飲用水單一毒性快速檢測方法--作品(論文)(1)匯總

1、飲用水單一毒性快速檢測方法學(xué)院：資源與材料學(xué)院作者：馮茹 伍艷馨 郝曉霞 李敏 閆凱麗 劉梅杰 張承基摘要：本文主要利用淡水發(fā)光菌-青?；【鷔67檢測CdCl2、HgCl2、K2Cr2O7的單一毒性以及聯(lián)合毒性，探究在安全范圍內(nèi)的飲用水評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)數(shù)據(jù)通過線性回歸分析后計(jì)算EC50值，對比不同重金屬化合物對青?；【挠绊憽ｊP(guān)鍵詞：發(fā)光菌 ；飲用水；快速檢測 ；重金屬化學(xué)物中圖分類號：X131.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A1 引言 隨著工業(yè)和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，飲用水的安全性也受到了一定的影響。現(xiàn)今，由于各種飲用水污染事故的頻發(fā)，使得人們對飲用水的安全更加重視，相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜覍ζ溥M(jìn)行了一系列的研究。因?yàn)榘l(fā)

2、光菌具有靈敏度高、檢測快速的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于重金屬化合物的急性毒性檢測中。本文利用青?；【鷻z測汞、鎘、鉻的單一毒性，比較不同重金屬對發(fā)光菌的抑制程度以及時(shí)間對發(fā)光菌的影響。其中將汞作為標(biāo)準(zhǔn)毒物。2 發(fā)光菌簡介2.1發(fā)光菌在毒性檢測中的作用原理發(fā)光細(xì)菌法是利用靈敏的光電測量系統(tǒng)測定毒物對發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的影響判斷毒物毒性的大小。發(fā)光細(xì)菌含有熒光素?zé)晒饷傅劝l(fā)光要素在有氧條件下通過細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)會產(chǎn)生微弱熒光。當(dāng)細(xì)胞活性升高處于積極分裂狀態(tài)時(shí)其含量高發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)，發(fā)光細(xì)菌在毒物作用下細(xì)胞活性下降，含量水平下降導(dǎo)致發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)降低。實(shí)驗(yàn)顯示毒物濃度與菌體發(fā)光強(qiáng)度呈線性負(fù)相關(guān)關(guān)系，因而可以根據(jù)發(fā)光細(xì)

3、菌發(fā)光強(qiáng)度判斷毒物毒性大小，用發(fā)光度表征毒物所在環(huán)境的急性毒性。2.2發(fā)光菌應(yīng)用現(xiàn)狀近年來水污染問題日益嚴(yán)重，成為嚴(yán)重威脅人類生命健康成為世界性的環(huán)境治理難題。 科學(xué)研究工作者已開發(fā)出許多靈敏有效的環(huán)境監(jiān)測方法這些方法可以劃分為兩類：分析技術(shù)和生物監(jiān)測。分析技術(shù)常常用于廢水常規(guī)指標(biāo)的測試但不能反應(yīng)水質(zhì)綜合毒性的大小。傳統(tǒng)的生物監(jiān)測以水蚤藻類或魚類為受試對象雖然能反映毒物對生物的直接影響。但是這些方法的最大缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)周期長實(shí)驗(yàn)過程比較繁瑣。針對傳統(tǒng)生物毒性檢測方法的不足，作為一種新型的生物監(jiān)測技術(shù)發(fā)光細(xì)菌法表現(xiàn)出了以下四個(gè)突出的特點(diǎn)：（1） 靈敏、快速且容易進(jìn)行（2） 發(fā)光菌容易培養(yǎng)（3） 可以

4、用來檢測污染物有無致癌作用（4） 青?；【鷥H需要達(dá)到生理鹽水（0.85%的鹽度）的滲透壓環(huán)境即可。 除此之外，它不僅能測定單因子指標(biāo)還能快速準(zhǔn)確測出環(huán)境的綜合毒性指標(biāo)具有理化法無可比擬的優(yōu)勢因此發(fā)光細(xì)菌法近年來受到了環(huán)境工作者的廣泛關(guān)注。3 實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑3.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器（1）BHP9511水質(zhì)毒性快速檢測儀 北京濱松光子技術(shù)有限公司（2）移液槍 Dragon Laboratory Instruments Limited（3）BT223S型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑試劑名稱等級廠家Hgcl2分析純（AR）天津科密歐化學(xué)試劑有限公司

5、K2Cr2O7分析純（AR）天津科密歐化學(xué)試劑有限公司CdCl2H2O分析純（AR）天津科密歐化學(xué)試劑有限公司復(fù)蘇液 北京濱松光子技術(shù)有限公司滲透壓調(diào)節(jié)液北京濱松光子技術(shù)有限公司3.2 實(shí)驗(yàn)材料（1） 模擬配制不同濃度梯度的重金屬溶液通過查閱文獻(xiàn)，找到合適的濃度范圍，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置一組合適的單一毒性的濃度梯度。（2） 菌種的選取由北京濱松光子技術(shù)有限公司提供的青海弧菌（Vibrio qinghaien- sissp.nov.）Q67小種作為實(shí)驗(yàn)菌種。3.3 實(shí)驗(yàn)方法3.3.1 發(fā)光菌的工作條件及復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)室溫度控制在2025范圍，同一批樣品在測定過程中溫度波動不超過1，且所有測試器皿及試劑、溶

6、液測前1h均置于控溫的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。取一支青?；【鶴67小種凍干粉安培瓶，在20室溫下平衡15min，加入0.5ml復(fù)蘇液，手持安培瓶振蕩，充分混勻菌液，20室溫下平衡15min。3.3.2 單一毒性EC50的測定取2mL測試管，每個(gè)濃度點(diǎn)設(shè)兩個(gè)平行，每個(gè)平行含2支樣品管和2支空白對照管，將測試管放好，依次加入2mL復(fù)蘇稀釋液和重金屬樣品溶液（經(jīng)滲透壓調(diào)節(jié)液調(diào)節(jié)后）。用10-100錯誤!未找到引用源。L的移液槍準(zhǔn)確吸取50錯誤!未找到引用源。L復(fù)蘇菌液，逐一加入各管，輕輕振蕩。每管在加菌液的當(dāng)時(shí)精確計(jì)時(shí)，記錄到秒，即為樣品與發(fā)光菌反應(yīng)起始時(shí)間，每管加菌液間隔時(shí)間控制在5s，自加菌液時(shí)間起15min

7、后，將測試管放入生物毒性測試儀內(nèi)，測定發(fā)光量。3.4 數(shù)據(jù)處理及評價(jià)方法發(fā)光菌的相對發(fā)光強(qiáng)度和發(fā)光抑制率都可以作為毒性表征參數(shù)，二者的計(jì)算公式分別表達(dá)如下： 相對發(fā)光強(qiáng)度（%）=錯誤!未找到引用源。 發(fā)光抑制率（%）=1相對發(fā)光強(qiáng)度 其中，相對發(fā)光強(qiáng)度數(shù)值越大，樣品的毒性越小，而發(fā)光抑制率數(shù)值越大，樣品的毒性越大。本文研究用青海弧菌Q67小種與樣品作用15min時(shí)的相對發(fā)光度作為毒性表征參數(shù)。使用發(fā)光抑制率等于50%時(shí)樣品的濃度值EC50來表達(dá)，EC50是指能引起50%最大效應(yīng)的濃度。EC50越小，相應(yīng)的重金屬毒性越大。通過比較不同重金屬的EC50來衡量各重金屬對發(fā)光菌的毒性大小。4 不同重金

8、屬對發(fā)光菌的毒性作用4.1 選用的劑量-效應(yīng)擬合函數(shù)一般來說，劑量-效應(yīng)數(shù)據(jù)的建模是基于沒有隨機(jī)性和誤差的假設(shè)，效應(yīng)可以通過確定的函數(shù)關(guān)系由濃度預(yù)測出來。根據(jù)試驗(yàn)值與擬合值之間的相關(guān)系數(shù)R2選擇最優(yōu)回歸模型。R2越接近1，模型的預(yù)測能力越強(qiáng)。通過多種曲線的擬合試驗(yàn)，本文選用最優(yōu)回歸模型（Slogistic1）對劑量-效應(yīng)曲線進(jìn)行擬合。模型參數(shù)中，XC表示曲線對原點(diǎn)的相對位置，XC越大整個(gè)劑量-效應(yīng)曲線水平位移越大。a值描述曲線的斜率，a值的大小與重金屬離子的毒性在不同濃度范圍內(nèi)的變化趨勢成負(fù)相關(guān)，也即與劑量-效應(yīng)曲線的陡度成負(fù)相關(guān)關(guān)系，當(dāng)a增大時(shí)，曲線陡度變緩。 表4.1本文選用的述“S”型曲

9、線的函數(shù)函數(shù)類型解析式Slogistic1y = a/(1 + exp(-k*(X-XC)經(jīng)典化學(xué)中特別是分析化學(xué)中廣泛應(yīng)用最小二乘擬合技術(shù)來描述分析物濃度與響應(yīng)信號間的關(guān)系。在本文研究中，對重金屬發(fā)光菌的生物毒性檢測結(jié)果的評價(jià)與預(yù)測，同樣采用的是非線性最小二乘擬合技術(shù)對劑量-效應(yīng)曲線進(jìn)行擬合。具體做法為：以不同劑量對發(fā)光菌的發(fā)光抑制率作圖，橫軸表示重金屬溶液的濃度，縱軸表示測得的發(fā)光菌的發(fā)光抑制率，然后用非線性最小二乘技術(shù)進(jìn)行擬合。非線性最小二乘方法的編程實(shí)現(xiàn)對于普通實(shí)驗(yàn)室尚有困難，但是我們可以應(yīng)用Origin軟件的非線性最小二乘擬合工具實(shí)現(xiàn)對劑量-效應(yīng)曲線的擬合。通過對各個(gè)重金屬的劑量-效

10、應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合操作，得到參數(shù)a、K、XC、R2以及一條“S”型曲線，由此可以計(jì)算出各重金屬對發(fā)光菌的EC50值。4.2 Hg2+對發(fā)光菌的劑量效應(yīng)曲線單因子試驗(yàn)得出一系列梯度濃度的相對發(fā)光抑制率，取穩(wěn)定性最好的一組。通過劑量-效應(yīng)曲線所得Hg對發(fā)光菌的劑量-效應(yīng)關(guān)系如圖所示。表4.2 Hg對發(fā)光菌的劑量-效應(yīng)分析溶液質(zhì)量濃度/(mgl-1) 0 0.060.080.10.120.140.160.18Hg抑制發(fā)光度0 20.330.539.965.486.29497.1曲線回歸分析 y = 97.1/(1 + exp(-47.63346*(x-0.09694) R2=0.9863Hg對發(fā)光

11、菌的劑量-效應(yīng)曲線圖4.2 Hg對發(fā)光菌影響 由上式算得Hg的EC50值為0.104mg/L. 從中可知，XC表示曲線對原點(diǎn)的相對位置，XC為0.09654，曲線偏離Y軸的水平位移較大。a值為97.1，說明劑量-效應(yīng)曲線的陡度較大，即其毒性隨濃度的增加變化較快，通過上圖曲線可看出Cd2+發(fā)光抑制度隨濃度的增加上升先是較快，后變慢，最終趨于平緩，符合S型曲線的規(guī)律。表明低濃度的Cd2+溶液對青?；【亩拘孕?yīng)較明顯，即青?；【鷮Φ蜐舛鹊腃d2+不敏感，隨著濃度增大，敏感度增強(qiáng)。有前人的研究可以推測，用不同的發(fā)光菌菌種做受試種時(shí)，不同的重金屬離子的差異性不同。4.3 Cd2+對發(fā)光菌的毒性作用在實(shí)

12、驗(yàn)中，我們以CdCl2為提供試驗(yàn)用Cd2+的實(shí)驗(yàn)試劑，按實(shí)驗(yàn)前設(shè)計(jì)的一系列濃度梯度配置好相應(yīng)濃度溶液，設(shè)定兩組對照組，將樣品放于BHP9511水質(zhì)毒性快速檢測儀中，并向其中依次加入已復(fù)蘇的青海湖菌Q67適量，待一段時(shí)間后，開始檢測發(fā)光菌發(fā)光強(qiáng)度變化，從而反映重金屬離子對發(fā)光菌的抑制度。經(jīng)過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，我們初步確定Cd2+對發(fā)光菌的毒性作用實(shí)驗(yàn)，Cd2+濃度梯度（mg/L）分別為0.1,0.15，0.25,0.35，0.45,0.55,0.65,0.75,0.85,1， 2，4，7， 10。經(jīng)過相應(yīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，我們重新確定實(shí)驗(yàn)用濃度（mg/L）梯度范圍分別為0.15,0.25,0.3

13、5，0.45,0.55,0.65,0.75,0.85。單因子試驗(yàn)得出一系列梯度濃度的相對發(fā)光抑制率，取穩(wěn)定性最好的一組。應(yīng)用Slogistic1模型對劑量-效應(yīng)曲線進(jìn)行擬合，所得Cd2+對發(fā)光菌的劑量-效應(yīng)關(guān)系如圖所示。 表4.3 Cd2+對發(fā)光菌的劑量-效應(yīng)分析溶液質(zhì)量濃度/(mgL-1)0.150.250.350.450.550.650.750.85Cd抑制發(fā)光度1.615.732.245.358.166.573.174.4曲線回歸分析y = 74.7335/(1 + exp(-9.208*(x-0.3999) R2=0，9931Cd對發(fā)光菌的劑量-效應(yīng)分析 圖4.3 Cd2+對發(fā)光菌的劑

14、量效應(yīng)曲線由式計(jì)算可得Cd2+對發(fā)光菌的半數(shù)效應(yīng)濃度即EC50值為0.476mg/L。從中可知，XC表示曲線對原點(diǎn)的相對位置，XC為0.3999，曲線偏離Y軸的水平位移較大。a值為74.7335，說明劑量-效應(yīng)曲線的陡度較大，即其毒性隨濃度的增加變化較快，通過上圖曲線可看出Cd2+發(fā)光抑制度隨濃度的增加上升先是較快，后變慢，最終趨于平緩，符合S型曲線的規(guī)律。表明低濃度的Cd2+溶液對青?；【亩拘孕?yīng)較明顯，即青?；【鷮Φ蜐舛鹊腃d2+不敏感，隨著濃度增大，敏感度增強(qiáng)。有前人的研究可以推測，用不同的發(fā)光菌菌種做受試種時(shí)，不同的重金屬離子的差異性不同。4.4 Cr2+對發(fā)光菌的毒性作用試驗(yàn)方法與

15、Cd2+類似，在實(shí)驗(yàn)中，我們以K2Cr2O7為提供試驗(yàn)用Cr2+的實(shí)驗(yàn)試劑，按實(shí)驗(yàn)前設(shè)計(jì)的一系列濃度梯度配置好相應(yīng)濃度溶液，設(shè)定兩組對照組，將樣品放于BHP9511水質(zhì)毒性快速檢測儀中，并向其中依次加入已復(fù)蘇的青海湖菌Q67適量，待一段時(shí)間后，開始檢測發(fā)光菌發(fā)光強(qiáng)度變化，從而反映重金屬離子對發(fā)光菌的抑制度。經(jīng)過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，我們初步確定Cr2+對發(fā)光菌的毒性作用實(shí)驗(yàn)，Cr2+濃度梯度（mg/L）分別為0.1,0.5，1， 2， 3. 5，7.5，10。單因子試驗(yàn)得出一系列梯度濃度的相對發(fā)光抑制率，取穩(wěn)定性最好的一組。應(yīng)用Slogistic1模型對劑量-效應(yīng)曲線進(jìn)行擬合，所得Cd2+對發(fā)光菌的劑

16、量-效應(yīng)分析如圖所示。Cr對發(fā)光菌的劑量-效應(yīng)分析圖4.4 Cr對發(fā)光菌的影響表4.4 Cr6+對發(fā)光菌的劑量-效應(yīng)分析溶液質(zhì)量濃度/(mgL-1)0 0.5 123.57.510Cr抑制發(fā)光度 038.786.39297.999.499.2曲線回歸分析 y = 99.4/(1 + exp(-1.54391*(x-0.58013)） 由式計(jì)算可得Cr6+對發(fā)光菌的半數(shù)效應(yīng)濃度即EC50值為1.167mg/L。從中可知，XC表示曲線對原點(diǎn)的相對位置，XC為0.58013，曲線偏離Y軸的水平位移較大。a值為99.4，說明劑量-效應(yīng)曲線的陡度較大，即其毒性隨濃度的增加變化較快，通過上圖曲線可看出Cr

17、2+發(fā)光抑制度隨濃度的增加上升較快，最終趨于平緩，符合S型曲線的規(guī)律。表明青?；【鷮τ诘蜐舛鹊腃r2+即較為敏感。4.5 時(shí)間對發(fā)光菌的影響-以汞為例表4.5.1 7min數(shù)據(jù)溶液質(zhì)量濃度mg/l00.060.080.10.12 0.16 0.18抑制度 0 11.7 23.7 40.5 62 85.4 回歸方程 y = 94/(1 + exp(-43.0924*(x-0.10543) R2=0.998798表4.5.2 20min數(shù)據(jù)溶液質(zhì)量濃度mg/l00.060.080.10.12 0.14 0.16 0.18抑制度 0 24.5 28.5 43.2 69.2 88.4 回歸方程 y =

18、 100/(1 + exp(-46.23142*(x-0.09602) R2=0.982 96.6 98表4.5.3 25min數(shù)據(jù)溶液質(zhì)量濃度mg/l00.060.080.10.12 0.14 0.16 0.18抑制度 0 29 29.3 47.1 74.3 91 回歸方程 y = 100/(1 + exp(-49.16017*(x-0.09188) R2=0.973 98.1 98.6圖4.5.1 7min 圖4.5.2 20min圖4.5.3 25min 根據(jù)曲線可知：7min時(shí)的EC50值為0.108mg/L,20min的EC50值為0.10mg/L.25min的EC50值為0.097

19、mg/L5.氨氮對發(fā)光菌的毒性作用配制不同濃度梯度的分析純的氯化氨溶液，稱取3.819g，重鉻酸鉀溶于1L水中。之后分別稀釋成質(zhì)量濃度為10、20、25、30、40、50、60mg/L的溶液。表5.1 7min數(shù)據(jù)溶液質(zhì)量濃度(mgl-1)10202530405060發(fā)光度(100%，7min)88.489.682.770.950.237.131.4發(fā)光度回歸方程y = 73.04988/(1 + exp(-0.11166*(x-33.91652) R21=0.9748表5.2 15min數(shù)據(jù)溶液質(zhì)量濃度(mgl-1)10202530405060發(fā)光度(100%，7min)85.986.178.264.849.631.917.6發(fā)光度回歸方程y = 100.90414/(1 + exp(-0.07542*(x-40.16353) R22=0.9807表5.3 20min數(shù)據(jù)溶液質(zhì)量濃度(mgl-1)102025304