調(diào)控，拷貝數(shù)高，適用于基因工程中做載體。2、 提取和純化質(zhì)粒DNA的方法很多，目前常用的有：堿變性提取法、煮沸法、羥基磷灰石柱層析法、EB-氯化銫密度梯度離心法和Wizard法等。其中，堿變性提取法最為經(jīng)典和常用，適于不同量質(zhì)粒DNA的提取。該方法操作簡單，易于操作，一般實驗室均可進(jìn)行。提取的質(zhì)粒DNA純度高，可直接用于酶切、序列測定及分析。EB-氯化銫密度梯度離心法，

3、主要適用于相對分子質(zhì)量與染色體DNA相近的質(zhì)粒，具有純度高、步驟少、方法穩(wěn)定，且得到的質(zhì)粒DNA多為超螺旋構(gòu)型等優(yōu)點，但提取成本高，需要超速離心設(shè)備。少量提取質(zhì)粒DNA還可以用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的質(zhì)粒DNA中常含有RNA，但不影響限制性核酸內(nèi)切酶的消化、亞克隆及鏈接反應(yīng)等。3、 堿變性提取質(zhì)粒DNA一般包括三個基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞以擴(kuò)增質(zhì)粒；收集和裂解細(xì)胞；分離和純化質(zhì)粒DNA。4、 在細(xì)菌細(xì)胞中，染色體DNA以雙螺旋結(jié)構(gòu)存在，質(zhì)粒DNA以共價閉合環(huán)狀形式存在，細(xì)胞破碎后，染色體DNA和質(zhì)粒DNA均被釋放出來，但是兩者變性與復(fù)性所依賴的溶液pH值不同。在pH值高達(dá)12.

4、0的堿性溶液中，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性;共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵斷裂,但兩條互補鏈不完全分離.當(dāng)用pH值4.6的KAc(或NaAc)高鹽溶液調(diào)節(jié)堿性溶液至中性時,變性的質(zhì)粒DNA可恢復(fù)原來的共價閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中; 但染色體DNA 不能復(fù)性，而是與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)一SDS復(fù)合物等一起形成纏連的、可見的白色絮狀沉淀。這種沉淀通過離心，與復(fù)性的溶于溶液的質(zhì)粒DNA分離。溶于上清液的質(zhì)粒DNA，可用無水乙醇和鹽溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA與RNA性質(zhì)類似，乙醇沉淀DNA的同時，也伴隨著RNA沉淀，可利用RNase A將RNA降解。質(zhì)粒

5、DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通過酚氯仿抽提除去，苯酚、氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機(jī)相的分開，異戊醇則可起到消除抽屜過程中出現(xiàn)的泡沫。再用兩倍體積的無水乙醇洗滌沉淀，以除去殘留的氯仿。然后用75%以純?nèi)芤合礈斐恋?，一出去殘留的鹽離子。最后獲得純度較高的質(zhì)粒DNA貯存在TE溶液中，-20保存。5、 電泳(electrophoresis)是帶電物質(zhì)在電場中向著與其電荷相反的電極方向移動的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定pH條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場中會向相反的電極移動。凝膠電泳是分子生物學(xué)的核心技術(shù)之一。凝膠是支持電泳介質(zhì)，它具有分子篩效應(yīng)。含有電解液的凝膠在電場中

6、，其中的電離子會發(fā)生移動，移動的速度可因電離子的大小、形態(tài)及電荷量的不同而有差異。利用移動速度差異，就可以區(qū)別各種大小不同的分子。因而，凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA片段。   6、 凝膠電泳技術(shù)操作簡單而迅速，分辨率高，分辨范圍極廣。此外，凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如溴化乙錠(ethidium bromide，EB)或SYBR Gold染色直接觀察到，甚至含量少至20pg的雙鏈DNA在紫外激發(fā)下也能直接檢測到。需要的話，這些分離的DNA條帶可以從凝膠中回收，用于各種各樣目的的實驗.7、 分子生物學(xué)中，常用的兩種凝膠為瓊脂糖(agarose)

7、和聚丙烯酰胺凝膠。這兩種凝膠能灌制成各種形狀、大小和孔徑，也能以許多不同的構(gòu)型和方位進(jìn)行電泳。聚丙烯酰胺凝膠分辨率高，使用于較小分子核酸(5500bp)的分離和蛋白質(zhì)電泳。它的分辨率非常高，長度上相差1bp或質(zhì)量上相差0.1%的DNA都可以彼此分離，這也是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行DNA序列分析的分子基礎(chǔ)。雖然它能很快地進(jìn)行電泳，并能容納較大的DNA上樣量，但是與瓊脂糖凝膠相比，在制備和操作上繁瑣。瓊脂糖是從海藻中提取的長鏈狀多聚物，由-D-吡喃半乳糖與3,6-脫水-L-吡喃半乳糖組成，相對分子質(zhì)量為104-105。瓊脂糖加熱至90左右，即可溶化形成清亮、透明的液體，澆在模版上冷卻后形成凝膠，

8、其凝固點為40-45。瓊脂糖凝膠相對于聚丙烯酰胺凝膠分辨率低，但它的分離范圍更大(50至百萬bp)，小片段DNA(50-20000bp)最適合在恒定輕度和方向的電場中水平方向的瓊脂糖凝膠內(nèi)電泳分離。瓊脂糖凝膠電泳易于操作，適用于核酸電泳，測定DNA的相對分子質(zhì)量，分離經(jīng)限制酶水解的DNA片段，進(jìn)一步純化DNA等。8、 瓊脂糖凝膠電泳是一種常用的方法。核酸在溶液中由于它們有磷酸基而帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳遷速率主要取決于下面6個因素：（1） 樣品DNA分子的大?。弘娪緯r，線性雙螺旋DNA分子是以頭尾位向前遷移的，其遷移速度與相對分子質(zhì)量（所含堿基）的對數(shù)值成正比，

9、這是因為大分子有更大的摩擦阻力。（2） DNA分子的構(gòu)象：相對分子質(zhì)量相同而構(gòu)象不同的DNA分子，其遷移速率不同。在抽提質(zhì)粒DNA過程中，由于各種因素的影響，使超螺旋的共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的一條鏈斷裂，變成開環(huán)DNA（open circle DNA，ocDNA）分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就轉(zhuǎn)變?yōu)榫€狀DNA（liner DNA，L DNA）分子。這三種構(gòu)型的分子有不同的遷移率。一般情況下，超螺旋型遷移速度最快，其次為線狀分子，最慢的是開環(huán)分子。（3） 瓊脂糖濃度：瓊脂糖濃度直接影響凝膠的孔徑，一定大小的DNA片

10、段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的泳動速度不同。通常凝膠濃度越低，則凝膠孔徑越大，DNA電泳遷移速度越快，因此，相對分子質(zhì)量越大，選用的凝膠濃度應(yīng)越低。（4） 電泳所用電場：低電壓條件下，線性DNA片段的遷移速率與所用電壓成正比，電壓越高，帶電顆粒泳動越快，但隨著電場強(qiáng)度的增加，不同長度DNA泳動的增加程度不同，因此凝膠電泳分離DNA的有效范圍隨著電壓上升而減少。為了獲得DNA片段的最佳分離效果，電場強(qiáng)度應(yīng)小于5V/cm。（5） 緩沖液：緩沖液的組成和離子強(qiáng)度直接影響遷移率。當(dāng)電泳液為去離子水（如不慎誤用去離子水配置凝膠），溶液的導(dǎo)電性很少，帶電顆粒涌動很慢，DNA幾乎不移動；而在高離子強(qiáng)度下（如錯

11、用10*電泳緩沖液），導(dǎo)電性極高，帶電顆粒泳動很快，產(chǎn)生大量的熱，有時甚至融化凝膠或使DNA變性。 電泳時常用的緩沖液有乙酸鹽(TAE)、硼酸鹽(TBE)和磷酸鹽(TPE)幾種不同的電泳緩沖液，通常配成10×或5×的濃縮母液保存于室溫下，用時稀釋至工作濃度。電泳緩沖液的工作濃度約50 mmolL，工作pH在7578之間。TAE緩沖液緩沖能力弱，長時間電泳緩沖能力逐漸喪失(陽極變堿性，陰極變酸性)，長時間電泳需要更換緩沖液；TBE、TPE緩沖液緩沖能力較強(qiáng)，可以重復(fù)使用數(shù)次。TAE緩沖液可以分離數(shù)kb長度的DNA，在精制DNA片段以及染色體DNA進(jìn)行雜交時比較常用。相反，TB

12、E緩沖液適于鑒定、分離短小的DNA片段。（6） 溫度：瓊脂糖凝膠電泳時，不同大小DNA片段的相對電泳遷移率在4-30°C內(nèi)無變化,一般瓊脂糖凝膠電泳多在室溫下進(jìn)行,而當(dāng)瓊脂糖含量少于0.5%時,凝膠很脆弱,最好在4°C下電泳以增加凝膠強(qiáng)度。9、 DNA分子量MarkerSupercoiled DNA Ladder Marker(濃度 : 500 ng/ 6l )Supercoiled DNA Ladder Marker 由 8種超螺旋的質(zhì)粒DNA 構(gòu)成，DNA Size大小分別為: 2,087 bp、3,049 bp、3,997 bp、5,026 bp、6,133 bp、8

13、,023 bp、10,085 bp、11,849 bp。其中2 kbp6 kbp間約以1 kbp遞增，6 kbp12 kbp間約以2 kbp遞增。每次取6 l 電泳時，每條帶的DNA量約為50 ng，其中5 kbp條帶的DNA量約為其他條帶的3倍 (150 ng)，顯示亮帶。此DNA 溶液中已含有1 ×Loading Buffer，可直接上樣。1 × Loading Buffer中含有色素Xylene Cyanol FF (0.01%) 以及Bromophenol Blue (0.01%)。 三、 主要儀器和材料試劑1、 儀器和材料 恒溫振蕩培養(yǎng)箱，高速冷凍離心機(jī)，旋渦振蕩

14、器，水浴鍋，1.5mL離心管，50mL離心管，不同型號的吸頭、微量移液槍，平板，接種環(huán)，酒精燈，量筒，微波爐，電泳儀，制膠槽，電泳槽，梳子，錐形瓶，電子天平，手套，紫外燈，Eppendorf管，記號筆等。2、 菌體 E.coli DH5受體菌，具有Ampr標(biāo)記的質(zhì)粒pUC19。試劑 LB培養(yǎng)基，抗生素（氨芐青霉素），溶液（50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-Hcl，10mmol/LEDTA），溶液（0.2mol/L NaOH,1%SDS，現(xiàn)配現(xiàn)用），溶液（5mol/LKAc 60ml,冰醋酸11.5ml，重蒸水28.5ml），RNase A母液，TE緩沖液，飽和酚，氯仿/異戊醇混

15、合液，酚/氯仿/異戊醇（PCI）混合液，預(yù)冷無水乙醇，TAE電泳緩沖液（10×），上樣緩沖液（6×），瓊脂糖，溴化乙錠(EB), DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物DNA Marker kHind，5 molL pH 52的醋酸鈉，無水乙醇。四、 實驗步驟（一） 涂布平板1、 配制2瓶LB培養(yǎng)基。2、 1瓶LB中加氨芐，另一瓶不加氨芐。分別倒平板。3、 兩個平板均分為2半，一半涂布攜帶有質(zhì)粒pUC19的E.coli菌落，另一半涂布不攜帶有質(zhì)粒pUC19的E.coli菌落。4、 37°C培養(yǎng)。（二） 細(xì)菌培養(yǎng)1、 在含有氨芐青霉素的LB平板上挑取攜帶有質(zhì)粒pUC19的E.co

16、li單菌落，接種于5ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。2、 將過夜培養(yǎng)物以2%接種量接種到50ml含有氨芐青霉素（終濃度80-100g/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37°C160r/min振蕩培養(yǎng)過夜或至對數(shù)生長晚期。（三） 質(zhì)粒DNA提取1、 取30mL菌液于50mL滅菌離心管中，4°C 6000r/min離心5min，棄去上清液，收集菌體細(xì)胞。（事先稱量50mL離心管的重量W1=14.54g）2、 將菌體沉淀懸浮于5mL用冰預(yù)冷的溶液I中，用旋渦振蕩儀混勻，7000r/min離心5min，棄去上清液，將離心管倒置，使上清液全部流盡，稱量菌

17、體質(zhì)量W2=14.67g，即得菌體濕重W=W2-W1=0.13g。3、 按濕菌體質(zhì)量：溶液I體積=100mg：1mL的比例加入用冰預(yù)冷的溶液I（約為2mL），劇烈振蕩，使細(xì)菌完全分散，將離心管置于冰上5min。4、 以2倍溶液I的體積加入新配置的溶液II（約為4mL），慢慢顛倒使之混勻（切勿劇烈震蕩?。?，將離心管置于冰上5min，此時溶液變粘稠如蛋清狀。5、 以1.5倍溶液I體積量加入用冰預(yù)冷的溶液III（約為3mL），慢慢顛倒數(shù)次，使之在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，然后將離心管置于冰上5min，此時有白色絮狀沉淀物。6、 4°C 12000r/min離心15min，將上清液（約為8

18、.5mL）轉(zhuǎn)移到另一潔凈離心管中。7、 向上清液中加入1/10體積的3mol/L KAc（約為850L），再加入2倍體積的無水乙醇（約為17mL），混勻，-20°C下靜置30min，沉淀DNA。8、 4°C 12000r/min離心15min，小心倒去上清液，將離心管倒置于紙巾上，以使所有液體流出。9、 向DNA沉淀中加入70%冰乙醇5mL，4°C 12000r/min離心5min（注意：離心管底部DNA沉淀物所在面應(yīng)與收集沉淀方向一致），去掉上清液，將離心管倒置于紙巾上，室溫干燥。10、 將DNA沉淀溶于1mL TE緩沖液中，加入RNase A（10mg/mL）

19、，終濃度為50g/mL。37°C 保溫1-2h。（四） 質(zhì)粒DNA的純化1、 將上述DNA溶液平均分裝于2個1.5mL微量離心管中，沒管為0.5mL，分別加入等體積的飽和酚，旋渦振蕩30s，12000r/min離心5min，取上層水相到另一潔凈微量離心管中。2、 加入等體積酚/氯仿/異戊醇混合液，旋渦振蕩30s，12000r/min離心5min，取上層水相到另一潔凈微量離心管中。3、 加入等體積的氯仿/異戊醇混合液，旋渦振蕩30s，12000r/min離心5min，取上層水相到另一潔凈微量離心管中。4、 加入1/10體積3mol/L KAc（pH4.6），混勻，再加入2倍體積的無水乙

20、醇，混合均勻，于-20°C下沉淀DNA 20min。5、 4°C 12000r/min離心15min，收集沉淀DNA。6、 在沉淀的DNA中，加入70%乙醇500L，4°C 12000r/min離心2min（注意：離心管底部DNA沉淀物所在面應(yīng)與收集沉淀方向一致），小心倒去上清液，將離心管倒置于紙巾上，使所有液體流出，室溫干燥。7、 重復(fù)洗滌一次，吸棄上清，37°C風(fēng)干5min。8、 用30L TE緩沖液重新溶解DNA，溫和振蕩幾秒鐘，放置-20°C下保存。（五） DNA純度檢測(凝膠電泳)1、 取40mLTAE（1×）于300mL錐

21、形瓶中，加入0.4g瓊脂糖，放入微波爐內(nèi)加熱3min使其熔化.2、 待凝膠溫度降至大約60°C(手持杯子不燙手,即感覺熱但能握得住)時,倒入準(zhǔn)備好的制膠板中，插入梳子，梳齒位置在托盤底面上的0.5-1.0mm處。3、 待膠冷卻后拔出梳子。拇指和食指輕移膠板的兩側(cè)，放入電泳槽中，倒入1×TAE緩沖液，沒過膠2-3mm,梳孔在黑線上。4、 取純化的質(zhì)粒樣品2L、上樣緩沖液1L和水2L(先加)混合，點樣于梳孔中。同時在膠上點樣合適的DNA Marker。圖1 凝膠電泳點樣順序及上樣量5、 蓋好電泳槽蓋子，選擇適當(dāng)?shù)碾妷汉头较?，開始電泳。本次實驗中梳孔連負(fù)極。6、 當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)一定

22、位置時，停止電泳，進(jìn)行EB染色，用凝膠成像儀拍照，得到實驗結(jié)果。五、 實驗結(jié)果1、涂布平板結(jié)果 圖2 含氨芐青霉素的LB平板 圖3 不含氨芐青霉素的LB平板2、圖4 DNA純度檢測 20131015超螺旋Marker11，84910，0858，0236，1335，0263，9973，0492，087超螺旋 pUC19 pUC19/ 1 2 3 4 5 6 超螺旋 7 8 10 9 11 12 Marker HindII Marker 第二組為本組實驗結(jié)果六、 實驗結(jié)果分析1、 對比涂布平板 特點含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中不含pUC19菌落含pUC19菌落不含pUC1

23、9菌落含pUC19菌落生長與否否是是是形態(tài)無未形成單菌落菌落不明顯有單克隆出現(xiàn)大小無大小大數(shù)量無多少多培養(yǎng)基顏色紅色紅色黃色微紅色菌落顏色無紅色黃色紅色2、 從樣本條帶的熒光程度來看，得到的DNA含量同第一組及第三組差不多，亮度較高。但是有不少雜質(zhì)?？赡苁窃诿看位厥諘r回收的量比較多，包含了雜質(zhì)。另外就是在除RNA和蛋白質(zhì)的步驟時，沒有操作充分。3、 以pUC19 DNA Maker為標(biāo)準(zhǔn)，遷移距離大體相同，提取的質(zhì)粒大小符合預(yù)期效果。4、 通過與DNA Maker與其他實驗組的點樣孔比較發(fā)現(xiàn)，本組實驗的點樣孔DNA有滯留現(xiàn)象（點樣孔內(nèi)有熒光），說明有蛋白質(zhì)的殘留。解決方法：采用酚、氯仿、異戊醇

24、多抽提幾次。5、 在最上端，出現(xiàn)三條明亮的條帶，為殘留的染色體DNA的片段。由于酶將他們切成大小不同的片段，所以呈現(xiàn)不止一個條帶。原因可能是加入溶液I、II、III后沒有充分混勻并使染色體DNA充分沉淀，另外在提取回收時所回收的量可能比較大，將部分雜質(zhì)也一起回收。解決措施：可再離心處理，只取上清進(jìn)行下步實驗。6、 接著往下，出現(xiàn)兩條較暗的條帶，為被酶切后改變結(jié)構(gòu)特征的質(zhì)粒DNA，可能為線狀和開環(huán)的DNA。7、 再往下最亮的一條帶為所提取的螺旋型質(zhì)粒DNA，約為2.69kb。帶的亮度與DNA的量有關(guān)，與pUC19 DNA Maker相比約為其3倍，即300ng。所以所提取的質(zhì)粒DNA濃度約為30

25、0ng/2L，即150ng/L.8、 最下端亮的部分為殘留的RNA，由于分子量小，所以遷移速度最快。原因可能是RNase A沒有將其降解完全或在加入飽和酚后取上清液時吸入了溶解在酚里的RNA。解決方法：可以再重新用RNase A降解再用飽和酚溶解一次。七、 實驗注意事項1、為獲得高純度的質(zhì)粒DNA，必須徹底去除雜蛋白、染色體DNA和RNA。在整個質(zhì)粒取過程中除去染色體DNA的關(guān)鍵步驟是加入溶液、溶液的變性和復(fù)性環(huán)節(jié)，應(yīng)控制好變性和復(fù)性的時機(jī)。加入溶液工時，可劇烈振蕩，使菌體沉淀轉(zhuǎn)變成均勻的菌懸液，此時細(xì)胞尚未破裂，染色體不會斷裂；加入溶液時，菌液變黏稠、透明，無菌塊殘留；加入溶液時，會立即出現(xiàn)

26、白色沉淀。加入溶液和溶液后，應(yīng)緩慢上下顛倒離心管數(shù)次，切忌在旋渦振蕩器上劇烈振蕩，否則，染色體DNA會斷裂成小片段，不形成沉淀，而溶解在溶液中，與質(zhì)粒DNA混合在一起，不利于質(zhì)粒DNA提純。因此，操作時一定要緩慢柔和，采用上下顛倒的方法，既要使試劑與染色體DNA充分作用，又不破壞染色體的結(jié)構(gòu)。 2、質(zhì)粒DNA中蛋白質(zhì)的去除通常采用酚、氯仿抽提。采用酚氯仿去除蛋白效果較單獨用酚或氯仿好，但需要抽提多次。切記，質(zhì)粒DNA溶解在上層的水相中。 3、酚具有腐蝕性，能損傷皮膚和衣物，使用時應(yīng)小心。皮膚如不小心沾到酚，應(yīng)立即用堿性溶液、肥皂或大量清水沖洗。另外我們所使用的飽和苯酚溶液位于下層，吸取時應(yīng)注意。 4、沉淀DNA通常使用預(yù)冷無水乙醇，在低溫條件下長時間放置可使DNA沉淀完全。除用乙醇沉淀DNA外，還可使用06倍體積的異丙醇，但異丙醇也能將鹽等雜質(zhì)沉淀，所以沉淀需要在常溫下進(jìn)行，并且時間不宜太長(限20 min內(nèi))。沉淀離心后，需用70乙醇洗滌，以除去鹽類及揮發(fā)性較小的異丙醇。 5、電泳時最好使用新的電泳緩沖液，以免影響電泳效果。如下一步實驗要求較高，則應(yīng)盡量使用TAE電泳緩沖液，并且，配制瓊脂糖凝膠的電泳緩沖液應(yīng)與電泳時使用的緩