分支桿菌藥物敏感性測定的幾個問題

1、    分支桿菌藥物敏感性測定的幾個問題        非結(jié)核分支桿菌病的治療和藥物敏感性測定最初是模仿結(jié)核病的治療和結(jié)核分支桿菌藥敏試驗。但是,非結(jié)核分支桿菌在藥物敏感性方面存在一些自己的特征。因此, 與結(jié)核分支桿菌藥敏試驗方法有所不同。 目前對分支桿菌藥物敏感性研究尚欠深入,對其規(guī)律性認識不清， 結(jié)果不令人滿意。一、分支桿菌藥物敏感性特征就其對藥物敏感性而言, 非結(jié)核分支桿菌存在三個特點:(1)藥物敏感度幅度大,分布散。 結(jié)核分支桿菌野生株對利福平、 異煙肼、 乙胺丁醇、

2、鏈霉素、 氧氟沙星等的最低抑菌濃度（MIC）范圍相差僅 24倍,而鳥分支桿菌野生株對上述藥物的MIC范圍則有十數(shù)倍至百倍之多。 這樣的結(jié)果,僅僅是從肺部感染和人類免疫缺陷病毒（HIV）的播散性感染患者分離株的測定結(jié)果。 如果包括環(huán)境或無明顯癥狀者僅僅是棲居的痰中分離株MIC的范圍可能更廣1, 2。 和MIC一樣，最低殺菌濃度（MBC）也顯示同樣的特征，幅度大,分布散。 氧氟殺星和環(huán)丙殺星對鳥分支桿菌的MBC/MIC比值在18, 而結(jié)核分支桿菌僅為0.52。一些抑菌和殺菌定量指標分布散的特點，也反映在鳥分支桿菌的瓊脂固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基上，測定結(jié)果相差遠較結(jié)核分支桿菌大。 在7H10瓊脂培養(yǎng)基

3、和7H12液體培養(yǎng)基測定的結(jié)核分支桿菌對異煙肼、 乙硫異煙胺、 利福平、鏈霉素、 卷曲霉素、乙胺丁醇等MIC 基本相同。 但是,在兩個培養(yǎng)基上測定的對鳥分支桿菌的MIC相差216倍之多。(2)大多數(shù)抗結(jié)核藥物對鳥分支桿菌等的活性很低。(3) 即使是有效藥物,大多數(shù)也顯示很弱的殺菌能力, 并顯示了株的差異性。這是因為它們有高MBC/MIC比值和MBC濃度往往超過血清峰值（Cmax)的緣故。 利福平對鳥分支桿菌野生株的MBC/MIC在464(pH6.8)和4128(pH5.0), 顯示了株的差異。 600 mg口服利福平的最高血清濃度僅在812 g/ml。因此, 株依賴性和低敏感性成為包括鳥分支桿

4、菌在內(nèi)的分支桿菌藥物敏感性的特征。 顯然，非結(jié)核分支桿菌的藥物敏感性測定不能套用結(jié)核分支桿菌的臨界濃度, 采取測定其敏感性程度的定量方法就成為唯一的正確選擇。同時, 由于大多數(shù)藥物顯示很弱的對非結(jié)核分支桿菌的殺菌活性, 采用藥物聯(lián)合用藥是必然的。研究發(fā)現(xiàn), 在聯(lián)合用藥效應上,非結(jié)核分支桿菌同樣顯示株間的差異。 因此,對于非結(jié)核分支桿菌來說, 藥物間的并用效應是株的特征, 而非藥物的屬性, 因此, 需要個體化測定聯(lián)合用藥的效應。二、藥物協(xié)同作用的定量測定采用聯(lián)合用藥一般是為了(1)減少出現(xiàn)耐藥性的可能性。(2) 增加邊緣效應藥物的抗菌活性, 特別是免疫無反應患者所需的殺菌活性。(3)降低用藥劑量

5、, 減少毒性。(4)擴大治療范圍。(5)治療同時出現(xiàn)的多種感染。聯(lián)合用藥是結(jié)核病化療最重要的原則, 其主要目的是為了(1)降低耐藥性出現(xiàn)頻率。(2)用于起始耐藥率高的地區(qū)。(3) 設計合理的短程化療。在結(jié)核病短程化療聯(lián)合用藥中,利用不同藥物對結(jié)核患者體內(nèi)不同環(huán)境和不同代謝狀態(tài)異質(zhì)性的菌群的各自作用設計聯(lián)合用藥是一個重要考慮。 而在鳥分支桿菌等非結(jié)核分支桿菌治療中采用聯(lián)合用藥的目的有所不同,主要是利用藥物殺菌活性的相加或協(xié)同, 以克服“自然”耐藥性。因此,進行野生株的聯(lián)合用藥并用效應的個體化測定是必要的。并用藥物測定的程序如下: 首先測定臨床分離株的單藥MIC， 對于高于“敏感” 切點的株,再進

6、行2藥或多藥的并用效果測定。 其采用的藥物濃度應該是1/2, 1/4,1/8 MIC的單藥藥物濃度。 BACTEC法測定結(jié)果判定的標準是評估并用瓶內(nèi)生長指數(shù)(GI)和單藥瓶內(nèi)GI的商。此商值和并用藥物數(shù)的倒數(shù)相比較(1/并用藥物數(shù))，兩藥并用時商值<0.5, 可視作兩藥有協(xié)同作用；等于1時, 為相加；2時，為拮抗。三、藥物后效應(PAE)藥物的另一個抗菌活性是PAE。PAE是藥物短時間脈沖式作用后,除去藥物后發(fā)現(xiàn)細菌再生長或持續(xù)抑制的時間(天)。一般是將活菌數(shù)10倍增加作為再生長的指標，在結(jié)核分支桿菌中稱為生長延遲。PAE反映非致死性損傷, 是一介乎MIC和MBC之間的活性。機制不清,

7、可能(1) 藥物在細胞作用部位有限的滯留或(2)亞致死性損傷。在PAE期間, 增加了對其他藥物的脆弱性。但在測定PAE時, 應注意菌活性 和PAE。因此,一般采用Cmax和Cmax保持的時間測定PAE。 結(jié)核分支桿菌的生長延遲, 成為短程化療的一個依據(jù)。但是PAE在非結(jié)核分支桿菌中作用的有關(guān)資料很少,仍待研究。四、定量測定由于從未接觸藥物的結(jié)核患者的分離株對藥物敏感性程度相近,并遠離Cmax。因此, 可采用一臨界藥物濃度測定野生株的敏感性或耐藥性。 臨床實驗室常規(guī)采用的絕對濃度法, 1%比例法均采用臨界藥物濃度法。但是, 鳥分支桿菌等非結(jié)核分支桿菌敏感性離散程度高, 有株依賴性。因此, 個體化

8、定量測定其株的敏感性程度是唯一可能的選擇。 這些定量指標主要是單個藥物和并用藥物的MIC和MBC測定。MIC是在一定培養(yǎng)時間內(nèi)可抑制 99%以上的菌生長的最低藥物濃度。測定中, 需要注意藥物失活和降解, 以期得到可信的數(shù)值。因此, 應慎用培養(yǎng)基和限定培養(yǎng)時間。美國國家實驗室標準委員會(NCCLS)規(guī)定一般細菌的藥敏測定時間是2448 h, 緩慢生長分支桿菌是2周(7H10 瓊脂培養(yǎng)基)、8 d(7H12液體培養(yǎng)基), 快速生長分支桿菌為4 d。而結(jié)核分支桿菌是 3 周(7H10)和8天(7H12)。另一個定量指標是MBC,是在24 h培養(yǎng)期間殺死99.9%接種菌群的最低藥物濃度。抑制商(IQ)

9、( 平均Cmax/ 患者分離株)和強度指數(shù)(ID)(>MIC的平均血清濃度/ 患者分離株MIC)是考核藥物治療的可能結(jié)果的另外兩個定量指標。但是, 在方法上也存在不同作者對接種量、藥物濃度和結(jié)果解釋上的不同意見。因此, 在鳥分支桿菌復合群中, 何時何株需要進行藥物敏感性測定仍有爭議。1MIC測定：藥物敏感性測定中必須關(guān)注的是在培養(yǎng)基制備和測定過程中藥物的失活。在不同培養(yǎng)基中, 因為成分和制備過程中藥物變化程度不同出現(xiàn)不同的MIC。如羅氏培養(yǎng)基測定的利福平的MIC是40 g /ml, 而在 7H10瓊脂培養(yǎng)基為1 g /ml, 在7H12液體培養(yǎng)基中為0.25 g /ml。緩慢生長分支桿菌

10、可采用類似結(jié)核分支桿菌藥物敏感性測定的固體法(瓊脂、羅氏、小川培養(yǎng)基和7H10瓊脂培養(yǎng)基)。由于在固體培養(yǎng)基中測定的MIC可能并非真正的藥物濃度，因此,測定的MIC很難和血清峰值濃度及其他藥代動力學指標比較。但是,可用于治療期間患者菌群敏感性變化的監(jiān)測。理想的MIC測定采用液體培養(yǎng)基的方法, 因為它可較好滿足藥物敏感性測定對藥物失活和時間的要求。因為 (1) 可1周內(nèi)完成藥敏測定(瓊脂固體培養(yǎng)基需要2周)。(2) 藥物吸附和降解最少。(3)加入的濃度可認作是實際作用濃度。(4)測定的MIC 可與Cmax和其他藥代動力學參數(shù)比較。(5) 可測定MBC,得到MBC/MIC比值。液體培養(yǎng)基中測定MI

11、C的方法有集落形成單位（CFU）計數(shù)法, 濁度法和BACTEC法。7H12 培養(yǎng)基中CFU計數(shù)法,是最精確的方法，是其它方法的對照標準。但費時費事, 不能推薦為臨床實驗室方法。結(jié)核分支桿菌由于呈簇狀生長,干擾了濁度測定的精確度。大多數(shù)非結(jié)核分支桿菌如鳥分支桿菌和胞內(nèi)分支桿菌培養(yǎng)物在培養(yǎng)液中呈散開的生長, 適用于濁度法。 但是, 為了能在1周內(nèi)獲得結(jié)果, 采用了大菌量接種。BACTEC輻射測定的基礎是放射測定的抗結(jié)核藥物結(jié)果和CFU測定結(jié)果一致。方法簡單,但費用高。BACTEC的MIC測定是以生長指數(shù)(GI)低于100倍稀釋對照管的最低藥物濃度4。在BACTEC系統(tǒng)中,結(jié)核分支桿菌藥敏試驗中敏感

12、/耐藥的臨界濃度是以未接觸過藥物的野生株最高MIC值確定的。臨界濃度法節(jié)省時間、費用，但不能檢出仍對化療反應良好的患者的中度敏感或中度耐藥株的中間株。 因此, 多切點濃度(一般是3個濃度)則可將臨床分離株分成四類: 敏感( 其MIC 處于野生敏感株的范圍內(nèi)),中度敏感( 其MIC高于在敏感野生株中發(fā)現(xiàn)的范圍, 但兩倍低于文獻中介紹的最低的Cmax), 耐藥( 其MIC處于 Cmax水平)和非常耐藥( 其 MIC 實質(zhì)性高于Cmax)4。由于化療失敗病例耐藥性改變非常迅速,同時敏感株的敏感程度離散度小，因此,在結(jié)核分支桿菌中測定中間株可能并不十分重要。一個測驗中,鳥分支桿菌對異煙肼的MIC50為

13、2.32 g/ml, 而MIC90則>10 g /ml。因此, 由于離散度大和株依賴性的原因, 采用某臨界藥物濃度判定鳥分支桿菌的敏感/耐藥相當困難, 需要尋找別的敏感/耐藥的標準。Isenberg 1988年提出一個假設: 患者分離株耐受性等于或高于Cmax株, 對化療無反應，而患者分離株對低于Cmax濃度敏感、可能對化療有反應，則成為敏感/耐藥標準的基礎。顯然,在標準中需要同時考慮兩個因素: 未接觸過藥物的野生株的最高MIC和血清 Cmax或組織濃度。 Heifets依據(jù)對藥物的敏感程度也將鳥分支桿菌分為四類: 敏感(其 MIC處于結(jié)核分支桿菌切點濃度內(nèi)), 中度敏感(其 MIC 明

14、顯低于Cmax,但在野生結(jié)核分支桿菌之上),中度耐藥( MIC處于Cmax水平上)和高度耐藥 (其MIC超過Cmax)。有關(guān)快速生長非結(jié)核分支桿菌如偶然分支桿菌、龜分支桿菌等的研究較少, Heifets等3認為也應適用于鳥分支桿菌的劃分原則。2MBC：對需氧菌而言,MBC是指作用1824 h培養(yǎng)期間能殺死 99.9%菌群所需的最低藥物濃度。這樣的殺菌率實際上是一主觀性指標。由于大多數(shù)藥物對鳥分支桿菌等的殺菌活性低,測定MBC并與Cmax比較, 對于估價感染治療結(jié)果尤其是免疫低下患者是重要的。MBC的測定只有在液體培養(yǎng)基以CFU計數(shù)進行。因此,臨床實驗室常難以進行。3抑制商和強度指數(shù)都有助于對化

15、療結(jié)果的預測。五、藥物敏感測定結(jié)果的解釋一般評價藥物活性有下列途徑: 試管內(nèi)抑菌和殺菌活性測定,巨噬細胞內(nèi)試管實驗, 產(chǎn)生體內(nèi)條件的試管內(nèi)模型實驗, 鼠實驗性治療和臨床驗證。 關(guān)于分支桿菌藥物敏感性測定雖然已經(jīng)積累了大量的資料, 但是臨床驗證較少。應該特別注意的是大多數(shù)臨床驗證是回顧性分析, 缺乏雙盲試驗驗證。美國胸科學會（ATS）在1997年提出了對一些非結(jié)核分支桿菌進行藥物敏感性測定的藥物名單及評價，詳見表1。表1考慮可作非結(jié)核分支桿菌敏感性測定的藥物(美國胸科學會,1997)菌種確認的臨床相關(guān)性未確認的臨床相關(guān)性無用的藥物敏感性測定緩慢生長分支桿菌鳥分支桿菌復合群甲紅霉素*阿米卡星,環(huán)丙

16、沙星，乙胺丁醇,乙硫異煙胺，利福布丁,利福平,鏈霉素異煙肼，吡嗪酰胺堪薩斯分支桿菌利福平阿米卡星,環(huán)丙沙星，甲紅霉素，乙胺丁醇吡嗪酰胺瘰疬分支桿菌鏈霉素，強力霉素或二甲胺四環(huán)素，乙胺丁醇，利福平,磺胺類阿米卡星,環(huán)丙沙星，甲紅霉素,利福布丁異煙肼,吡嗪酰胺嗜血分支桿菌甲紅霉素*阿米卡星吡嗪酰胺瑪爾摩分支桿菌乙胺丁醇環(huán)丙沙星猿猴分支桿菌利福平異煙肼斯氏分支桿菌利福布丁蟾蜍分支桿菌鏈霉素快速生長分支桿菌膿腫分支桿菌阿米卡星頭孢美唑氯苯酚嗪龜分支桿菌頭孢噻唑亞胺青霉烯乙胺丁醇偶然分支桿菌環(huán)丙沙星氧氟沙星異煙肼產(chǎn)粘液分支桿菌甲紅霉素托普霉素吡嗪酰胺恥垢分支桿菌強力霉素或二甲胺四環(huán)素，磺胺類利福平，鏈霉

17、素注：*大環(huán)內(nèi)酯類(甲紅霉素,阿齊霉素,羅紅霉素) 藥物敏感性測定是為了預期和評價放療方案對非結(jié)核分支桿菌病治療的療效。 鑒于非結(jié)核分支桿菌藥物反應特點, 應切實考慮Heifets等關(guān)于分支桿菌藥物敏感性測定的雙個體化, 同時考慮患者藥代動力學和患者分離株的藥效學定量測定4。實際上, 由于有關(guān)非結(jié)核分支桿菌的臨床治療往往是回顧性分析, 缺乏前瞻性嚴格的雙盲性臨床試驗研究, 特別是實驗室的敏感或耐藥測定結(jié)果和臨床療效的關(guān)系分析。因此, 我們期望任何非結(jié)核分支桿菌病的臨床研究都應該包括藥物敏感性測定和臨床療效關(guān)系的研究。 作者單位：潘毓萱（101149 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所）參考文

18、獻1，Heifets LB, Iseman MD ，Lindholm-Levy PJ. Ethambutol MICs and MBCs for Mycobacterium avium complex and Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother，1986，30: 927-932.2，Heifets LB, Lindholm-Levy PJ，F(xiàn)lory MA. Bactericidal activity in vitro of various rifamycins against M.avium and M.tuberculosis. Am Rev Respir Dis，1990，141：626-630.3，Heifets