反義RNA技術(shù)原理及在疾病治療中的作用

1、反義RNA技術(shù)原理及在疾病治療中的作用 摘要：反義RNA技術(shù)是利用反義RNA能夠與特異靶RNA通過配對(duì)堿基間氫鍵作用而互補(bǔ)配對(duì)，從而在基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯3個(gè)不同水平上參與基因表達(dá)的調(diào)控，來治療各種遺傳性或病毒感染性疾病的一項(xiàng)技術(shù)。本文在討論反義RNA技術(shù)的作用機(jī)制和與反義寡核苷酸技術(shù)的比較的基礎(chǔ)上，擬概述反義RNA的作用機(jī)制、技術(shù)方法與特點(diǎn)、技術(shù)運(yùn)用和存在的問題。相信隨著對(duì)基因功能研究的廣泛開展及基因治療研究的深入，反義RNA技術(shù)必將成為一種有力的工具，在疾病治療中起到重要的作用。關(guān)鍵詞:反義RNA；基因表達(dá)調(diào)控；基因治療 反義核酸技術(shù)是繼基因克隆和重組技術(shù)后分子生物學(xué)領(lǐng)域興起的一種全新的技

2、術(shù)。該技術(shù)由于其核苷酸具有與DNA意義鏈相同的序列且可以選擇性地抑制特定基因的表達(dá)而得名。廣義的反義核酸技術(shù)包括：反義寡核苷酸技術(shù)(antisense oligonucleotides,ASOD)，即直接應(yīng)用一段人工合成的寡聚核苷酸,通過堿基配對(duì)與細(xì)胞內(nèi)核酸結(jié)合,特異的調(diào)節(jié)基因表達(dá)。反義RNA技術(shù)(antisense RNA),是利用基因重組技術(shù),構(gòu)建表達(dá)載體，使其離體或在體內(nèi)表達(dá)出反義的RNA。核酶技術(shù)(ribozyme)核酶是一種可自我催化的特殊的反義RNA，能與靶序列結(jié)合并使之裂解，從而對(duì)特定基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。反義RNA(antisense RNA)是一種本身缺乏編碼能力，但能與特異靶

3、RNA(主要是mRNA)互補(bǔ)的RNA分子，它可通過配對(duì)堿基間氫鍵作用與靶RNA的特定互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合形成雙鏈復(fù)合物，抑制靶RNA的功能,從而調(diào)控基因的正常表達(dá)1。反義RNA技術(shù)的基本原理是利用自然存在的或人工合成的反義RNA，通過基因重組技術(shù)反向插入到合適的表達(dá)載體形成重組DNA,然后轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞，則這一反向插入的序列就會(huì)隨細(xì)胞周期產(chǎn)生大量反義RNA,對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,從而抑制、封閉或破壞靶基因的表達(dá)。選擇具有明顯的生物學(xué)效應(yīng)的靶序列后,反義RNA即通過和相應(yīng)的RNA互補(bǔ)而達(dá)到阻斷其功能的目的。近20多年來,反義RNA技術(shù)已在病毒病、癌癥、遺傳性疾病等疑難疾病的基因治療、動(dòng)植物品種的改良以及生

4、物研究方法的改進(jìn)方面取得了令人矚目的成就。本文在討論反義RNA技術(shù)的作用機(jī)制和與反義寡核苷酸技術(shù)的比較的基礎(chǔ)上,擬概述反義RNA的作用機(jī)制、技術(shù)方法與特點(diǎn)、技術(shù)運(yùn)用和存在的問題。 1反義寡核苷酸技術(shù)與反義RNA技術(shù)1.1反義寡核苷酸技術(shù) 1978年,Zamecnik首先應(yīng)用一種13個(gè)堿基的寡核苷酸抑制Rous肉瘤病毒,取得一定效果1,此后,隨著對(duì)其作用機(jī)制、特異性及藥理作用等研究的深入,其應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。由于ASOD的易降解性,在實(shí)驗(yàn)中通常要對(duì)其進(jìn)行修飾,硫代反義寡核苷酸作為第一代反義寡核苷酸的代表,由于在細(xì)胞毒性、細(xì)胞吸收率等方面存在眾多問題,Agrawal等設(shè)計(jì)了第二代混合骨架的反義寡核

5、苷酸(mixed-backbone oligonucleotides ,MBO),MBO含有至少兩種不同的化學(xué)修飾,在結(jié)構(gòu)上可以是任意兩種或多種修飾的不同排列組合。 MBO不僅保持了核酸酶抗性,而且具有很好的靶序列雜交特異性和相對(duì)較低的毒副作用2。近年來以2-氨基乙基甘氨酸為基本單元的多肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)由于可與互補(bǔ)的RNA或DNA形成穩(wěn)定的PNA/DNA(RNA)雜合鏈并且具有較強(qiáng)的蛋白酶、核酸酶抗性而預(yù)示了其作為反義抑制劑的用途,被稱為第三代反義核酸3,但細(xì)胞對(duì)PNA的吸收效率較低的問題一直沒有得到很好解決。并且,由于寡核苷酸的半衰期較短,有必要反復(fù)

6、應(yīng)用ASOD。事實(shí)上,以上三代寡核苷酸較高的制備成本也是妨礙其廣泛應(yīng)用的因素之一。同時(shí),在反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)上還較盲目,要設(shè)計(jì)出高效的反義寡核苷酸并非易事。相對(duì)而言,包含反義RNA的重組質(zhì)粒則相當(dāng)于具有生物兼容性和生物降解性的長(zhǎng)期釋放裝置。2 反義RNA作用機(jī)制 與ASOD方法相比,設(shè)計(jì)反義RNA時(shí)一般不需要目的基因的詳細(xì)的調(diào)控知識(shí),人們普遍應(yīng)用由翻譯起始位點(diǎn)延伸0.5kb 3.0 kb的片段作為重組質(zhì)粒的(逆向)插入序列。而全長(zhǎng)的cDNA序列一般認(rèn)為沒有必要,尤其當(dāng)目的基因較長(zhǎng)時(shí)。另外,互補(bǔ)于3端非翻譯的序列也往往具有很好效果4。在真核生物中,一般認(rèn)為對(duì)應(yīng)5非編碼區(qū)的反義RNA優(yōu)于針對(duì)編碼區(qū)

7、的反義RNA。包含反義核酸的重組質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出反義mRNA,發(fā)揮抑制基因表達(dá)的作用。目前,具體的作用機(jī)制尚不甚清楚,人們推測(cè)可能有: 反義RNA的作用機(jī)制主要表現(xiàn)在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯3個(gè)水平上。2.1DNA復(fù)制中的作用 反義RNA作為DNA復(fù)制的抑制因子,與引物RNA結(jié)合或作用于引物前體而抑制DNA復(fù)制,從而降低DNA的復(fù)制效率。E.coli的colE1質(zhì)粒復(fù)制的前提是合成適當(dāng)?shù)腞NA(RNA),它自動(dòng)折疊后與DNA模板結(jié)合形成DNA復(fù)制的引物,從復(fù)制起始點(diǎn)上游 445bp處開始,以另一DNA為模板反向轉(zhuǎn)錄的RNA正好與RNA的結(jié)合,阻止了正常引物的產(chǎn)生,從而干擾復(fù)制的進(jìn)行。2.2轉(zhuǎn)錄

8、及轉(zhuǎn)錄后水平的作用 反義RNA與mRNA 5末端互補(bǔ)結(jié)合,阻斷帽子結(jié)構(gòu)形成;作用于外顯子和內(nèi)含子的連接區(qū),阻礙前mRNA剪接;作用于polyA形成位點(diǎn),阻礙mR-NA的成熟及其向胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)。在crp基因的ticRNA(transcription inhibitory complementary RNA)負(fù)向自我調(diào)控中,ticRNA與crp mRNA的5端結(jié)合,形成類似于RNA聚合酶識(shí)別的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的二級(jí)結(jié)構(gòu),以反式作用對(duì)轉(zhuǎn)錄過程本身進(jìn)行調(diào)控5。2.3翻譯水平的作用 反義RNA可直接與mRNA的SD序列(含RBS)或編碼區(qū)(主要是AUG)結(jié)合,從空間上直接阻止核糖體的正常結(jié)合或可直接降解靶mRN

9、A。反義RNA與mRNA在SD序列配對(duì)形成吻觸復(fù)合體或在互補(bǔ)區(qū)段結(jié)合形成RNA- RNA雙鏈結(jié)構(gòu),從而調(diào)控翻譯的進(jìn)行。在真核生物細(xì)胞中有許多RNA在翻譯水平上表現(xiàn)反義RNA的功能。如雞胚胎肌漿中存在的富含U的小分子RNA稱為tcR-NA,它們可以與肌球蛋白重鏈的RNA的polyA尾雜交而抑制正常的翻譯過程。Audrey等6的研究表明FGF- AS RNA在翻譯過程能有效地抑制FGF- 2在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。 反義RNA的重組DNA中只有啟動(dòng)子及終止子,當(dāng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,重組DNA能自動(dòng)表達(dá)反義RNA,并且重組DNA自身可以整合到宿主的基因組DNA中,或作為“附加體”長(zhǎng)期存在。在原核細(xì)胞中,反義

10、RNA以針對(duì)SD序列效果最好,而在真核細(xì)胞中以5端非編碼區(qū)為標(biāo)靶最有效。3 反義RNA技術(shù)方法3.1反義表達(dá)載體的構(gòu)建 一般應(yīng)用RT-PCR技術(shù)克隆出部分目的cDNA,并在兩端加上限制性酶切位點(diǎn)倒向插入真核表達(dá)載體中,載體一般要含有下游的polyA尾以保證轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定。為確定插入方向可應(yīng)用限制性內(nèi)切酶酶切或直接測(cè)序,曹國(guó)棟等人曾介紹一種PCR鑒定重組體DNA插入方向及轉(zhuǎn)染的方法7,可有效解決酶切困難或無適當(dāng)位點(diǎn)可供選擇的問題。下面是一些常用的真核表達(dá)載體:應(yīng)用較廣的是含SV40(simian virus 40)、RSV(Rous sarcoma virus)或CMV (cytomegalov

11、irus)的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的質(zhì)粒載體。尤其CMV的早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件可有效的應(yīng)用于各種人及鼠源的腫瘤細(xì)胞系。含EBV(Epstein-Barrvirus)復(fù)制起點(diǎn)的載體,可編碼核抗原(EBV nuclear antigen),可以以“附加體”形式在細(xì)胞中復(fù)制,避免了整合入染色體基因組所帶來的位置效應(yīng)。在應(yīng)用反義RNA技術(shù)研究原癌基因在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及凋亡的調(diào)控機(jī)制時(shí),人們發(fā)現(xiàn)反義RNA對(duì)一些原癌基因表達(dá)抑制的同時(shí)抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng),從而不利于轉(zhuǎn)化子的篩選8。一種解決辦法是選擇可誘導(dǎo)型的表達(dá)載體,使得篩選后在誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)作用下表達(dá)出反義RNA并發(fā)揮反義作用。1982年,Karin等構(gòu)建含金屬硫

12、蛋白-型(MT- )啟動(dòng)子的可誘導(dǎo)型載體,在適當(dāng)誘導(dǎo)條件下(如Zn2+、Cd2+等)才能啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄9。應(yīng)用此類載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染已取得良好效果。構(gòu)建此類載體時(shí)要注意的是誘導(dǎo)物對(duì)生物體可能產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng),尤其是毒副作用。近年來出現(xiàn)了一類高效且誘導(dǎo)劑生物效應(yīng)較小的雙載體系統(tǒng),如pVgRXR/pIND(Invitrogen),pTet/pTRE (Clontech),其原理是第一種質(zhì)粒能夠表達(dá)能與誘導(dǎo)劑結(jié)合的蛋白,細(xì)胞在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了第一種質(zhì)粒后,再轉(zhuǎn)染第二種含目的基因片段或反義片段的質(zhì)粒,而第二種質(zhì)粒的表達(dá)受控于能被第一種質(zhì)粒所表達(dá)的蛋白所激活的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。 pTet/pTRE載體系統(tǒng)已成功地應(yīng)用

13、于細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)基因小鼠10。但對(duì)于某些細(xì)胞系,四環(huán)素結(jié)合蛋白的高表達(dá)對(duì)其有一定的毒副作用。3.2基因的導(dǎo)入(轉(zhuǎn)染)磷酸鈣法、電轉(zhuǎn)法、基因槍是體外實(shí)驗(yàn)中DNA轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的常用方法。脂質(zhì)體不僅常用于體外實(shí)驗(yàn)中載體DNA對(duì)細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染,也用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)染過程。脂質(zhì)體能提高分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞對(duì)核酸的攝取,并保護(hù)其不被降解。優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單,細(xì)胞吸收較好。缺點(diǎn)是包埋的DNA量不確定,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在特定組織如肝臟吸收的傾向性,及對(duì)某些組織如腦有一定毒性。在此基礎(chǔ)上人們逐漸開發(fā)出具有一定良好特性的轉(zhuǎn)染試劑如pH-敏-脂質(zhì)體。各類受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染試劑往往使轉(zhuǎn)染更接近自然的生理過程(如基于轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)

14、的核酸轉(zhuǎn)染試劑),不僅可能降低毒副作用還可因受體的特異分布而具有轉(zhuǎn)染的組織或細(xì)胞特異性。另一種轉(zhuǎn)化策略是以病毒作為載體,同時(shí)利用了病毒的轉(zhuǎn)染特性。 rAAV-AS(AAV, adeno-associated virus,腺病毒輔助性病毒)以其安全、高效而廣泛應(yīng)用于反義RNA技術(shù)及基因治療。它幾乎可以轉(zhuǎn)染所有哺乳動(dòng)物,但對(duì)其他動(dòng)物,如家禽,目前尚未建立起其AAV系;并且,由于它的轉(zhuǎn)染是細(xì)胞膜上受體介導(dǎo)的,哺乳動(dòng)物的AAV不能用于家禽的轉(zhuǎn)染11。逆轉(zhuǎn)錄病毒在快速分裂的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率也相當(dāng)高,這使它常被作為載體應(yīng)用于腫瘤的治療中,它可應(yīng)用于哺乳動(dòng)物及禽類。其不足是它只在快速分裂的細(xì)胞中起作用,這使它

15、的應(yīng)用范圍受到一定限制11。一般認(rèn)為體內(nèi)的轉(zhuǎn)染需要借助基因的導(dǎo)入系統(tǒng)(gene deliver system),Wolff和Malone等人于1990年用表達(dá)-gal及熒光酶基因的質(zhì)粒分別對(duì)小鼠肌肉進(jìn)行直接體內(nèi)注射,在注射區(qū)域的肌細(xì)胞檢測(cè)到該基因的表達(dá)12。直接注射法僅對(duì)骨骼肌細(xì)胞有效,人們推測(cè)可能與骨骼肌的多細(xì)胞核、存在胞環(huán)流等結(jié)構(gòu)特性有關(guān)。為檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率,人們往往選用-gal或pEGFP等報(bào)道基因。3.3檢驗(yàn)、結(jié)果分析 在以反義RNA表達(dá)載體進(jìn)行細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí),應(yīng)設(shè)置空載體轉(zhuǎn)染的對(duì)照實(shí)驗(yàn),以排除外源載體DNA的導(dǎo)入帶來的生物學(xué)或免疫學(xué)效應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)中基因產(chǎn)物的活性、細(xì)胞的增殖、分

16、化等生物學(xué)參數(shù),體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物本身的一些生物學(xué)表型的改變均是不可忽略的重要指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上分子生物學(xué)水平的分析主要有以下幾個(gè)方面:除了以正義探針檢驗(yàn)反義RNA的表達(dá)情況外,我們更關(guān)心的是靶基因的表達(dá)情況。應(yīng)用進(jìn)行中的核轉(zhuǎn)錄分析(nuclear run on transcription assay)能夠較可靠的測(cè)定基因轉(zhuǎn)錄活性。對(duì)mRNA水平的檢驗(yàn)方法除了Northern印跡,RNA保護(hù)試驗(yàn)(RNase protection assay)靈敏度更高,并且可以進(jìn)行較準(zhǔn)確的定量分析。由于目前反義RNA抑制靶基因表達(dá)的原理尚在研究之中,而反義RNA抑制靶基因表達(dá)的過程中并不一定伴隨著mRNA水平的降低

17、13,所以檢測(cè)反義抑制效果的較為客觀的標(biāo)準(zhǔn)是相應(yīng)蛋白水平的變化。 Western印跡,ELISA,流式細(xì)胞分析法(flow cytometry)均是常用的分析技術(shù)。免疫組化技術(shù)、免疫熒光技術(shù)由于不能很好的定量而一般避免使用。4 反義RNA技術(shù)的特點(diǎn)4.1特異性強(qiáng) 反義RNA在宿主細(xì)胞內(nèi)可以特異性地識(shí)別、關(guān)閉某一基因,阻斷靶基因的表達(dá),甚至可以選擇性地抑制單一啟動(dòng)子控制的多基因區(qū)內(nèi)某一基因的表達(dá),而不影響其它基因的表達(dá)14。4.2操作簡(jiǎn)便,靶mRNA范圍廣 可以大量地設(shè)計(jì)合成反義RNA(或反義RNA片段),僅需要知道病毒、基因或病變細(xì)胞的序列信息及其編碼蛋白的功能。多個(gè)反義RNA可同時(shí)封閉多個(gè)基

18、因,在核內(nèi)和胞漿中都能發(fā)揮作用,用于治療多種疾病。4.3安全性好 反義RNA只與特定的mRNA結(jié)合,不會(huì)因改變基因結(jié)構(gòu)而引起突變,在劑量多的情況下可以被RNase水解。與合成藥物相比,副作用較小。而且將含有反義RNA基因的載體引入原代細(xì)胞,可形成持續(xù)穩(wěn)定的感染細(xì)胞系,使后代具有遺傳的抗病毒或抗病特性。5反義RNA技術(shù)的應(yīng)用 反義RNA技術(shù)已可用來治療由基因突變或過度表達(dá)導(dǎo)致的疾病和嚴(yán)重感染性疾病。5.1抗癌作用 從癌組織中分離出mRNA,合成相應(yīng)的反義RNA。將反義RNA引入癌細(xì)胞阻止癌基因的表達(dá),抑制癌蛋白的產(chǎn)生,從而可控制細(xì)胞的惡性增殖。桑建利等15利用構(gòu)建了的細(xì)胞周期蛋白E反義RNA真核

19、載體轉(zhuǎn)入人乳腺癌細(xì)胞時(shí),也發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞成集落能力顯著下降。Steiner等16在反轉(zhuǎn)錄病毒載體上構(gòu)建了包括起始位點(diǎn)在內(nèi)的750bp的反義RNA,經(jīng)PA317包裝成反轉(zhuǎn)錄病毒皮下注入,發(fā)現(xiàn)能抑制裸鼠DN145移植瘤生長(zhǎng)94.5%,其中2只小鼠腫瘤消失。Keiichiro等17采用反義RNA阻斷齲齒類動(dòng)物和人類腫瘤細(xì)胞的表型結(jié)構(gòu)形成中,把載有反義RNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人的乳頭狀瘤病毒(HPV)陰性C33細(xì)胞、HPV- 16陽(yáng)性SiHa細(xì)胞和HPV- 18陽(yáng)性HeLa細(xì)胞S3中進(jìn)行反轉(zhuǎn)克隆。發(fā)現(xiàn)反義的克隆形成的集落數(shù)明顯少于野生型克隆的集落數(shù)。此結(jié)果表明用反義RNA能夠很強(qiáng)地阻斷裸鼠中致癌性細(xì)胞。Volk

20、er等18的研究結(jié)果同樣也證明了反義RNA能夠有效阻斷HeLa細(xì)胞中的基因表達(dá)。另有研究表明反義RNA可以通過阻止組織蛋白酶- L的表達(dá)進(jìn)而降低惡性的腫瘤發(fā)生能力19。綜上可見,反義RNA可以特異性地抑制癌基因的異常表達(dá)或抑制腫瘤癌細(xì)胞特異蛋白質(zhì)的表達(dá),誘導(dǎo)腫瘤癌細(xì)胞調(diào)亡,因而可應(yīng)用于癌癥的發(fā)病機(jī)制和治療研究。5.2抗病毒的研究 在治療病毒性感染疾病上,由于病毒核酸的序列比較明確,易于人工合成相應(yīng)的反義寡聚核苷酸,來抑制病毒基因的表達(dá)。反義RNA技術(shù)已用于抑制乙肝病毒(HBV)、皰疹病毒(HIV)、AIDS病毒等病毒的研究。Morgan等(1996)的研究表明HIV的反式激活蛋白反應(yīng)順序(TA

21、R)與TAT蛋白結(jié)合可促進(jìn)HIV轉(zhuǎn)錄,當(dāng)用反義TAR封閉TAR時(shí),即可終止HIV的轉(zhuǎn)錄。姚志強(qiáng)等20針對(duì)不同靶位設(shè)計(jì)了10段互補(bǔ)反義核酸(DNA片段),經(jīng)模型篩選發(fā)現(xiàn)針對(duì)S基因起始區(qū)、SP2增強(qiáng)子帽區(qū)和polyA信號(hào)編碼區(qū)的asONs作用最強(qiáng),揭示反調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄/翻譯起始區(qū)的反義核酸具有明顯的抗病毒作用。Gabor等(1998)使用內(nèi)源性表達(dá)抗HIV- 1的pol.vif和enr基因,以及3- LTR序列的反義RNA方案,構(gòu)建了MuLVLTR啟動(dòng)子逆轉(zhuǎn)錄病毒重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)錄CD4+淋巴細(xì)胞系,結(jié)果表明反義RNA能高效地穩(wěn)定表達(dá),反義envRNA能夠最有效地抑制HIV- 1的復(fù)制,并且反義polR

22、NA使P24抗原減少了100- 1000倍。Carol等21的研究表明,反義RNA能有效地阻斷La Crosse病毒(LCV),并且來自dengne Viruses區(qū)的反義RNA更能有效阻止同源病毒的復(fù)制,且阻斷時(shí)間和最小片段的反義RNA都能確定,它可以彌補(bǔ)接種等傳統(tǒng)方法存在的不易達(dá)到阻止效果和效率較低的缺點(diǎn)。反義RNA還用于研究甲型流感病毒(AIV)及乳頭瘤病毒(HPV)17復(fù)制及基因表達(dá)的抑制。另外,國(guó)內(nèi)外在應(yīng)用反義RNA技術(shù)培育抗病(如豬瘟、抗雞馬立克氏病等)動(dòng)物品系方面也取得比較明顯的進(jìn)展。5.3在其它方面的研究 反義RNA技術(shù)還可用于腸道疾病(Rotbart etal.,1988)、

23、心血管疾病22、-地中海貧血23、調(diào)節(jié)衰弱心臟中肌細(xì)胞的Ca2+泵體內(nèi)平衡24、G蛋白防止高血壓、肝纖維化等多種疾病的研究25。Don-ald等26的研究發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲的clag9基因?qū)D36細(xì)胞的粘鏈?zhǔn)潜夭豢缮俚?而將clag9的反義RNA結(jié)構(gòu)導(dǎo)入3D7克隆中進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)粘鏈的C32黑素瘤細(xì)胞比原始型少15折疊,由此反義RNA也可用于瘧疾的轉(zhuǎn)染治療。Agnes等27在對(duì)高加索人中的一種常染色體隱性疾病(遺傳性血色素沉著)研究中發(fā)現(xiàn),它是由HFE基因編碼MHC分子而造成的,HFE基因的5'端調(diào)節(jié)其表達(dá),采用無開放閱讀框的HFE的反義RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi),發(fā)現(xiàn)反義RNA在所有試驗(yàn)的組織和

24、細(xì)胞中都得到表達(dá),顯著地抑制了HFE基因的表達(dá)。6反義RNA技術(shù)應(yīng)用中的問題 反義RNA技術(shù)的研究尚處于初級(jí)階段,但迄今的研究結(jié)果表明,該技術(shù)作為具有高度專一性的基因表達(dá)的反義抑制劑是很有希望的。在基礎(chǔ)研究方面,反義RNA技術(shù)不僅用于基因分析,還可用來制備C-縮短的多肽,以研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)活性關(guān)系而無須使基因變異;研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞分化及癌變的發(fā)生、發(fā)展過程等等。在應(yīng)用研究方面,反義RNA藥物可以特異性的抑制癌基因的異常表達(dá)或抑制腫瘤細(xì)胞特異蛋白質(zhì)的表達(dá),誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;在抗病原微生物感染方面,針對(duì)其特異基因的反義核酸可較好的阻止其對(duì)人體的侵害,反義核酸技術(shù)用于抗癌、抗病毒的基因療法方面已

25、有大量報(bào)道,包括對(duì)HIV、HSV等的防治。其他方面,如防治高血壓、肝纖維化等多種疾病。人們正在發(fā)掘更廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。但反義RNA技術(shù)也存在一些問題，下面就是主要的問題。6.1反義RNA片段的特異性問題 多少長(zhǎng)度的反義RNA片段才能最有效地結(jié)合靶mRNA;對(duì)于不同種屬、不同的組織和器官的病變細(xì)胞,分別需要設(shè)計(jì)多少長(zhǎng)度的高效反義RNA片段;對(duì)應(yīng)的是5'端還是3'端;是編碼區(qū)還是非編碼區(qū)等問題都需進(jìn)一步研究,以達(dá)到特異性的抑制效果。動(dòng)物體某一器官、組織或系統(tǒng)中細(xì)胞發(fā)生病變往往是個(gè)體特定基因的失控或有害基因表達(dá)造成的,在基因治療時(shí),必須針對(duì)病變的特殊細(xì)胞,而對(duì)其它細(xì)胞影響較小為佳,甚至

26、無影響。因此反義RNA的基因治療必需特異性、專一性地轉(zhuǎn)移到病變細(xì)胞抑制其表達(dá),只有這樣才能最有效地發(fā)揮作用。6.2制備反義RNA的費(fèi)用和使用效率的問題 應(yīng)用Q復(fù)制酶、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)合成反義RNA,耗資較大。隨著科技的發(fā)展,準(zhǔn)確地合成所需反義RNA的技術(shù)一定能得到完善和提高。目前,已經(jīng)在體外合成反義RNA,直接作用于培養(yǎng)細(xì)胞,反義RNA在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮作用。還有就是構(gòu)建一些轉(zhuǎn)錄特異反義RNA的重組DNA,將這些重組DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞,讓其在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄反義RNA而發(fā)揮作用。但反義RNA的堿基序列、反義RNA中無效的長(zhǎng)度、含量、靶序列結(jié)合部位和反義RNA的濃度等也都影響到使用效率。而且反義RNA和靶m

27、RNA的發(fā)卡、內(nèi)部環(huán)等二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)以及復(fù)雜的環(huán)環(huán)結(jié)構(gòu)都影響反義抑制效率28 30。 7結(jié)語(yǔ) 經(jīng)過近20年的研究,反義RNA技術(shù)已得到逐步完善并開始應(yīng)用到醫(yī)療實(shí)踐中。目前對(duì)反義RNA的轉(zhuǎn)染效率、特異性及治療時(shí)反義RNA的用量、持續(xù)時(shí)間和進(jìn)入機(jī)體的有效途徑等都進(jìn)行了量的研究。采用反義RNA表達(dá)載體和受體介導(dǎo)能進(jìn)一步提高反義RNA的特異性;脂質(zhì)體和含有核酶的嵌合性運(yùn)送反義RNA;核內(nèi)反義RNA作為治療因子避免了在細(xì)胞漿需抑制極其巨大數(shù)量的靶RNA則提高了抑制率,減少了反義RNA用量,擴(kuò)寬了抑制治療范圍;在體內(nèi)可誘導(dǎo)性調(diào)控序列的嵌入則更加提高了反義RNA技術(shù)的應(yīng)用。在人類基因組計(jì)劃完成,后基因組計(jì)劃

28、已漸進(jìn)開展的基礎(chǔ)上,反義RNA技術(shù)將不斷改進(jìn)和發(fā)展,并將在基因的鑒定克隆和各種疾病的治療上發(fā)揮重大的作用。參考文獻(xiàn):1 Simons R W. Naturally occurring antisense control- A brief reviewJ. Gene, 1988,(72): 35- 44.2 Agrawal S.Proc Natl Acid Sci USA, 1997, 94(6): 2620-2625.3 Hanvey JCet al . Science, 1992,258: 1481-1485.4 Dean Net al . Cancer Res,1996, 56: 3499

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