乳酸菌發(fā)酵劑凍干保護(hù)劑篩選及應(yīng)用的研究

1、第29卷第4期1998年12月東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)JournalofNortheastAgriculturalUniversity29(4):371379December1998乳酸菌發(fā)酵劑凍干保護(hù)劑篩選及應(yīng)用的研究()、山梨醇、甘油、側(cè)金盞花醇等13種材料對(duì)乳酸菌的凍干,海藻糖,側(cè)金盞花醇為最佳保護(hù)劑,其次為蔗糖、麥芽糊精、山梨醇、谷氨酸鈉、脫脂奶粉,在以水和增菌液為基質(zhì)中凍干保護(hù)效果顯著,對(duì)乳球菌的保護(hù)效果優(yōu)于乳桿菌。凍干菌物菌落總數(shù)與菌體產(chǎn)酸力有一定關(guān)系,但與乳糖酶關(guān)系不明確,凍干后的菌體表面呈腦回樣皺褶,但形態(tài)變化不大。并設(shè)計(jì)了最佳凍干保護(hù)劑配方。關(guān)鍵詞乳酸菌,凍干保護(hù)劑,篩選中圖分類(lèi)號(hào)S

2、939.117的凍干保護(hù)劑。0前言1材料與方法冷凍保藏與凍干技術(shù)是生物學(xué)的一個(gè)重要應(yīng)用技術(shù),近年來(lái)這一技術(shù)因“功能性(FunctionFood)的快速發(fā)展而被用食品”于食品生產(chǎn)中,此外,商品化乳酸菌發(fā)酵劑的制備也常用此技術(shù)。然而,欲獲得理想的冷凍及凍干效果,除工藝外,主要是篩選與使用適宜的凍干保護(hù)劑(Cryoprotect-1ants),目前,有關(guān)凍干保護(hù)劑的研究主要集中于醫(yī)學(xué),生物學(xué)領(lǐng)域,是冷凍生物學(xué)分支的主要內(nèi)容之一。但是,用于生產(chǎn)發(fā)酵劑的凍干保護(hù)劑的研究大多屬于專(zhuān)利資料,而且,許多研究的報(bào)告結(jié)果差異很大。本試驗(yàn)利用現(xiàn)有條件,以蔗糖、海藻糖、側(cè)金盞花醇等糖、醇、氨基酸、鹽類(lèi)對(duì)乳酸菌的凍干保

3、護(hù)效果進(jìn)行了比較研究,從而篩選良好收稿日期:1998-03-131.1材料1.1.1懸浮基質(zhì)生理鹽水、CMR增菌液、無(wú)脂乳固體量(NFS)為11%的脫脂復(fù)原乳,經(jīng)105滅菌20min。1.1.2供試菌種ST-1(嗜熱鏈球菌),LB-1(保加利亞乳桿菌),LA-1(嗜酸乳桿菌),SL(乳鏈球菌)。上述菌種均為本室收藏。1.1.3凍干保護(hù)劑蔗糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糊精、山梨醇、甘露醇、甘油、三聚磷酸鈉、焦磷酸鈉、偏磷酸鈉、-磷酸甘油二鈉、谷氨酸鈉、右旋糖苷,側(cè)金盞花醇等均為分析純?cè)噭┗蛏噭?谷氨酸鈉為食品級(jí),含量為99%。1.1.4真空冷凍干燥機(jī)ALPHI-5型,德國(guó)造。372東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)

4、第29卷1.1.5菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)基CMR。(配方:蛋0.3%聚乙烯醇縮甲醛氯仿溶液的網(wǎng)吸咐5min,在室溫下干燥,再用2%的磷鎢酸(pH6.8)負(fù)染色1.52.0min,干后在電鏡白胨5g,酵母浸膏5g,葡萄糖10g,乳糖10g,乙酸鈉2g,硫酸錳0.25g,硫酸鎂0.25g,吐溫-801g,乳蛋白水解物5g,-磷酸甘油二鈉5g,蒸餾水1000mL,瓊下觀察。B.掃描電鏡觀察:將樣品用雙面膠帶脂(20g)。1.1.6真空封口器與真空泵:本所自備。1.2方法1.2.1貼于掃描電鏡樣品臺(tái)上,放入B-5型離子濺射儀中,150t)KyKy-1。,0.5mLh2結(jié)果與討論2.1冷凍保護(hù)劑(單因素多水平)篩

5、選試。凍干56h后逐漸升高加熱板溫度至15,以排出剩余的水分,使凍干制品的水分含量為1.50%2.50%,然后用于測(cè)定菌落總數(shù),水分活度,驗(yàn)415將供試菌株ST-1在CMR增菌液中培養(yǎng)24h,離心(3000rmin-1×5min),棄上清,生理鹽水洗二次后,加入滅菌的CMR培養(yǎng)基25mL,使其最后的菌落數(shù)為3.5×109mL-1,然后,分裝為25份菌液,掃描和透射電鏡觀察菌體。1.2.2菌落總數(shù)測(cè)定按國(guó)標(biāo)GB4789.2-842方法測(cè)定,稀釋液為滅菌生理鹽水。于37下,CO2濃度為10%,培養(yǎng)72h。1.2.3水分活度測(cè)定將凍干物料加于測(cè)每份菌液加入二倍濃度的保護(hù)劑溶液,充

6、分混勻,置于冰柜冷凍及冷凍真空干燥。其菌落計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。從表1發(fā)現(xiàn):海藻糖對(duì)ST-1的冷凍保護(hù)作用與側(cè)金盞花醇的保護(hù)作用相近,為最佳保護(hù)劑,但因這兩種材料均是十分昂貴的糖、醇類(lèi),無(wú)法應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)之中。保護(hù)作用較好的蔗糖、乳糖、麥芽糊精、山梨醇、甘油、谷氨酸鈉均可用于生產(chǎn)乳酸菌發(fā)酵劑。這一結(jié)果與國(guó)外許多學(xué)者的研究相近,然而測(cè)定值卻低于國(guó)外的有關(guān)報(bào)導(dǎo)數(shù)值,究其原因,可能是菌懸液的凍結(jié)速度慢,凍結(jié)溫度低有關(guān)。從水分活度值可見(jiàn),海藻糖與蔗糖的值較低,說(shuō)明兩種糖水化能力強(qiáng),與細(xì)胞膜表面易形成較穩(wěn)定水化保護(hù)層,使水分凍結(jié)時(shí)形成小的冰晶,提高其凍干保護(hù)效果,這一測(cè)值與凍干保護(hù)的試驗(yàn)結(jié)果相吻合。定平皿內(nèi)按

7、上述工藝凍干后,采用Nova-sina水分活度測(cè)定儀測(cè)定。1.2.4菌種活力測(cè)定通過(guò)測(cè)定菌種產(chǎn)酸力來(lái)評(píng)價(jià)菌種的活力。酸度測(cè)定按GB5409-89方法測(cè)定,每一凍干管中加入5mL2滅菌脫脂復(fù)原乳(NFS為11%)于37培養(yǎng)5.50h后測(cè)定滴定酸度0T。乳糖酶活力測(cè)定:參照潘道東論文3,加入1mL緩沖液,溶解出菌粉,離心6000rmin-110min取上清0.5mL加入ONPG3mL,混勻,于37水浴中反應(yīng)15min,再加入3mL1MNa2CO3中止反應(yīng),在420nm處測(cè)定吸光度值。1.2.5凍干菌物電鏡觀察A.透射電鏡觀察凍干菌體:挑取凍干菌物,用過(guò)濾除菌的蒸餾水浸溶,用涂有第4期呂加平等:乳酸

8、菌發(fā)酵劑凍干保護(hù)劑篩選及應(yīng)用的研究373表1凍干保護(hù)劑的篩選試驗(yàn)結(jié)果Table1Screeningtestofcryoprotectantforlacticacidbacteria(ST-1)凍干保護(hù)劑Cryoprotectants凍干前菌數(shù)凍干后菌數(shù)濃度(W W)-1-1cfumLcfumLConcentrationTotalviableTotalviableofcountsbeforecountsaftercryoprotectantsFreeze-dryingFreeze-drying5%10%5%5%10%20%5%10%20%5%555%5%5%3.5×1093.59593

9、.5×1093.5×1093.5×1093.5×1093.5×1093.5×1093.5×1093.5×1093.5×1093.5×1093.5×1092.2×10×1091.87×1091.86×1092.1×1091.42×1091.93×1092.36×1092.35×1091.89×1091.23×1091.56×1091.36×10

10、9存活率水分活度(%)AwSurvivalWaterrateActivity(%).42.8551.0053.0053.160.0040.5755.1467.4367.1454.0035.1444.5738.860.4620.4270.423海藻糖(Trehalose)乳糖(Lactose)0.45(se)麥芽糊精(Maltodextrin)側(cè)金盞花醇(Adonitol)山梨醇(Sorbitol)甘露醇(Mannitol)甘油(Glycerin)三聚磷酸鈉(Sodiumtripolyphosphate)焦磷酸鈉(Sodinmpyrophosphate)5%3.5×1091.29

11、15;10936.86偏磷酸鈉(Sodiunmetaphosphate)-磷酸甘油二鈉(Sodium-glycerophosphate)5%3.5×1091.15×10932.855%5%5%5%3.5×1093.5×1093.5×1093.5×1093.5×1091.87×1091.24×1091.95×1091.68×1094.28×10854.4335.4355.714812.23右旋糖苷(Dertran)谷氨酸鈉(Glutamate-Na)精氨酸(Arginine)增

12、菌液(Multiplebroth)生理鹽水(Salinesolation)3.5×1097.52×1070.22374東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)第29卷表2不同懸浮基質(zhì)保護(hù)效果的比較(試驗(yàn)菌為ST-1)(cfumL-1)Table2Comparisonofcryoprotectionindifferentsuspensionmedium保護(hù)劑(Cryoprotectant)懸浮基質(zhì)Suspensionmedium生理鹽水(Saline)3.25×1061.87×106×1061.×1061.43×1061.20×104增菌液

13、(CMRbroth)6.40×1063.×1063.63.40×1062.64×1064.60×105脫脂復(fù)原乳(NFS11%)(Skimmilk)7.80×1072074.10×1073.60×1073.12×1072.00×107海藻糖(10%)(Trehalose)蔗糖(10%)(Sucrose)麥芽糊精(10%)(Maltodextrin)(l)(10%)(Glutamate-Na)空白對(duì)照(Controlgroup)表3保護(hù)劑對(duì)不同乳酸菌的保護(hù)作用(cfumL-1)Table3Thee

14、ffectofcryoprotectantsonvariouslacticacidbacteria冷凍保護(hù)劑Cryoprotectants未凍干前菌落數(shù)(Totalcfuofundryedsample)海藻糖(10%)(Trehalose)麥芽糊精(10%)(Maltodextrin)山梨醇(10%)(Sorbitol)蔗糖(10%)(Sucrose)谷氨酸鈉(5%)(Glutamate-Na)側(cè)金盞花醇(5%)(Adonitol)脫脂復(fù)原乳(NFS12%)(Skimmilk)乳酸菌(Lacticacidbacteria)ST-18.60×1088.10×108(94.2%

15、)7.30×108(84.9%)6.70×108(77.9%)7.20×108(83.72%)6.40×108(74.4%)7.90×108(91.8%)4.60×108(53.48%)LB-11.23×1089.80×107(79.67%)7.90×107(64.22%)6.70×107(54.47%)8.70×107(70.73%)5.10×107(41.46%)9.30×107(75.61%)2.96×107(24.06%)LA-16.70×

16、;1085.70×108(85.07%)5.20×108(77.61%)3.70×108(55.22%)5.30×108(79.10%)3.40×108(50.75%)4.50×108(67.16%)2.21×108(32.98%)SL7.30×1086.60×108(90.41%)4.40×107(60.27%)6.10×108(83.56%)5.90×108(80.82%)4.30×108(58.9%)5.40×108(73.97%)3.24×

17、;108(44.38%)注:括號(hào)內(nèi)的數(shù)據(jù)為冷干后乳酸菌存活率(%)第4期呂加平等:乳酸菌發(fā)酵劑凍干保護(hù)劑篩選及應(yīng)用的研究3752.2不同懸浮基質(zhì)對(duì)冷凍保護(hù)效果的影響從表2可以看出,懸浮基質(zhì)不同,凍干保護(hù)劑的保護(hù)效果也不同,其保護(hù)效果在以水和增菌液為基質(zhì)時(shí)表現(xiàn)的十分顯者,加保護(hù)劑后與未加保護(hù)劑的菌數(shù)相比可以增加118268倍(水),5.7013.91倍(增菌液),1.563.90倍(脫脂復(fù)原乳)(NFS11%)。主要原因是脫脂復(fù)原乳為良好的凍干保護(hù)劑,而且測(cè)定結(jié)果是在凍干之后就測(cè)定的菌落總數(shù)。,脂乳。NFS的含量達(dá)15%20%為宜。2.3保護(hù)劑對(duì)不同菌種的保護(hù)作用選取NFS為12%的脫脂乳為懸浮

18、基質(zhì),將菌濃縮懸浮液加入滅菌脫脂乳中,使其最后的菌落總數(shù)為103cfumL-1,然后將上述四種脫脂乳菌懸液按0.25ml的量分別分裝于12管(凍干管)中,每管再加入0.25ml二倍濃度的凍干保護(hù)劑溶液(過(guò)濾除菌),渦流混合置冰柜凍結(jié),真空凍干后立即測(cè)定菌落總數(shù),具體試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。表3的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出,各凍干保護(hù)劑對(duì)不同菌保護(hù)作用有一定差異,其中海藻糖與側(cè)金盞花醇對(duì)各種菌的保護(hù)作用均保持較高的水平(存活率)。麥芽糊精對(duì)SL的保護(hù)效果稍差,僅為60.27%,與脫脂乳的水平相近。谷氨酸鈉與其它同水平的保護(hù)劑相比其效果最差。另外,六種凍干保護(hù)劑對(duì)嗜熱鏈球菌和乳酸鏈球菌凍干保護(hù)作用優(yōu)于對(duì)乳桿菌的保護(hù)

19、,這一結(jié)果同其他研究報(bào)導(dǎo)相比雖在趨勢(shì)方面是相同的,但各保護(hù)劑對(duì)保加利亞乳桿菌的保護(hù)效果要高于同類(lèi)研究報(bào)告的數(shù)據(jù)11,這可能與該菌對(duì)冷凍及真空干燥的應(yīng)激處理抗性較強(qiáng)有關(guān)。有關(guān)乳酸菌對(duì)熱、冷剌激抗性在本試驗(yàn)未做更詳細(xì)的比較研究。但本項(xiàng)試驗(yàn)中選用的ST-1與SL均為粘性較大的菌株,其生長(zhǎng)中產(chǎn)生的胞外多糖使菌體對(duì)冷、熱抗性可能有一定影響。2.4最佳保護(hù)劑優(yōu)化配方設(shè)計(jì)根據(jù)菌體凍傷及凍干保護(hù)機(jī)理,結(jié)合各保護(hù)劑的保護(hù)效果與作用特點(diǎn)、保護(hù)劑的來(lái)源、性狀,選取A,B,C,D四種保護(hù)劑為試驗(yàn)因素,采用L16(45),4,A,B,C三因素的極差大于誤差項(xiàng)的極差,而C因素的極差值卻小于誤差極差值,說(shuō)明A,B,D項(xiàng)對(duì)菌

20、落總數(shù)的影響是顯著的,而C因素的影響在實(shí)驗(yàn)水平內(nèi)不顯著,但仍然有一定的保護(hù)作用。四因素影響程度大小依次為ADBC,最佳配方組合為A4B4C3D4,本實(shí)驗(yàn)為了使實(shí)驗(yàn)結(jié)果及各因素的影響更顯著,選取的懸浮基質(zhì)為生理鹽水,若在實(shí)際中使用NFS為11%脫脂復(fù)原乳,則各保護(hù)劑的配合水平還可下調(diào),同樣可以達(dá)到保護(hù)效果。2.5凍干保護(hù)劑對(duì)菌體生物學(xué)特性的保護(hù)作用在篩選保護(hù)劑時(shí),一般均采用菌落總數(shù)作為可靠的評(píng)價(jià)指標(biāo),但是菌落總數(shù)的測(cè)定工作繁雜,極易造成污染而使菌落無(wú)法計(jì)數(shù),因而本試驗(yàn)測(cè)定了保護(hù)劑對(duì)菌體活力的影響(主要是產(chǎn)酸力和乳糖酶活力)具體結(jié)果見(jiàn)表5。表5的結(jié)果表明,凍干保護(hù)劑對(duì)乳酸菌乳糖酶釋放量有一定影ST

21、-1的產(chǎn)酸力、響。本試驗(yàn)曾選取發(fā)酵8.5h為測(cè)定時(shí)間,結(jié)果使各試驗(yàn)組的酸度無(wú)明顯差異,其原因是受傷的菌體在短時(shí)間得以修復(fù)而恢復(fù)了產(chǎn)酸力。以5.5h發(fā)酵時(shí)間則可揭示各試驗(yàn)組的活力差異。產(chǎn)酸效果與菌落總數(shù)測(cè)定值基本一致。但是,冷凍保護(hù)劑對(duì)菌體乳糖酶的影響不大,酶活性與產(chǎn)酸力、菌存活率相差較大。從另一側(cè)面也說(shuō)明真空冷凍干燥法376東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)第29卷對(duì)菌體破裂性損傷很小。產(chǎn)酸力與菌存活率之間雖有一定相關(guān)性,但目前尚難以確定精確的相關(guān)關(guān)系。因此,在評(píng)價(jià)凍干保護(hù)劑保護(hù)效果時(shí)仍以菌落總數(shù)值為判定標(biāo)準(zhǔn),產(chǎn)酸力僅可作為參考指標(biāo)。表4冷凍保護(hù)劑優(yōu)化配方正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析表Table4Thedesigna

22、ndresultanalysisoforthogonalitytestoptimizingofcryorotectantsA(Sucrose)12345678910111213141516K1K2K3K4k1k2k3k4R23434124321214338.280.8119.9122.39.5520.229.8830.5821.03B(Maltode-)23421433412432173.179.9104104.218.2819.982626.057.77C(l123412341234123494.785.998.68223.6821.4824.6520.54.15D-111122223333

23、444486.164.56104.5106.121.5316.1426.1326.5310.391234432121433412100.378.182.6100.225.0819.5320.6525.055.55TotalViablecountsX×107(cfumL)7.812.432.533.424.516.85.617.635.638.424.06.526.818.336.524.52.6凍干發(fā)酵劑電鏡觀察A.透射電鏡觀察:見(jiàn)圖1。B.掃描電鏡觀察:見(jiàn)圖2。從圖片可以看出,不同保護(hù)基質(zhì)基凍干菌物的構(gòu)造有顯著區(qū)別,脫脂乳基質(zhì)呈粗大的網(wǎng)格構(gòu)造,而麥芽糊精等復(fù)合基質(zhì)則呈較細(xì)的網(wǎng)孔構(gòu)造

24、,在圖2、A2、B2圖片中的網(wǎng)格條梁上可以看到凸起呈球形的構(gòu)造,可能是菌體。特別是圖片B2可看到呈串珠樣的隆起構(gòu)造,說(shuō)明不同基質(zhì)對(duì)菌體的保護(hù)作用不同還體現(xiàn)在菌體形態(tài)與菌物構(gòu)造方面。凍干時(shí)若有良好的保護(hù)基質(zhì),菌體的形態(tài)可以保持不變或變化很小。但是菌體表面卻有一定的皺縮現(xiàn)象呈腦回樣。(見(jiàn)圖1)菌體第4期呂加平等:乳酸菌發(fā)酵劑凍干保護(hù)劑篩選及應(yīng)用的研究377表5凍干保護(hù)劑對(duì)菌體產(chǎn)酸力與乳糖酶活力的影響Table5Influenceofcryoproteetantonacidityandlactaseactivityoflacticacidbacteria保護(hù)劑Cryoprotectant濃度Conc

25、entration10%10%%2.0%滴定酸度TTiratableacidity28262526乳糖酶活力(A420)3ActivityofLactase(420).0080410.0400.0070.0230.027蔗糖(Sucrose)海藻糖(Trehalose)側(cè)金盞花醇(Adonitol)山梨醇(l(Sodiumtripolyphosphate)焦磷酸鈉(Sodiumpyrophospate)-磷酸甘油鈉(Sodium-glycerophosphate)2.0%210.0402.0%10%10%2831250.0270.0100.027麥芽糊清(Maltodextrin

26、)乳糖(Lactose)圖1凍干發(fā)酵劑透射電鏡圖譜Fig.1Transmissionelectronmicrographsoffreezedryingstarter呈球桿狀。加入保護(hù)劑則可與胞壁結(jié)合,避免膜的粘連、破裂而菌體死亡,不同保護(hù)劑菌體透射電鏡觀察結(jié)果無(wú)明顯差別。有關(guān)凍干菌物的電鏡觀察報(bào)導(dǎo)極少,許多問(wèn)題有待今后深入研究。以期揭示冷凍損傷與保護(hù)機(jī)理,篩選更為理想實(shí)用的凍干保護(hù)劑。378東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)第29卷2A乳懸浮液基質(zhì)樣2AMlikSuspension2B麥芽糊精懸浮液基質(zhì)樣2BMaltodextrinmixedSoiution圖2凍干發(fā)酵劑掃描電鏡圖譜Fig.2Scanninge

27、lectronmicrographsoffreezedryingstarter3結(jié)論3.1對(duì)蔗糖、海藻糖等十多種糖、醇類(lèi)的冷交設(shè)計(jì)完成,以A4B4C3D4為最佳配方組合。3.5發(fā)酵劑菌體在冷凍干燥后,其菌落總數(shù)與產(chǎn)酸力呈一定關(guān)系,但與乳糖酶活力無(wú)明確聯(lián)系。3.6在適宜的凍干保護(hù)基質(zhì)中凍干的菌體凍保護(hù)效果的比較研究表明,海藻糖與側(cè)金盞花醇的凍干保護(hù)效果最好,其次是蔗糖、麥芽糊精、山梨醇;脫脂乳仍是實(shí)用的效果較好的凍干保護(hù)基質(zhì)。3.2各凍干保護(hù)劑在生理鹽水和增菌液懸浮基質(zhì)中的保護(hù)效果顯著。3.3凍干保護(hù)劑對(duì)不同菌體的保護(hù)力有明顯差異,對(duì)球菌的保護(hù)效果要優(yōu)于對(duì)乳桿菌的保護(hù)效果。3.4最佳冷凍保護(hù)劑的

28、配方設(shè)計(jì)可采用正形態(tài)變化不大,菌表面呈腦回樣皺褶。不同基質(zhì)菌物的構(gòu)造不同。參考文獻(xiàn)1Robinson.R.19852中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院標(biāo)準(zhǔn)處.食品衛(wèi)生國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)匯編K.Dairymicrobiology.NewYork.中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,北京.19883潘道東,乳糖酶與脆壁酵母細(xì)胞的固定化及其特性研究,東農(nóng)碩士論文.1990第4期呂加平等:乳酸菌發(fā)酵劑凍干保護(hù)劑篩選及應(yīng)用的研究.1993(76):19021907Sci3794呂加平,駱承庠,凍干保護(hù)劑的研究及其應(yīng)用,中國(guó)畜產(chǎn)與食品(專(zhuān)輯)1996,42505Johnson.J.A.C.etal.Propertiesoflactobacillush

29、elveticusCNRZ-32attenuatedbyspray-drying.1995,78:freeze-drying,orfreezing.J.DairySci7617686劉宇峰等.直接使用型酸奶發(fā)酵劑的研制,中國(guó)乳品工11Rumian,N.etal.Comparativeinvestigationonactiv2ityoflactobacillusbulgaricusduringlyophilization.442Cryobiology1993,(30):43812TsvetanTsvetkovetal.Studiesontheeffectsoflowtemperaturesonl

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