柑橘屬植物(CitrusL.)多甲氧基黃酮含量檢測、單體純化及其抗疲勞機(jī)理研究

1、柑橘屬植物(CitrusL.)多甲氧基黃酮含量檢測、單體純化及其抗疲勞機(jī)理研究中國是柑橘屬植物最重要的起源地,具有豐富的柑橘資源。有關(guān)我國柑橘資源的研究雖然經(jīng)歷了半個多世紀(jì),但對地方柑橘品種多甲氧基黃酮的研究仍缺乏相對應(yīng)的研究支持。多甲氧基黃酮是柑橘類水果特有的一種黃酮類化合物,具有抗炎、抗氧化、抗心血管疾病、抗癌等眾多生物活性功能。此外,較黃烷酮相比多甲氧基黃酮良好的口服吸收利用率,使得多甲氧基黃酮有著更好的臨床研究潛力。但是由于同分異構(gòu)現(xiàn)象明顯,多甲氧基黃酮單體的制備普遍存在分離方法繁瑣、純化效率不高、制備過程環(huán)境污染等問題。因此,弄清我國地方特有柑橘品種中多甲氧基黃酮的種類與含量,建立綠

2、色、高效的多甲氧基黃酮制備方法,是未來研究柑橘屬植物多甲氧基黃酮與地方柑橘資源科學(xué)利用亟需解決的關(guān)鍵問題。疲勞使機(jī)體處于亞健康狀態(tài),會導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降、擾亂內(nèi)分泌與神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)定、誘發(fā)心腦血管等疾病,嚴(yán)重危害人們的健康。線粒體是機(jī)體能量供應(yīng)的主要細(xì)胞器,也是活性氧產(chǎn)生的主要場所。其功能的改善不僅可以增加組織能量的供應(yīng),還能夠增加組織氧化耐受能力線粒體已成為抗疲勞研究的重要靶向細(xì)胞器。近期的研究發(fā)現(xiàn),天然酚類化合物能夠通過激活肌肉組織中某些蛋白的表達(dá),改善肌肉線粒體的功能拮抗疲勞的發(fā)生,但是卻尚未見到多甲氧基黃酮方面的研究報道。實驗室近期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),柑橘果皮多甲氧基黃酮混合物具有調(diào)節(jié)能量代謝的

3、功能,提示多甲氧基黃酮單體可能具有改善線粒體活性的功效。基于相關(guān)文獻(xiàn)信息與團(tuán)隊前期研究成果,本課題提出科學(xué)假設(shè):柑橘多甲氧基黃酮單體能夠通過調(diào)節(jié)線粒體活性,改善骨骼肌功能,進(jìn)而對抗疲勞的發(fā)生。研究目的:1)通過分析我國十三種地方特有柑橘品種果皮中多甲氧基黃酮的組分與含量,為地方柑橘資源的利用提供新的科學(xué)信息,為多甲氧基黃酮單體原材料的選擇提供實驗證據(jù);2)通過建立綠色、高效的柑橘果皮多甲氧基黃酮分離純化方法,為柑橘果皮的科學(xué)利用開辟新的途徑,為柑橘多甲氧基黃酮單體的規(guī)?；a(chǎn)提供借鑒與指導(dǎo);3)通過對柑橘果皮主要多甲氧基黃酮單體進(jìn)行體外篩選及其體內(nèi)藥效學(xué)驗證,為多甲氧基黃酮單體的功效研究提供新

4、的作用靶點(diǎn),為多甲氧基黃酮單體拮抗疲勞提供新的實驗證據(jù)。研究方法與結(jié)果:1.我國十三種地方特有柑橘品種多甲氧基黃酮組分與含量的檢測分析方法:通過超高效液相色譜結(jié)合二極管陣列檢測法,對我國十三種地方特有柑橘材料(包含寬皮柑橘類、橙類、柚類、檸檬類以及枸櫞五大柑橘品種)果皮中的多甲氧基黃酮組分以及含量進(jìn)行檢測與分析。結(jié)果:組分方面,年橘、汕頭蕉柑、巖溪晚蘆以及大紅袍紅橘多甲氧基黃酮(PMFS含量最為豐富，包含了標(biāo)準(zhǔn)曲線中所有的PMFs®分;S26錦橙、廣西憑祥土檸檬、黎檬次之含有8種PMFs®分;含量方面,大紅袍紅橘在所有材料中PMF*量最高為283.40±13.20

5、(mg/100gFW,緊隨其后分別是巖溪晚產(chǎn)233.40±9.74(mg/100gFW、汕頭蕉柑222.35±20.65(mg/100gFVV、年橘191.64±29.60(mg/100gFW、黎檬69.30±8.02(mg/100gFW;黃烷酮方面，組分與含量位居前列的分別是黎檬778.00±22.54(mg/100gFW、大紅袍617.93±82.04(mg/100gFW)、改良橙585.10±115.67(mg/100gFW)、巖溪晚蘆517.42±28.15(mg/100gFW以及奉節(jié)臍橙464.01

6、77;53.93(mg/100gFVV。2.大紅袍紅橘果皮中多甲氧基黃酮單體的分離純化與鑒定方法:通過大孔樹脂結(jié)合質(zhì)譜引導(dǎo)的制備液相同步制備多個多甲氧基黃酮單體,運(yùn)用超高效液相色譜、質(zhì)譜、紫外以及核磁共振對單體成分進(jìn)行分析與鑒定。結(jié)果:7種常用類黃酮吸附樹脂中,HPD100型樹脂吸附和解吸附能力最好,能夠快速吸附與解吸附紅橘果皮中的PMFs通過機(jī)制探究發(fā)現(xiàn)，HPD100對PMFs的吸附符合準(zhǔn)二級動力學(xué)模型以及顆粒擴(kuò)散一階模型,吸附機(jī)理主要是PMFs#液膜邊界轉(zhuǎn)移到HPD100表面，后PMFstfHPD100之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移實現(xiàn)吸附。吸附過程屬于放熱過程，符合Langmuir熱力學(xué)模型，降溫有利

7、于PMFS勺吸附。通過優(yōu)化HPD100動態(tài)吸附過程中的關(guān)鍵條件（上樣濃度、過柱流速、洗脫液濃度、洗脫流速）發(fā)現(xiàn)，PMFs上樣濃度為8.5mg/mL過柱流速在4BV/h時HPD100的吸附效果最好,而90%乙醇洗脫液濃度,4.0BV/h洗脫流速能夠有效的提高洗脫效率。經(jīng)過HPD100吸附后，粗提液PMFSI勺濃度提高了11.43倍。結(jié)合質(zhì)譜引導(dǎo)的制備液相，分離純化得到五種PMFs體化合物。經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)這五種單體分別是:甜橙黃酮C₂₀H₂₀O₇分子量372.12，

8、純度為97.4%;5,6,7,4-四甲氧基黃酮C₁₉H₁₈O₆,分子量342.11,純度為95.6%;川陳皮素C₂₁H₂₂O₈分子量402.13，純度為99.1%;橘皮素C₂₀H₂₀O₇

9、分子量372.12，純度為98.64%;5-羥基-6,7,8,3,4-五甲氧基黃酮C₂₀H₂₀O₈"量388.11，純度為97.8%。3.大紅袍紅橘多甲氧基黃酮抗疲勞體外單體篩選及其體內(nèi)藥效學(xué)驗證方法:通過體外建立C2c12幾管細(xì)月fi模型，對五種PMF曲體的細(xì)胞活力影響與線粒體調(diào)節(jié)活性進(jìn)行研究與篩選,并對篩選出的單體進(jìn)行再驗證以及機(jī)制探討。隨后結(jié)合體內(nèi)動物實驗,通過行為學(xué)考察、生化指標(biāo)檢測、超微組織形態(tài)觀察等全面評價、研究多甲氧基黃酮單體在體內(nèi)拮

10、抗疲勞的效果以及作用機(jī)制。結(jié)果:C2c12肌元細(xì)胞經(jīng)馬血清誘導(dǎo)分化,在第6天具備成熟肌管細(xì)胞基本形態(tài)結(jié)構(gòu)。肌細(xì)胞成熟標(biāo)志物肌球重鏈蛋白與肌細(xì)胞生成素蛋白均高表達(dá),提示C2C12肌管細(xì)胞模型構(gòu)建成功。細(xì)胞增殖與毒性檢測結(jié)果顯示,川陳皮素、甜橙黃酮、橘皮素、5-羥基-6,7,8,3',4'-五甲氧基黃酮在0-200仙mol/L濃度范圍內(nèi)（6h）,對C2c12肌管細(xì)胞活性沒有顯著的抑制作用。5,6,7,4'-四甲氧基黃酮在100仙mol/L濃度范圍內(nèi)時，又tC2c12肌管細(xì)胞活性沒有抑制作用。實時熒光定量Q-PCR吉果顯示：川陳皮素和橘皮素均具有上調(diào)線粒體生物發(fā)生關(guān)鍵基因TF

11、AMW及線粒體新生生物標(biāo)記物mtDNA勺活性功能，其中橘皮素的調(diào)節(jié)功能更為顯著。通過機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，橘皮素可能通過能量調(diào)節(jié)方式，增加了LKB1激酶Ser428位點(diǎn)的磷酸化，進(jìn)而激活了線粒體生物發(fā)生AMPK-PGC1-NRF1-TFAMW號通路，發(fā)揮調(diào)節(jié)線粒體生物發(fā)生的活性功能。體內(nèi)動物實驗結(jié)果顯示:橘皮素預(yù)防性給藥4周后顯著增加了小鼠懸杠時間、轉(zhuǎn)棒疲勞時間。增加了小鼠肌肉糖原的含量,降低了血乳酸的水平。透射電鏡結(jié)果顯示,小鼠肌肉線粒體數(shù)量和體積顯著增加。免疫印記與免疫組化結(jié)果也進(jìn)一步揭示,小鼠肌肉線粒體生物發(fā)生信號通路被激活。研究結(jié)論:1）寬皮柑橘類柑橘品種多甲氧基黃酮的種類最為豐富且含量最高,其中大紅袍紅橘總多甲氧基黃酮含量在本次所選材料中居首為283.40±13.20(100mg/gFW),是開發(fā)多甲氧基黃酮較為理想的研究材料;2)大孔樹脂HPD100結(jié)合質(zhì)譜引導(dǎo)的制備液能