軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合脂肪源性干細(xì)胞構(gòu)建軟骨組織的實驗研究

1、軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合脂肪源性干細(xì)胞構(gòu)建軟骨組織的實驗研究    【摘要】  目的探討軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料的制備,及其體外復(fù)合脂肪源性干細(xì)胞構(gòu)建軟骨組織的技術(shù)方法。方法成年新西蘭大白兔脂肪源性干細(xì)胞獲得，培養(yǎng)，擴增。成年新西蘭大白兔新鮮軟骨，低溫凍干12 h，后經(jīng)曲拉通、DNA、RNA酶等處理制備成為軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料，終濃度為2×107/L的脂肪干細(xì)胞種植于軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)中于軟骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，構(gòu)建軟骨組織。新鮮制備的軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)及構(gòu)建的軟骨組織分別行組織學(xué)、免疫組織化學(xué)及透射電鏡檢測。結(jié)果實驗

2、制備的軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料內(nèi)無細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在，僅殘留空白軟骨陷窩。具有合適的孔隙率和孔徑大小;復(fù)合脂肪源性干細(xì)胞后細(xì)胞向材料內(nèi)部遷移，粘附，生長良好。部分載體內(nèi)細(xì)胞型膠原免疫組化染色陽性。結(jié)論軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)可作為支架材料應(yīng)用于軟骨組織工程，復(fù)合脂肪源性干細(xì)胞培養(yǎng)可成功構(gòu)建軟骨組織?！娟P(guān)鍵詞】  軟骨組織; 脫細(xì)胞基質(zhì); 脂肪源性干細(xì)胞Abstract：ObjectiveTo investigate the methods of preparing acellular cartilagi

3、nous matrix(ACM) and constructing the tissue engineered cartilage with adiposederived stem cells (ADSCs)seeded acellular cartilaginous matrix in vitro.MethodThe ADSCs were isolated from adul

4、t New Zealand albino rabbits by collagenase,cultured and amplified in vitro.Fresh cartilage isolated from adult New Zealand albino rabbits were freezedried for twelve hours and

5、0;then treated with Triton X100,Dnase and RNase so as to obtain the ACM.After sterilized with ultraviolet,the ADSCs were seeded in the acellular cartilaginous matrix at a 

6、;final density of 2×107/L and cultured in chondrogenic differentiation medium for two weeks in order to construct tissue engineered cartilage.Histology,immunohistochemistry and transmission&

7、#160;electron microscope (TEM) were applied to examine the fresh ACM and tissue engineered cartilage.ResultThe test of hematoxylineosin (HE) staining and TEM showed no cellular str

8、ucture in the ACM with only recesses left by removed cells.The ACM had suitable interval porosity and aperture size.After integrated with ADSCs,cells migrated into the ACM

9、0;and adhered to the surface of material and grew well.After cultured in chondrogenic differentiation medium for two weeks,immunohistochemical staining of type  collagen showed par

10、t of the cells in the material had enhanced expression of type  collagen.ConclusionACM can be used as scaffold material in cartilage tissue engineering. If it was se

11、eded with ADSCs and cultured in chondrogenic differentiation medium,ACM can be used to construct cartilage tissue successfully.Key words：cartilage tissue; acellular matrix; adiposedrived ste

12、m cells關(guān)節(jié)軟骨因損傷或退行性病變引起缺損后，自身修復(fù)能力十分有限。近年來，軟骨組織工程的迅速發(fā)展，為解決這個難題提供了新的途徑13。而尋找一種合適的軟骨細(xì)胞載體則是當(dāng)前軟骨組織工程研究的焦點之一。脫細(xì)胞基質(zhì)是近幾年發(fā)展起來的天然支架材料，因其去除了組織中的抗原性成分，故具有良好生物相容性，在組織工程中應(yīng)用廣泛4。2001年Zuk PA等5從人和大鼠的脂肪組織中發(fā)現(xiàn)了具有自我更新能力，活力持久及多向分化潛能的細(xì)胞并命名為脂肪源性干細(xì)胞。2003年Gimble J、Guilak F6又在不同誘導(dǎo)方案下誘導(dǎo)脂肪源性干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、

13、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等分化進(jìn)一步證實其干細(xì)胞的特性。本實驗采用軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合脂肪干細(xì)胞的方法體外構(gòu)建組織工程軟骨，探討軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)作為軟骨組織工程支架材料的可能性。1 材料與方法1.1 材料1.2 方法2 結(jié) 果2.1 組織學(xué)HE染色觀察實驗制備的軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)基本無細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在，僅大量軟骨陷窩，鏡下觀察見空白區(qū)域。軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合脂肪干細(xì)胞于軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后，HE染色結(jié)果示：陰性對照A組，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化B、C組，材料表面附著多層細(xì)胞，材料內(nèi)部大部分陷窩內(nèi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在(圖1)，組間無明顯差別。2.2&#

14、160;型膠原免疫組織化學(xué)染色觀察軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合脂肪干細(xì)胞于軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后，型膠原免疫組織化學(xué)染色觀察見：陰性對照A組，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化B、C組，材料內(nèi)部大部分陷窩內(nèi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在，但型膠原免疫組化檢查見陰性對照A組材料內(nèi)部細(xì)胞染色陰性(圖2);誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化B、C組材料內(nèi)部部分細(xì)胞及陷窩周圍呈陽性，尤以接近材料表面細(xì)胞染色明顯(圖3)。但與新鮮軟骨型膠原免疫組化染色比較尚有一定差別。2.3 透射電子顯微鏡觀察透射電鏡觀察新鮮軟骨組織可見軟骨細(xì)胞充分填滿于軟骨陷窩內(nèi)，與周圍細(xì)胞外基質(zhì)連接緊密。新鮮制備軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)軟骨陷窩內(nèi)軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分消失，無或少量殘留均勻顆粒狀物質(zhì)。

15、陰性對照A組，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化B、C組材料內(nèi)部大部分陷窩內(nèi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在，且有大量均勻顆粒狀細(xì)胞分泌基質(zhì)成分存在，且誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化B、C組此物質(zhì)明顯高于陰性對照組(圖4)?？瞻讓φ誅組觀察結(jié)果與新鮮制備軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)相似，軟骨陷窩內(nèi)無細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在。圖1 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化B組培養(yǎng)2周后HE染色：材料表面及內(nèi)部陷窩內(nèi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在(×100) 圖2 陰性對照A組培養(yǎng)2周后型膠原免疫組化染色：材料內(nèi)部細(xì)胞染色陰性(×100) 圖3 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化C組培養(yǎng)2周后型膠原免疫組化染色：材料內(nèi)部細(xì)胞及陷窩周圍染色陽性(×100) 圖4 

16、誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化B組透射電鏡觀察：陷窩內(nèi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在，且有大量均勻顆粒狀細(xì)胞分泌基質(zhì)成分存在3 討 論3.1 本實驗制備軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)時在蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)作用下采用化學(xué)除垢劑曲拉通(TritonX 100)裂解細(xì)胞及核糖核酸酶(ribonuclease Rnase)、脫氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease Dnase)消化法獲得。在曲拉通破壞細(xì)胞膜裂解軟骨細(xì)胞同時蛋白酶抑制劑保護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)免受細(xì)胞內(nèi)釋放酶的破壞,從而最大程度的保

17、留原細(xì)胞外組成成分-型膠原和葡萄糖胺聚糖及其結(jié)構(gòu);Rnase、Dnase有效去除細(xì)胞內(nèi)釋放RNA、DNA后，最大程度的降低材料的抗原型為組織工程細(xì)胞復(fù)合材料及體內(nèi)實驗提供基礎(chǔ)。3.2 現(xiàn)在大部分研究學(xué)者多采用干細(xì)胞轉(zhuǎn)化后種植于載體材料之上構(gòu)建組織工程軟骨。實驗早期作者已使用以上方法，但發(fā)現(xiàn)存在轉(zhuǎn)化后細(xì)胞形成軟骨結(jié)節(jié)，不易進(jìn)行分離，且分離后細(xì)胞活性下降，很快因為未轉(zhuǎn)化脂肪干細(xì)胞的優(yōu)勢生長抑制作用而出現(xiàn)轉(zhuǎn)化后軟骨細(xì)胞的增殖能力下降，乃至凋亡，加之種植于載體后細(xì)胞外環(huán)境的劇烈改變，過程的繁瑣增加了污染的幾率等諸多原因，效果很不理想。在作者將脂肪干細(xì)胞復(fù)合于軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)后，再行軟骨方向誘導(dǎo)

18、分化，通過細(xì)胞因子及材料組成成分型膠原和GAG的協(xié)同誘導(dǎo)作用，使脂肪干細(xì)胞成功向軟骨細(xì)胞方向分化，使細(xì)胞有較高的型膠原表達(dá)、分泌，取得了較理想的結(jié)果。3.3 在實驗結(jié)果鑒定方面選用透射電鏡進(jìn)行結(jié)果觀察，在以HE染色及免疫組化充分說明細(xì)胞向材料內(nèi)部遷徙、黏附、增殖，并向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化后，采用透射電鏡對實驗制備的組織工程軟骨進(jìn)行掃描，從微觀上觀察細(xì)胞在材料陷窩內(nèi)部分布特點及基質(zhì)分泌情況，這更加充分的、全面的闡述、分析了實驗結(jié)果。3.4 作者在實驗中亦發(fā)現(xiàn)了一些問題：雖然結(jié)果顯示誘導(dǎo)分化方法誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后細(xì)胞有較高的型膠原酶水平，但較成體成熟軟骨細(xì)胞比較還有一定差距，說明目前誘導(dǎo)方案尚

19、不夠完善。如能在三維立體條件下、低氧等環(huán)境下型膠原酶表達(dá)水平將會更高7。且構(gòu)建組織工程軟骨時出現(xiàn)分化水平較高這只限于接近材料表面部分，材料內(nèi)部細(xì)胞分化效果差，這可能是靜態(tài)培養(yǎng)條件下，材料內(nèi)部細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)交換較差所致。隨著三維培養(yǎng)技術(shù)的不斷完善，對各種細(xì)胞因子和生長因子之間的相互作用的更深入了解和轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)條件的逐漸成熟，加之材料學(xué)在材料改性、重建方面的高速發(fā)展，相信脂肪干細(xì)胞和軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)這兩個組織工程的新生力量必定會茁壯成長?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Karlsson C,Brantsing C,Svensson T.Differenti

20、ation of human mesenchymal stem cells and articular chondrocytes: analysis of chondrogenic potential and expression pattern of differentiationrelated transcription factorsJ.J Orthop Res,2007,2:152-163.2 Redman SN,Oldfield SF,Archer CW.Current strategies for articular cartilage repairJ.European Cells and Materials,2005,9:1473-1482.3 李 磊，張海寧，孔慶