mRNA及蛋白質(zhì)的檢測(cè)分析技術(shù)

1、mRNA及蛋白質(zhì)的檢測(cè)分析技術(shù)    mRNA及蛋白質(zhì)的檢測(cè)分析技術(shù)移植腎損傷的分子病理學(xué)研究已經(jīng)超出局部病理變化的范疇,正在向局部分子改變和組織學(xué)改變相結(jié)合、代寫碩士論文局部分子改變與體液分子改變及血細(xì)胞分子改變相結(jié)合的多元化分子研究發(fā)展1。目前研究分子病理的常用方法普遍適用于移植腎損傷的分子病理學(xué)研究。  1.DNA檢測(cè)分析技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,使人們對(duì)移植免疫等方面參與移植腎損傷的分子的核苷酸堿基序列的了解越來(lái)越清楚。體外基因擴(kuò)增技術(shù)PCR方法的創(chuàng)立及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用,使得從DNA水平研究移植腎損傷成為可能,并已在臨床器官移植研究

2、中實(shí)際應(yīng)用。檢測(cè)DNA的方法多種多樣,根據(jù)不同的用途各有其特點(diǎn)。目前常用的可大致歸納為如下幾大類型2。1.1Southern印跡法(Southern blot)將一定量的DNA樣品用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割成不同長(zhǎng)度的DNA片段,然后在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離,如加樣量相等,酶解適當(dāng),則在用溴化乙錠染色時(shí),應(yīng)顯示長(zhǎng)度及亮度均相等的DNA拖帶。用于檢測(cè)DNA的已知探針,一般由帶有該片段的細(xì)菌質(zhì)粒中制備。純化的探針DNA一般用放射性同位素32P或生物素、地高辛配基等標(biāo)記。雜交前探針必須加溫至100變性處理。雜交后的膜在暗盒中進(jìn)行放射自顯影后,即在一定的位置顯示同標(biāo)記探針特異地結(jié)合的陽(yáng)性DNA條帶。S

3、outhern雜交法可檢測(cè)基因的存在及其擴(kuò)增,也可檢測(cè)基因的雜合性丟失。1.2聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)PCR是一種由特定寡核苷酸引物(primer)介導(dǎo)的特異基因或克隆序列的體外酶促擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)。該方法一改傳統(tǒng)分子克隆技術(shù)的模式,不通過(guò)活細(xì)胞,操作簡(jiǎn)便,可以將數(shù)量很少的原始模板DNA分子進(jìn)行幾何級(jí)數(shù)的倍增,擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測(cè)鑒定,能最大程度地滿足科學(xué)家操作DNA的要求。因此,在其問(wèn)世后的十多年里,PCR技術(shù)得到了迅速發(fā)展。在經(jīng)典PCR基礎(chǔ)上發(fā)展了RT-PCR,

4、以RNA為模板,首先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后進(jìn)行正常PCR循環(huán)擴(kuò)增。近年來(lái),PCR技術(shù)得到進(jìn)一步發(fā)展,并建立了一系列PCR擴(kuò)增新技術(shù),如反向-PCR、錨定-PCR、原位-PCR、巢式-PCR、重組-PCR、定量-PCR等。據(jù)此,在移植腎損傷的分子機(jī)制研究中,利用很少的活檢組織細(xì)胞或體液,在獲取少量模板DNA的情況下,即可應(yīng)用PCR技術(shù)研究待測(cè)基因的表達(dá)。1.3聚合酶鏈反應(yīng)寡核苷酸探針雜交方法(PCR with seqequence-specific oligonucleotide probe, PCR-SSO)PCR-SSO主要技術(shù)包括提取模板DNA,以位點(diǎn)間或組間特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其產(chǎn)物

5、轉(zhuǎn)移到NC膜上。再與數(shù)十個(gè)寡核苷酸特異性探針雜交,從而分辨出等位基因的特異性。近年來(lái),PCR-SSO的方法學(xué)研究有許多改進(jìn),標(biāo)記探針亦多種多樣。歸納起來(lái)可分兩大類:放射性標(biāo)記,主要是32P標(biāo)記;非放射性標(biāo)記,常見(jiàn)的有酶類、地高辛、生物素、熒光素或化學(xué)發(fā)光劑等,采用PCR-SSO從DNA水平研究移植腎損傷機(jī)制已經(jīng)廣泛應(yīng)用。1.4聚合酶鏈反應(yīng)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR with signgle strand conformation polymorphism, PCR-SSCP)PCR-SSCP系Drita等1989年首先提出,其原理可概括為:在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí),單鏈DNA因

6、堿基序列不同所形成的構(gòu)象不同。通過(guò)PCR擴(kuò)增包括發(fā)生單個(gè)堿基置換部位及兩側(cè)DNA片段,變性后進(jìn)行SSCP分析,從理論上講可分辨出單個(gè)堿基的改變,有效地檢出點(diǎn)突變和DNA的多態(tài)性,并且已經(jīng)用于腎移植術(shù)后排斥反應(yīng)的分子病理研究3。1.5順序特異引物聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR with sequence-specific primers, PCR-SSP)PCR-SSP方法的基本原理是根據(jù)待測(cè)基因的核苷酸序列,設(shè)計(jì)出一系列針對(duì)各亞型的順序特異引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增各等位基因的型別特異性DNA片段;擴(kuò)增產(chǎn)物僅需借助常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳,即可根據(jù)是否存在特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶直接進(jìn)行基因檢測(cè)。1.6原位聚

7、合酶鏈反應(yīng)(in situ PCR)利用PCR技術(shù),不僅可以在聚丙烯管中對(duì)含有多種模板的材料進(jìn)行PCR,也可以在病理切片或細(xì)胞顯微波片上對(duì)標(biāo)本進(jìn)行待測(cè)基因的DNA原位擴(kuò)增,可稱為玻片PCR(Slide-PCR)。其特點(diǎn)是不經(jīng)過(guò)模板提取過(guò)程,在組織或細(xì)胞原位進(jìn)行PCR擴(kuò)增,要求在具備原位PCR擴(kuò)增條件的PCR儀和原位擴(kuò)增系統(tǒng)中進(jìn)行,擴(kuò)增物可作原位雜交顯示,可以結(jié)合病理組織學(xué)分析,判定病理改變與某個(gè)或某些基因的關(guān)系。  2.mRNA檢測(cè)分析技術(shù)2.1原位雜交技術(shù)原位雜交(in situ hybridization, ISH)是應(yīng)用已知堿基順序并帶有標(biāo)記物的核酸探針與組織、細(xì)胞中待測(cè)的核酸

8、按堿基配對(duì)的原則進(jìn)行特異結(jié)合,形成雜交體,然后再應(yīng)用與標(biāo)記物相應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng),通過(guò)組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法,在核酸原有的位置進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。是研究單一細(xì)胞中編碼各種蛋白質(zhì)、多肽的相應(yīng)mRNA的定位的手段,是從分子水平研究細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)及其調(diào)控的有效工具。適用于腎移植后不同病理?yè)p傷的mRNA表達(dá)的研究及檢測(cè),具有定位準(zhǔn)確,病理分析與分子改變同步顯示的功能。22Northern印跡法Northern印跡(Northern blot)原理與Southern blot基本相同。所不同處在于,RNA遠(yuǎn)不如DNA穩(wěn)定,很容易被RNA酶降解,而RNA酶不僅廣泛存在,而且加熱至100也不能使其滅活,所以在操作

9、RNA時(shí)所用的一切器皿和溶液都必需經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的消除RNA酶的處理。Northern印跡主要應(yīng)用于檢測(cè)相關(guān)基因的過(guò)度表達(dá),也可檢測(cè)基因的低表達(dá)或不表達(dá)。2.3RT-PCR技術(shù)(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)RT-PCR已經(jīng)成為研究器官、組織或細(xì)胞中mRNA轉(zhuǎn)錄本出現(xiàn)、結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平的基本方法。RT-PCR的基本步驟包括:提取樣品mRNA合成一個(gè)cDNA拷貝,接著擴(kuò)增感興趣的基因。通常因兩個(gè)步驟中使用的反應(yīng)緩沖液不能兼容,所以這兩個(gè)步驟(RT和PCR)分別進(jìn)行。最近一種全新試劑盒,使RT-PCR可以通過(guò)一步法完成更加快

10、速有效,而在兩步法實(shí)驗(yàn)中可以獲得更高的靈敏度。  3.蛋白質(zhì)檢測(cè)分析技術(shù)DNA是生物信息的提供者,而蛋白質(zhì)在細(xì)胞中完成了所有的工作。特定DNA序列的存在并不能保證與之相應(yīng)的蛋白的合成。DNA序        列并不足以描述蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和在細(xì)胞中的位置。實(shí)際上,蛋白激活的信號(hào)途徑可以立即引起一個(gè)細(xì)胞的遷移、死亡或開(kāi)始分裂,而此時(shí)可能DNA/RNA基因表達(dá)等還沒(méi)開(kāi)始發(fā)生變化。因此,推動(dòng)移植腎損傷的分子病理學(xué)研究技術(shù)應(yīng)來(lái)自于蛋白分析的方法。3.1免疫組織化學(xué)方法(immunohistochemistry)隨

11、著免疫學(xué)的理論和技術(shù)的發(fā)展,基于免疫學(xué)的核心抗原抗體結(jié)合這一原理,免疫組織化學(xué)技術(shù)從組織細(xì)胞水平進(jìn)行抗原抗體反應(yīng),使免疫學(xué)技術(shù)與病理形態(tài)學(xué)有機(jī)結(jié)合。免疫組化的優(yōu)點(diǎn)為:(1)特異性強(qiáng):由于免疫學(xué)的基本原理是抗原與抗體的“一對(duì)一”的特異結(jié)合,因此,免疫組織化學(xué)從理論上講也是“一對(duì)一”的組織細(xì)胞中抗原的特定顯示,只是當(dāng)組織細(xì)胞中存在交叉抗原時(shí)才會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。(2)敏感性高:現(xiàn)在由于ABC法或SP法的出現(xiàn),使抗體稀釋成千上萬(wàn)倍仍可在組織細(xì)胞中與抗原結(jié)合,這樣高敏感性的抗體抗原反應(yīng),使免疫組織化學(xué)的方法越來(lái)越方便地用于常規(guī)診斷工作中。(3)定位準(zhǔn)確、形態(tài)與功能相結(jié)合,可在組織和細(xì)胞中進(jìn)行抗原的準(zhǔn)確定位

12、,可以進(jìn)行形態(tài)與功能相結(jié)合的研究,對(duì)病理學(xué)研究的深入十分有意義。免疫組織化學(xué)方法是病理學(xué)研究中最早引入的分子生物學(xué)技術(shù),已經(jīng)在移植腎排斥反應(yīng)的分子診斷中得到廣泛應(yīng)用,為探索移植免疫病理改變和病變局部參與免疫排斥相關(guān)分子表達(dá)的研究以及在慢性移植腎病腎損傷中的分子表達(dá)的研究作出重要貢獻(xiàn)2,3。3.2蛋白印跡(Western blot)方法是將用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,在其上進(jìn)行抗原抗體反應(yīng),檢測(cè)出目的成分。以此確定目的蛋白的存在與否,并可以看出表達(dá)量的差異,據(jù)此研究所關(guān)心的目的基因的表達(dá)情況。用于檢測(cè)由基因擴(kuò)增所致的產(chǎn)物過(guò)表達(dá),不僅能檢出蛋白質(zhì)量的變化,而且能獲取更多

13、的生物學(xué)信息。  4.生物芯片技術(shù)生物芯片是近10年在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高新技術(shù)。它主要是指通過(guò)微加工和微電子技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建微型生物化學(xué)分析系統(tǒng),以實(shí)現(xiàn)對(duì)生命機(jī)體的組織、細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸、糖類以及其他生物組分進(jìn)行準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。目前常見(jiàn)的生物芯片分為三大類:即基因芯片(Gene chip,DNA chip,DNAmicroarray)、蛋白芯片(Protein chip)、芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab on a chip)等。生物芯片主要特點(diǎn)是高通量、微型化和自動(dòng)化。生物芯片上高度集成的成千上萬(wàn)密集排列的分子微陣列,能夠在很短時(shí)間內(nèi)分析大量的生物分子,使人們

14、能夠快速準(zhǔn)確地獲取樣品中的生物信息,檢測(cè)效率是傳統(tǒng)檢測(cè)手段的成百上千倍5。生物芯片技術(shù)將改變生命科學(xué)的研究方式,革新醫(yī)學(xué)診斷和治療,極大地提高人口素質(zhì)和健康水平。生物芯片在疾病檢測(cè)診斷方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),它可以在一張芯片上同時(shí)對(duì)多個(gè)病人進(jìn)行多種疾病的檢測(cè)。僅用極小量的樣品,在極短時(shí)間內(nèi),向醫(yī)務(wù)人員提供大量的疾病診斷信息,這些信息有助于醫(yī)生在短時(shí)間內(nèi)找到正確的治療措施。生物芯片技術(shù)的深入研究和廣泛應(yīng)用,將對(duì)移植免疫的分子病理研究產(chǎn)生極其深遠(yuǎn)的影響1,6。采用高通量生物芯片技術(shù)可以充分反映移植組織遭受急性排斥反應(yīng)攻擊時(shí)的基因表達(dá)以及蛋白質(zhì)的差異表達(dá)。對(duì)急性排斥反應(yīng)時(shí)細(xì)胞毒性T細(xì)胞效應(yīng)分子如:INF

15、刺激生長(zhǎng)因子-3(interferon-stimulated growth factor-3)、補(bǔ)體因子3、煙堿-甲基轉(zhuǎn)移酶(nicotinamide N-methyltransferase)、巨噬細(xì)胞趨化蛋白3、以及骨髓由來(lái)的不同蛋白、CD18等多種因子基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。因?yàn)檫@種方法不僅局限于原有的已知的幾個(gè)與AR有關(guān)的基因,很可能在排斥反應(yīng)發(fā)生機(jī)制和診斷方面,提高對(duì)參與排斥反應(yīng)基因表達(dá)和更多生物學(xué)信息的研究,籍此發(fā)現(xiàn)新的生物學(xué)標(biāo)志物7,為今后早期診斷排斥反應(yīng)和制定治療方案提供幫助。  5.激光捕獲顯微分離技術(shù)(Laser capture microdissection-LCM)在進(jìn)行移植腎損傷的分子病理學(xué)研究中,解決不同組織干擾問(wèn)題需要新技術(shù)的支持,顯微分離技術(shù)可以來(lái)協(xié)助克服這一問(wèn)題。由于激光捕獲顯微分離技術(shù)(Laser capture micro-dissection, LCM)可