天然產(chǎn)物活性成分檢測

1、分光光度計、干燥箱、電子天平、pH計、真空泵、紗布、漏斗、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、250ml容量陳羽迪2012332870002 12生物制藥（1）茶葉中茶多酚的粗提取與含量測定實驗報告、實驗?zāi)康?1、了解并熟悉茶多酚的元素組成、結(jié)構(gòu)構(gòu)成、理化性質(zhì)。2、掌握溶劑萃取法粗提取茶多酚的原理與操作。3、掌握酒石酸鐵比色法測定茶多酚的含量的原理及操作。4、了解分光光度計的使用方法和注意事項。、實驗原理和應(yīng)用:茶多酚（Tea Polyphenols）是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，包括黃烷醇類、花色苷類、黃茶多酚又稱茶鞣酮類、黃酮醇類和酚酸類等。其中以黃烷醇類物質(zhì)（兒茶素）最為重要?；虿鑶螌帲切纬刹枞~色香味的主要成份之

2、一，也是茶葉中有保健功能的主要成份之一。研究表明，茶多酚等活性物質(zhì)具解毒和抗輻射作用,能有效地阻止放射性物質(zhì)侵入骨髓， 并可使鍶90和鈷60迅速排出體外，被健康及醫(yī)學界譽為“輻射克星”。目前國內(nèi)外茶多酚粗品的提取的方法主要有:溶劑萃取法、離子沉淀法、樹脂吸附分離法、超臨界流體萃取法、 超聲波浸提方法、微波浸提法等等。在這些提取茶多酚的方法中每種方法都有它各自的針對性和使用范圍，使用時要根據(jù)各自的情況而定。根據(jù)實驗室的條件及實驗要求，本實驗采用溶劑萃取法對干茶葉中的茶多酚進行粗提取,即利用茶多酚易溶于乙酸乙酯等有機溶劑的原理進行液-液萃取。茶多酚的測定方法有高錳酸鉀直接滴定法和酒石酸鐵比色法,由

3、于高錳酸鉀直接滴定法操作比較復(fù)雜，且靠肉眼觀察顏色判斷終點,如果樣品溶液顏色較深時，可能影響測定結(jié)果。本實驗將應(yīng)用酒石酸鐵比色法測定茶多酚的含量。酒石酸鐵能與茶多酚生成紫褐色絡(luò)合物,絡(luò)合物溶液顏色的深淺與茶多酚的含量成正比。因此可以用比色方法測定。該法可避免高錳酸鉀滴定法所產(chǎn)生的人為視覺誤差。三、實驗儀器、材料和試劑實驗儀器:瓶、50ml容量瓶、分液漏斗 實驗材料: 干茶葉（市售散裝茶即可） 實驗試劑: 硫酸亞鐵（FeSO4 7H2O）,酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6 - 4出0）,磷酸氫二鈉 （Na2HPO4- I2H2O），磷酸二氫鈉（NaH2PO4'2H2O），乙酸乙酯。四、實驗

4、步驟與方法1、溶液的配制酒石酸亞鐵溶液制備：稱取0.25 g （準確至0.0001）硫酸亞鐵，1.25 g酒石酸鉀鈉（準確至0.0001）,用水溶解并定容至250 ml （低溫保存，有效期 10天）。2、干茶葉的預(yù)處理將干茶葉洗凈、晾干，烘干,最后粉碎。 粉碎的目的是與液體的接觸面增大使提取率增并且用研缽研細，干茶葉量為高。由于試驗條件的限制，用剪刀代替粉碎機將干茶葉剪碎,50. 00g。3、茶多酚的粗提取與定性檢測稱取經(jīng)過預(yù)處理的干茶葉末30. 00g ,加入250mL 90 C接近沸水中攪拌浸提、過濾，先 后用250mL的乙酸乙酯萃取兩次。合并兩次有機相。減壓蒸餾除去乙酸乙酯溶齊懦黃色粉

5、末狀茶多酚。從外觀上看，為黃色粉末狀。物理性能為，易溶于水及乙醇，味苦澀。4、茶多酚溶液的配置與含量的測定稱取步驟3中提取的茶多酚粉末 0.2500g，加水溶解定容至250mL，混勻，即為每毫升含1mg步驟3中提取的茶多酚粉末的溶液。分別取茶多酚溶液 1.0mL、2. 0mL、3. 0mL、4. 0mL于4個50mL容量瓶中，各加水至10mL ,再加酒石酸亞鐵溶液 10mL ,加入pH為7. 5的磷酸緩沖液至刻度，混勻后用1cm比色皿, 以空白試劑作參比，于波長540nm處測定吸光度 A，計算實驗數(shù)據(jù)，并繪制實驗數(shù)據(jù)表格。五、實驗現(xiàn)象和數(shù)據(jù)處理將高山茶葉磨成粉末， 加入蒸餾水得混有粉末的深綠色

6、液體，水煮后顏色變黃，變?yōu)椴菥G色。乙酸乙酯萃取后，上層淺黃色透明溶液，下層墨綠色渾濁液體，兩相間的乳化層有大0.79g黃色粉末茶多酚。茶多酚量較大氣泡。輕微搖晃后氣泡消失分層明顯。經(jīng)過旋蒸后得 溶液加入酒石酸亞鐵溶液后顏色變?yōu)樗{紫色，顏色隨茶多酚濃度增加而變深。蟲丄冥100%1000 Vxm3茶多酚的含量（） , A 樣品溶液的吸光度值，T樣品溶液的總體積（mL）V 測定用樣品溶液的量（mL），m樣品質(zhì)量（g）3.913 用1cm比色杯，當吸光度為1.0時，試液中茶多酚的濃度為3.913（mg/mL）表1實驗數(shù)據(jù)匯總實驗次數(shù)AT (mL)V (mL)m (g)3 ( % )3 (mg/g)10

7、.1045030.0016.78367.820.2235030.0027.27272.730.3625030.0037.87078.740.4635030.0047.54975.55、實驗結(jié)果檢驗一一繪制茶多酚標準曲線R處于0.95-1.05之間方可根據(jù)步驟4中所得的實驗數(shù)據(jù)，繪制茶多酚標準曲線，斜率達到實驗要求。表2繪制標準曲線所需數(shù)據(jù)V(mL)1.02.03.04.0A0.1040.2230.3620.4633 (mg/g)67.872.778.775.5茶多酚含量（mg/g）66= 0,6611茶多酚含量mg/g）線性（茶多酚含量Cme/g）R=0.813六、注意事項1、磷酸鹽緩沖液在常

8、溫下容易生長霉菌，放冰箱中保存或臨用時現(xiàn)配。2、茶多酚溶液應(yīng)保持澄清，若溶解后溶液渾濁應(yīng)先過濾。3、實驗前需仔細閱讀分光光度計使用說明書及注意事項。4、若茶多酚標準曲線斜率R不介于0.95-1.05之間，則實驗數(shù)據(jù)無效。七、實驗結(jié)果與分析本次實驗，所采用的測定方法主要為酒石酸亞鐵比色法。茶葉中多酚類物質(zhì)能與亞鐵離子形成紫藍色絡(luò)合物， 用分光光度法測定其含量。利用比色法進行測定， 可以有效地避免由F表為杭州茶葉研究院視覺產(chǎn)生的誤差，加以檢驗后可以得到較為準確的數(shù)據(jù)。但經(jīng)實驗證明，酒石酸亞鐵比色法測定的茶多酚含量明顯偏高。用兩種比色法測定茶葉中茶多酚含量的實驗結(jié)果。表3兩種測定方法實驗結(jié)果的比較名

9、稱干物率茶多酚含量（%）Folin試劑比色法酒石酸亞鐵比色法龍井95.218.933.3碧螺春92.920.626.9特級滇紅90.212.416.8凍頂烏龍96.914.419.8鐵觀音95.614.121.0普洱熟餅90.36.18.8造成以上差異的原因有以下三點：第一，酒石酸亞鐵比色法測得的是茶葉中多酚類物質(zhì)的總含量，是亞鐵離子與多酚類物質(zhì)絡(luò)合形成藍紫色物質(zhì),在540nm處有最大吸收。而Folin比色法測得的結(jié)果是茶葉中酚羥基被高價鎢氧化后形成藍色物質(zhì)在765nm處有最大吸收。酒石酸亞鐵比色法采用經(jīng)驗系數(shù)測算茶多酚的含量，而Folin比色法通過標準曲線換算茶多第二，酒石酸亞鐵比色法在提取

10、時采用沸水提取，而Folin比色法采用70%甲醇提取。第三,酚的含量。因此，可以得出Folin比色法在測定茶多酚含量的實驗中測算更為準確。陳羽迪2012332870002 12生物制藥（1）實驗二：茶葉中黃酮類化合物的提取和測定、實驗?zāi)康?1、了解黃酮類化合物對人體的藥理和保健作用。2、掌握茶葉中提取黃酮類化合物的方法。3、掌握測定黃酮類化合物含量的方法。、實驗原理和應(yīng)用:黃酮類化合物泛指兩個具有酚羥基的苯環(huán)（A-與B-環(huán)）通過中央三碳原子相互連結(jié)而成的一系列化合物，其基本母核為2-苯基色原酮。黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中常連接有酚羥基、甲氧基、甲基、異戊烯基等官能團。蘆丁是黃酮類化合物之一，且對于紫外

11、光具有極強的吸甲醇等極性強的溶劑收作用。天然黃酮類化合物多以苷類形式存在，一般易溶于水、乙醇、中；但難溶于或不溶于苯、氯仿等有機溶劑中。實驗首先用紫外分光光度法，利用蘆丁溶液在波長510nm處具有最大吸收的特點，測定標準蘆丁溶液的吸光值，繪制標準曲線。用無水乙醇提取茶葉中的黃酮類化合物， 得到茶葉提取液。取一定量的茶葉提取液， 用紫外分光光度法測定吸光度，根據(jù)標準曲線測定提取 液中總黃酮的含量。絕大多數(shù)的植物中都含有黃酮類化合物，掌握對茶葉中黃酮類化合物的提取和測定方 法，有利于對茶葉資源的綜合利用。對茶葉中黃酮類物質(zhì)的提取、測定和純化除以上方法外, 還有其他幾種常用方法:1）大孔樹脂吸附法因

12、為茶葉黃酮具有糖苷鏈和多酚結(jié)構(gòu)，有一定的親水性和極性，利于弱極性和極性樹脂對其吸附。而非極性樹脂吸附黃酮的量偏小。2）微波提取法微波具有試劑用量少、加熱均勻、提取批量大、選擇性好等優(yōu)點。以微波輻射的方式可加快反應(yīng)速度。在提取黃酮類化合物上取得很好的效果。3）超聲波輔助提取法是利用超聲波具有的機械效應(yīng)，空化效應(yīng)和熱效應(yīng)，通過增大介質(zhì)分子的運動速度、增大介質(zhì)的穿透力來提取生物有效成分。近年來越來越受到廣泛重視。超聲波提取具有節(jié)時、節(jié)能、節(jié)料、提取率高的特點。三、實驗儀器、材料和試劑儀器：分光光度計，電子天平，恒溫水浴鍋， 真空泵，布氏漏斗，250ml容量瓶，試管。材料：茶葉粉末。試劑：無水乙醇，蘆

13、丁標準品，亞硝酸鈉，氫氧化鈉，硝酸鋁試劑（以上均為分析純）。四、實驗操作1）繪制標準曲線總黃酮含量測定采用 AI（NO 3）3 NaNO2分光光度方法，黃酮與鋁離子在堿性條件下與亞硝酸鈉形成黃酮的鋁絡(luò)合物，生成穩(wěn)定的黃色。黃色的深淺與黃酮含量呈一定的比例關(guān)系,115 C烘干至恒重的蘆丁可與蘆丁標準品作對照，于510 nm波長處比色定量測定。本實驗中茶葉總黃酮含量測定的標準品為蘆丁。準確稱取于25 mg,用70%的乙醇溶解并定容至 250 mL ,使其濃度為100/mL。用70%乙醇將蘆丁 溶液稀釋成 10 種不同濃度（0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 0mL）的

14、溶液 5ml。分別量取不同濃度的蘆丁溶液1mL ,同時加人70%乙醇1 mL、5% NaNO2溶液0.3 mL , 混勻后靜置6 min，加入10% Al（NO 3）3溶液0-3 mL,混勻，靜置 6 min，再加入4 % NaOH溶液2 mL,混勻，靜置20 min，于510 nm波長處測定吸光度（A）。測得線性回歸方程。2）提取茶葉中的黃酮類化合物稱取1g茶葉粉末于燒杯中，加入20mL70%乙醇，用保鮮膜封口，置于80 C恒溫水浴鍋內(nèi)1h,抽濾后得濾液。3）量取1mL濾液，加人70%乙醇1 mL、5% NaNO2溶液0.3 mL,混勻后靜置6 min ,加入10% Al（NO 3）3溶液0

15、.3 mL,混勻，靜置 6 min，再加入4 % NaOH溶液2 mL,混勻,靜置20 min，于510 nm波長處測定吸光度。根據(jù)黃酮溶液的濃度與吸光度值成正比，吸光度值越大，黃酮溶液濃度越大，可測定茶葉提取液中黃酮類物質(zhì)的含量。五、注意事項乙醇濃度，樣品和乙醇溶液的固液比（ g/mL ），水浴溫度和水浴時間均對總黃酮的提取率和測定濃度產(chǎn)生影響。各個因素對茶葉黃酮提取得率的影響順序是：乙醇濃度 固液比溫度時間。所以實驗中要嚴格按照實驗要求進行實驗，樣品準確量取，以減小實驗誤差。實驗用到的乙醇溶液濃度較高，實驗時間較長，乙醇溶液要注意密封保存，防止乙醇溶液揮 發(fā)，濃度減小，導致的對實驗的影響。六. 實驗現(xiàn)象NaOH 變蘆丁稀釋為一定濃度梯度的溶液，顏色由無色到黃色，隨濃度上升而變深。茶葉的乙醇溶液抽濾后得草綠色濾液。經(jīng)過稀釋后接近無色，加入硝酸鋁變淺黃綠色。再加 橙紅色溶液。七、實驗結(jié)果與分析本實驗以已知的蘆丁標準溶液的濃度為標準，與茶葉提取液中的黃酮含量相比較，相對測定出茶葉提取液中的黃酮含量。這需要確保蘆丁標準溶液的濃度盡量準確，實驗所需試 劑的濃度要達