乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、乙型肝炎病毒（HBV 核酸定量檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（PCR 熒光探針法）1. 目的：規(guī)范乙型肝炎病毒（HBV 核酸定量檢測操作流程，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。2. 應(yīng)用范圍：HBV DNA 熒光定量檢測。3. 職責(zé)：3.1 文件編寫：實驗室技術(shù)員。3.2 文件審核：實驗室主管。3.3 文件審批：實驗室主任。3.4 執(zhí)行：PCR 實驗室所有工作人員。4. 參考文獻(xiàn)：4.1 中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司乙型肝炎病毒（ HBV 核酸定量檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）說明 書。4.2 中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司核酸擴(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)DA7600 型使用說明書。5. 內(nèi)容：5.1 檢測方法：PCR 熒光探針法

2、。5.2 實驗原理：用一對乙型肝炎病毒特異性引物和一條乙型肝炎病毒特異性熒光探針，配以PCE 反應(yīng)液、耐熱 DN 驟合酶（Taq 酶）、核苷酸單體（dNTPs）等成分，通過 PCR 體外擴(kuò)增法，即高溫變性、低溫退火、 適溫延伸進(jìn)行 DNAT 增，并對 PC 雀過程進(jìn)行實時監(jiān)測，從而定量檢測乙型肝炎病毒DNA5.3 性能參數(shù)：5.3.1精密度：檢測下限為 5.0 x102IU/ml。5.3.2線性范圍：1.0 x1031.0 x108IU/ml。5.4 標(biāo)本采集：由合作單位按照以下要求進(jìn)行采集5.4.1 標(biāo)本類型：血清。5.4.2 標(biāo)本采集：用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血 2 毫升，注入無菌

3、的干燥玻璃管， 室溫（2225C）放置 3060 min，全血標(biāo)本可自發(fā)完全凝集析出血清，或直接使用水平離心機(jī)，1500 rpm 離心 5min ;吸取上層血清，轉(zhuǎn)移至 1.5ml 滅菌離心管。5.4.3 標(biāo)本保存：標(biāo)本可立即用于測試，也可以保存于-20C待測，保存期為 6 個月，應(yīng)避免反復(fù)凍融。5.4.4 運送條件：標(biāo)本運送采用 0C冰壺。5.4.5 標(biāo)本拒收標(biāo)準(zhǔn)：污染、嚴(yán)重溶血、脂血類或肝素抗凝劑標(biāo)本。5.5 設(shè)備和試劑：5.5.1 設(shè)備：DA7600 熒光定量 PCR 儀、低速水平離心機(jī)、生物安全柜、臺式高速離心機(jī)、移液器、混勻器、 恒溫水浴箱/干式恒溫器、冰箱（4C、-20C）、移動/

4、固定紫外燈、冷凍離心機(jī)。5.5.2試劑:5.521試劑品牌：乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒(PCR 熒光探針法)5.522試劑批準(zhǔn)文號：國食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2014 第 3400032 號。5.523試劑組成：組分名稱規(guī)格數(shù)量核酸提取試劑DNAt 取液 14.5ml/ 瓶2口TX I7H曰 4 -+/. 口陽性質(zhì)控品250ul/ 管1HBV 雖陽性質(zhì)控品250ul/ 管1HBV 缶界陽性質(zhì)控品250ul/ 管1250ul/ 管1質(zhì)控口仃及陽性定量參考口仃HBX 陽日性定量參考品(2.0X10 IU/ml )HBW 日性定量參考品(2.0X105IU/ml )250ul/ 管1HBW 日性定量參考

5、品(2.0X104IU/ml )250ul/ 管1HBW 日性定量參考品(2.0X103IU/ml )250ul/ 管1PCR 僉測試劑HBV 內(nèi)標(biāo)溶液100ul/ 管1HBV-PC 反 應(yīng)管1 人份/管205.5.2.4試劑保存和有效期：保存于-20 5C;有效期 9 個月。5.5.2.6 質(zhì)控品：由康切斯坦購買質(zhì)控品。質(zhì)控水平S4。5.6 操作過程：5.6.1 血清標(biāo)本與質(zhì)控品的處理：待測樣本、陽性定量參考品、陰性質(zhì)控品、HBV 雖陽性質(zhì)控品、HBV 缶界陽性質(zhì)控品進(jìn)行同步處理。561.1打開恒溫水浴箱或干式恒溫器，設(shè)定溫度100C。5.6.1.2 從試劑盒中取出 DN 提取液I、內(nèi)標(biāo)溶液、陰性質(zhì)控品、HBX 陽性定j量參考品。從冰箱取出陽性質(zhì)控品，讓其在室溫下完全融化。5.6.1.3取 450ul DNA 提取液I和4ul 內(nèi)標(biāo)溶液，分別加到 1.5ml 的滅菌離心管中并編號。5.6.1.4將 DNA 提取液 I、陰性質(zhì)控品于振蕩混勻器振蕩5s, 6,000rpm 離心 5s。5.6.1.5往裝有 450ul DNA 提取液 I 和內(nèi)標(biāo)溶液的滅菌離心管中加入待測樣本血清和陽性質(zhì)控品各200u