纖維素酶的研究及應(yīng)用-酶工程論文

1、纖維素酶的研究及應(yīng)用摘要：我國(guó)纖維素酶的應(yīng)用研究近年來(lái)取得了很大進(jìn)展。本文闡述了纖維素酶的發(fā)展，菌種選育，酶的結(jié)構(gòu)，反應(yīng)機(jī)制以及在生活中的應(yīng)用。關(guān)鍵詞：綠色化 催化域 結(jié)合區(qū) C1-Cx假說(shuō)一、纖維素酶的發(fā)展資源和環(huán)境問(wèn)題是人類在21世紀(jì)面臨的最主要的挑戰(zhàn)。生物質(zhì)資源是可再生性資源，地球上年光合作用的產(chǎn)物高達(dá)1.5×10112.0×1011t，是人類社會(huì)賴以生存的基本物質(zhì)來(lái)源。其中90%以上為木質(zhì)纖維素類物質(zhì)。目前這部分資源尚未得到充分的開發(fā)利用。隨著世界人口迅速增長(zhǎng)、礦產(chǎn)資源日漸枯竭，開發(fā)高效轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素類可再生資源的微生物技術(shù)，利用工農(nóng)業(yè)廢棄物等發(fā)酵生產(chǎn)人類急需的燃料

2、、飼料及化工產(chǎn)品，即化工原料的“綠色化”，具有極其重要的意義和光明的發(fā)展前景。纖維素酶的研究，自從1904年在蝸牛消化液中被發(fā)現(xiàn)，至今已經(jīng)歷三個(gè)發(fā)展階段。第一階段是80年代以前，主要工作是利用生物化學(xué)的方法對(duì)纖維素酶進(jìn)行分離純化。但由于纖維素酶來(lái)源廣泛、組分復(fù)雜、純化甚為困難，故進(jìn)展緩慢。第二階段是1980年至1988年，主要工作是利用基因工程的方法對(duì)纖維素酶的基因進(jìn)行克隆和一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定。Trichoderma reesei的內(nèi)切酶（EG、EG）和外切酶（CBH、CBH）、Cellulomonas fimi的內(nèi)切酶（CenA、CenB、CenC、CenD）和外切酶（CbhA、CbhB、Cex

3、）、Clostridium thermocellum的內(nèi)切酶（CelA、CelB、CelC、CelD）的基因已被克隆和測(cè)序，并在大腸桿菌，酵母菌等中得到表達(dá)。第三階段是1988年至今，主要工作是利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)及蛋白質(zhì)工程的方法對(duì)纖維素酶分子的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究，包括纖維素酶結(jié)構(gòu)域的拆分、解析、功能性氨基酸的確定、水解的雙置換機(jī)制的確立，分子折疊和催化機(jī)制關(guān)系的探討。二、纖維素酶菌種選育纖維素分解菌的篩選方法主要有纖維素選擇培養(yǎng)基法、濾紙底物和纖維素天青培養(yǎng)基法、半固體纖維素天青試管法、P-N法和纖維素剛果紅培養(yǎng)基法等。其中，纖維素剛果紅培養(yǎng)基在對(duì)纖維素分解菌的準(zhǔn)確識(shí)別方面具有明顯的優(yōu)越性。纖維

4、素是由葡萄糖殘基以-1.4糖苷鍵連接而成的線狀大分子物質(zhì)，在纖維素酶的作用下水解成纖維二糖和葡萄糖，水解后的糖類與剛果紅染料形成紅色沉淀，使產(chǎn)酶菌株的菌落周圍出現(xiàn)清晰的紅色水解圈。根據(jù)水解圈的大小，可以粗略地估計(jì)菌株產(chǎn)酶的情況，提高工作效率。產(chǎn)纖維素酶的微生物包括真菌、細(xì)菌和放線菌。其中主要的有：康氏木霉、黑曲霉、斜臥青霉、芽孢桿菌等。絲狀真菌產(chǎn)生的纖維素酶一般在酸性或中性偏酸性條件下水解纖維素底物，而嗜堿細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶在堿性范圍起作用。三、酶的分子結(jié)構(gòu)1纖維素酶分子結(jié)構(gòu)域的拆分1986年Tilbeurgh1用木瓜蛋白酶有限酶切Trichoderma reesei的CBH分子得到具有獨(dú)立活

5、性的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：一個(gè)是具有催化功能的催化域（catalytic domain,CD），另一個(gè)是具有結(jié)合纖維素功能的纖維素結(jié)合（吸附）區(qū)（cellulose binding domain,CBD），之后用類似的方法在多種細(xì)菌和真菌的纖維素酶中發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)構(gòu)。CBD在纖維素酶中位于氨基端或羧基端，它通過(guò)一段高度糖基化的linker與催化區(qū)相連。細(xì)菌纖維素酶的linker富含Pho、Thr，而真菌纖維素酶的linker富含Gly、Ser、Thr；細(xì)菌纖維素酶的CBD與 CD夾角為135°，而真菌為180°；細(xì)菌纖維素酶有兩個(gè)酶切位點(diǎn)可將CBD與linker分別切去，而真菌纖維素酶

6、一般只有一個(gè)酶切位點(diǎn)可將CBD與linker一同切去。由于纖維素全酶分子呈蝌蚪狀、其linker高度糖基化且具有較強(qiáng)柔韌性，故很難得到結(jié)晶.而結(jié)構(gòu)域的拆分使呈球形催化域的結(jié)晶成為可能，為纖維素酶的結(jié)構(gòu)和功能研究開辟了道路。2催化域結(jié)構(gòu)和功能的研究采用X光衍射的方法1990年Rouvinen2對(duì)T.reesei的CBH的催化域、1992年Juy3對(duì)C.thermocellum的CelD的催化域、1993年Spezio4對(duì)T.fusca的E2的催化域、1994年Divne5對(duì)T.reesei的CBH的催化域進(jìn)行了結(jié)晶和解析。三維結(jié)構(gòu)的研究為內(nèi)切酶和外切酶底物的特異性作出了合理的解釋：內(nèi)切酶的活性位

7、點(diǎn)位于一個(gè)開放的cleft中，它可結(jié)合與纖維素鏈的任何部位并切斷纖維素鏈；外切酶的活性位點(diǎn)位于一個(gè)長(zhǎng)Loop所形成的tunnel里面，它只能從纖維素鏈的非還原性末端切下纖維二糖。1995年Meinke6利用蛋白質(zhì)工程的方法將C.fimi的外切酶CbhA分子的Loop刪除后，發(fā)現(xiàn)該酶的內(nèi)切酶活性果然提高，這進(jìn)一步證實(shí)了上述分析。1990年Sinnott7從化學(xué)機(jī)制的角度出發(fā)論述了酶催化糖基轉(zhuǎn)移的機(jī)制，他認(rèn)為糖苷配基的離去是涉及到兩個(gè)氨基酸殘基的酸堿催化的雙置換反應(yīng)，這實(shí)際與溶菌酶的作用機(jī)制是相似的。1988年至1994年采用定點(diǎn)突變技術(shù)和酶專一性抑制劑做了大量研究812，終于證明Glu位于細(xì)菌、

8、真菌的內(nèi)切酶、外切酶、葡萄糖苷酶的活性位點(diǎn)；在異頭碳原子位通過(guò)構(gòu)型的保留或構(gòu)型的轉(zhuǎn)化完成催化反應(yīng), 其中兩個(gè)保守的羧基氨基酸分別作為質(zhì)子供體和親核試劑13，14水解雙置換機(jī)制得以證明。3 纖維素結(jié)合（吸附）區(qū)結(jié)構(gòu)和功能的研究自從1986年Tilbeurgh用木瓜蛋白酶有限酶切T.reesei的CBH分子發(fā)現(xiàn)CBD以來(lái)，之后用類似的方法和序列缺失的方法在多種細(xì)菌、真菌的纖維素酶和半纖維素酶中發(fā)現(xiàn)了CBD。1995年Tomme15根據(jù)CBD分子大小及氨基酸的相似性將已知的CBD分成了10個(gè)家族，大部分的CBD位于家族、。家族的CBD包括3340個(gè)氨基酸殘基，所有真菌的CBD都屬于家族；家族的CBD

9、包括95108個(gè)氨基酸殘基，C.fimi的CBD都屬于家族；家族的CBD位于那些能產(chǎn)生纖維小體的梭菌中。1989年Kraulis16用核磁共振的方法對(duì)T.reesei CBH的CBD、1995年Xu17對(duì)C.fimi Cex的CBD的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究；1996年Tormo18用X光衍射的方法對(duì)thermocellum的Cip的CBD三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。圖1為它們的結(jié)構(gòu)比較：盡管它們?cè)诜肿哟笮『驼郫B構(gòu)型上不同（CBH的CBD是一個(gè)折疊片形成的契形結(jié)構(gòu)，一面疏水、一面親水，疏水面與底物表面接觸；而后兩者是2個(gè)折疊片面對(duì)面形成的一個(gè)-sandwich），但它們的吸附面是相似的，都比較平坦、暴露了幾

10、個(gè)芳香族氨基酸（CBH的CBD是3個(gè)Tyr， Cex的CBD是2個(gè)Trp)及一些潛在的氫鍵形成殘基。圖1CBD的骨架結(jié)構(gòu)(a)T.reesei CBH的CBD;(b)C.fimi Cex的CBD。CBD功能的研究。CBD的去除實(shí)驗(yàn)19表明：纖維素酶去除CBD后對(duì)可溶性底物活力影響較小，而對(duì)結(jié)晶纖維素的吸附和水解活力則有明顯降低。化學(xué)突變和定點(diǎn)誘變20，21表明芳香族氨基酸在與結(jié)晶纖維素的吸附中發(fā)揮重要作用，它們的突變會(huì)導(dǎo)致CBD對(duì)結(jié)晶纖維素的吸附能力極劇下降。序列比較22表明與CBH的CBD同族的幾個(gè)CBD是用Phe或Trp代替了Tyr。目前人們推測(cè)：CBD可能通過(guò)芳香環(huán)與葡萄糖環(huán)的堆積力吸附

11、到纖維素上，由CBD上其余的氫鍵形成殘基與相鄰葡萄糖鏈形成氫鍵將單個(gè)葡萄糖鏈從纖維素表面疏解下來(lái)，以利于催化區(qū)的水解作用。纖維素酶分子結(jié)構(gòu)和功能的研究使其對(duì)纖維素分子鏈-1,4糖苷鍵作用的底物特異性、水解機(jī)制作出了基本闡明。但關(guān)于CBD是如何吸附到纖維素表面、吸附后CBD是如何與催化區(qū)相互作用降解纖維素的問(wèn)題目前尚未作出合理解釋，因?yàn)樗婕暗嚼w維素聚合物解鏈、解聚等超分子結(jié)構(gòu)的變化。這一問(wèn)題的解決將會(huì)為有效工程菌的構(gòu)建、經(jīng)濟(jì)利用纖維素打下基礎(chǔ)。四、纖維素酶的反應(yīng)機(jī)制纖維素酶反應(yīng)和一般酶反應(yīng)不一樣，其最主要的區(qū)別在于纖維素酶是多組分酶系，且底物結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜。由于底物的水不溶性，纖維素酶的吸附作用

12、代替了酶與底物形成的ES復(fù)合物過(guò)程。纖維素酶先特異性地吸附在底物纖維素上，然后在幾種組分的協(xié)同作用下將纖維素分解成葡萄糖。1950年，Reese等提出了C1-Cx假說(shuō)，該假說(shuō)認(rèn)為必須以不同的酶協(xié)同作用，才能將纖維素徹底的水解為葡萄糖。協(xié)同作用一般認(rèn)為是(C1酶)首先進(jìn)攻纖維素的非結(jié)晶區(qū)，形成Cx所需的新的游離末端，然后由CX酶從多糖鏈的還原端或非還原端切下纖維二糖單位，最后由-葡聚糖苷酶將纖維二糖水解成二個(gè)葡萄糖。不過(guò)，纖維素酶的協(xié)同作用順序不是絕對(duì)的，隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，C1-Cx和-葡聚糖苷酶必須同時(shí)存在才能水解天然纖維素。若先用C1酶作用結(jié)晶纖維素，然后除掉C1酶，再加入Cx酶，如此順序作

13、用卻不能將結(jié)晶纖維素水解。五、酶的應(yīng)用1 在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用曲音波等在對(duì)斜臥青霉發(fā)酵過(guò)程研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合抗性菌株的選育成功地用亞銨紙廠廢液、廢渣生產(chǎn)纖維素酶。他們選用一株抗黑液抑制物的斜臥青霉J UA10，以亞銨法制漿的蒸煮廢液（黑液）和3%的細(xì)小纖維作培養(yǎng)基，采用雙階段變溫培養(yǎng)（生長(zhǎng)溫度34，產(chǎn)酶溫度28）等措施，發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶。在50L發(fā)酵罐中進(jìn)行的全廢料培養(yǎng)基產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)顯示，接種48h后酶活可達(dá)4.61 IU/ml，發(fā)酵周期較短，酶產(chǎn)率達(dá)100IU/(L·h)，單位底物的酶得率達(dá)264IU/g纖維素。通過(guò)使用補(bǔ)料分批技術(shù)，在48h后向發(fā)酵罐中間歇補(bǔ)入少量細(xì)雜纖維，可使酶活進(jìn)一

14、步提高到7.2 IU/ml，但發(fā)酵周期延長(zhǎng)。從開辟新能源和解決環(huán)境污染考慮，以廢纖維為原料生產(chǎn)酒精日益受到重視。造紙廠制漿過(guò)程中篩除的細(xì)雜纖維已經(jīng)過(guò)了機(jī)械粉碎和化學(xué)預(yù)處理，脫去了部分木素，纖維素含量達(dá)60%70%，容易被酶解發(fā)酵，適宜作為酒精發(fā)酵的原料。20世紀(jì)80年代末期采用同時(shí)酶解發(fā)酵和補(bǔ)料技術(shù)，使細(xì)雜纖維的纖維素酒精轉(zhuǎn)化率達(dá)到65%，發(fā)酵液酒精濃度達(dá)4%。后采用全廢料培養(yǎng)基并補(bǔ)加少量由曲霉菌株產(chǎn)生的高-4葡萄糖苷酶活的粗酶液后，可使纖維素的酒精轉(zhuǎn)化率達(dá)70%，原料酒精得率20%，酒精濃度5%以上，可為發(fā)酵工業(yè)所接受。利用備料廢渣配制培養(yǎng)基固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶曲，進(jìn)而酶解細(xì)雜纖維發(fā)酵生產(chǎn)酒

15、精的研究結(jié)果顯示，通過(guò)采用纖維素酶高產(chǎn)菌和-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌的混合培養(yǎng)，或經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化，都可以人為地控制纖維素酶曲的酶系組成，使纖維素的酒精轉(zhuǎn)化率達(dá)到50%以上。采用纖維素淀粉共發(fā)酵技術(shù)，即在纖維廢渣中添加一定量的玉米面，可使酒精產(chǎn)量大幅度提高，達(dá)到了工業(yè)化生產(chǎn)的要求。隨著啤酒生產(chǎn)的快速增長(zhǎng)，啤酒糟對(duì)環(huán)境的污染日益加劇。目前，啤酒糟大多作低價(jià)飼料和肥料直接出售，銷量有限。因其含水量高，不能久貯，易霉?fàn)€，從而造成資源浪費(fèi)。利用纖維素酶水解啤酒糟將酶解液和殘?jiān)謩e進(jìn)行有效利用，可大大提高啤酒糟的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益。梁如玉等利用里斯木霉產(chǎn)生的纖維素酶水解經(jīng)硫酸和高溫、高壓預(yù)處理過(guò)的啤酒糟，在

16、適宜條件下，100g干啤酒糟可水解得10.8g還原糖，酶解液用于培養(yǎng)酵母菌提取麥角固醇，殘?jiān)巧a(chǎn)菌體蛋白飼料的原料。2 在洗滌劑工業(yè)中的應(yīng)用以木霉、曲霉屬等真菌產(chǎn)生的酸性纖維素酶主要是將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖。近年來(lái)，堿性纖維素酶在洗滌劑工業(yè)上的應(yīng)用改變了傳統(tǒng)的去污機(jī)制。堿性纖維素酶與酸性纖維素酶對(duì)底物的作用不同。酸性纖維素酶對(duì)木質(zhì)纖維素的作用是一個(gè)糖化過(guò)程，在多種組分的協(xié)同作用下能得到更多的最終產(chǎn)物葡萄糖；而堿性纖維素酶是一種非全組分的內(nèi)切葡萄糖苷酶，主要與棉纖維中僅占10%左右的非結(jié)晶區(qū)的纖維素分子起作用。棉纖維吸水性好，但污垢侵入后與水分子結(jié)合形成膠狀物而被封閉在纖維素分子結(jié)構(gòu)中，一般

17、洗滌劑不易洗出，而堿性纖維素酶可選擇性地吸附在棉纖維的非結(jié)晶區(qū)，使棉纖維膨松，水合纖維素分解，膠狀污垢脫落。所以，堿性的作用對(duì)象是棉纖維而不是污垢。宋桂經(jīng)等分離一株芽孢桿菌074，經(jīng)過(guò)Sephadex G-100，DEAE-sephadex A-25和Agaorsc 4B三種方法分離純化后，得到一個(gè)單組分堿性纖維素酶，其最適反應(yīng)溫度為50，最適反應(yīng)pH78，不能分解天然纖維素，CMC對(duì)酶的合成無(wú)誘導(dǎo)作用。這給工業(yè)化生產(chǎn)中的發(fā)酵和后處理工藝帶來(lái)極大方便，酶活較穩(wěn)定，添加于洗滌劑中并不明顯降低棉纖維的牢固度，經(jīng)國(guó)家有關(guān)部門測(cè)試，完全符合國(guó)家洗滌劑用酶標(biāo)準(zhǔn)。3 在紡織工業(yè)上的應(yīng)用紡織品的天然纖維素纖

18、維結(jié)構(gòu)復(fù)雜，結(jié)晶度高，利用纖維素酶對(duì)纖維素纖維織物進(jìn)行生物整理后，可使紡織物膨松、柔軟、表面光滑，毛羽、棉結(jié)明顯地被清除，織物光澤和色澤鮮艷度明顯改善。中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的崔福綿等從生霉棉布上分離出一株產(chǎn)纖維素酶復(fù)合物較高的菌株，可用于棉、麻布的拋光處理和牛仔服“石磨”處理，使表面伸出的小纖維末端被除去，有效地減少了織物的起毛和起球，能獲得持久的柔軟度和光滑度，牛仔服用酶水洗比浮石處理?yè)p傷要小，且不要額外的柔軟劑，有利于保護(hù)環(huán)境，使加工服裝的質(zhì)量?jī)?yōu)良。隨著研究工作的不斷深入，纖維素酶的研究越來(lái)越深入，應(yīng)用也越來(lái)越廣。參考文獻(xiàn)1Tilbeurgh H,Tomme P,Claeyssens M

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