東亞飛蝗有機(jī)磷抗性相關(guān)羧酸酯酶基因的特性及功能研究

1、東亞飛蝗有機(jī)磷抗性相關(guān)羧酸酯酶基因的特性及功能研究    英文題名 Characterizations and Function Analysis of Carboxylesterase Genes Related to Organophosphate Resistance in Locusta Migratoria Manilensis (Meyen)  關(guān)鍵詞 東亞飛蝗; 有機(jī)磷抗性; 羧酸酯酶; RNA干擾; 英文關(guān)鍵詞 Locusta migratona manilensis; Organophosphorus resistance;

2、Carboxylesterase; RNAi; 中文摘要 羧酸酯酶是昆蟲體內(nèi)重要的代謝解毒酶系,其主要功能是水解內(nèi)源性和外源性含有酯鍵的有毒物質(zhì),減緩其到達(dá)靶標(biāo)部位的時間。近年來的研究發(fā)現(xiàn),羧酸酯酶參與昆蟲抗藥性的產(chǎn)生。東亞飛蝗是重要的世界性農(nóng)業(yè)害蟲,由于長期使用化學(xué)農(nóng)藥治理蝗災(zāi),使得田間東亞飛蝗種群對殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗性。2004年馬恩波等首次發(fā)現(xiàn)東亞飛蝗對有機(jī)磷農(nóng)藥產(chǎn)生抗性,楊美玲等通過生物測定和生化實驗證實了東亞飛蝗黃驊田間種群對馬拉硫磷的抗藥性與酯酶活性增加相關(guān)。 為進(jìn)一步深入探討東亞飛蝗羧酸酯酶介導(dǎo)的有機(jī)磷抗性分子機(jī)制,本文基于東亞飛蝗EST數(shù)據(jù)庫平臺,通過生物信息學(xué)方法獲得東

3、亞飛蝗25個羧酸酯酶ESTs,采用Real-time PCR技術(shù)篩選出12個與抗性相關(guān)的羧酸酯酶基因,分析了其在不同組織部位(前腸、中腸、后腸、胃盲囊、馬氏管、脂肪體、表皮和頭部)的表達(dá)差異,結(jié)果顯示：所有基因在東亞飛蝗胃盲囊處表達(dá),且有6個基因在胃盲囊處特異性表達(dá)?？剐苑N群(Field Resistant Population, FR)中的表達(dá)量較敏感品系(Laboratory Susceptible Strain, LS)為高。與LS相比,在FR中表達(dá)量差異最大的基. 英文摘要 Carboxylesterases (CarEs) as one of the predominant meta

4、bolic enzyme familys in insect play the primary role in degredation and sequestration of a broad suit of endogenous and exogenous ester containing compounds. CarEs are frequently implicated in the resistance of insects to different  中文摘要 11-13 ABSTRACT 13-14 第一章 前言 15-23     1.1

5、害蟲抗藥性研究 15-16         1.1.1 抗藥性的產(chǎn)生 15         1.1.2 抗藥性的檢測 15-16         1.1.3 抗藥性生理生化機(jī)制 16     1.2 酯酶研究進(jìn)展 16-17         1.2.1 酯酶生化水平的研究 16-17 &#

6、160;       1.2.2 酯酶分子水平的研究 17     1.3 東亞飛蝗概述 17-20         1.3.1 東亞飛蝗分布、生活習(xí)性及生態(tài)特征 18         1.3.2 東亞飛蝗國內(nèi)外研究概況 18-20             1

7、.3.2.1 國內(nèi)研究概況 18-19             1.3.2.2 國外研究概況 19-20     1.4 我國東亞飛蝗的為害及治理 20         1.4.1 我國東亞飛蝗的為害 20         1.4.2 我國東亞飛蝗治理策略 20     1.5 本文研究的

8、內(nèi)容及意義 20-23 第二章 東亞飛蝗有機(jī)磷抗性相關(guān)羧酸酯酶基因特性分析 23-35     2.1 材料與方法 23-28         2.1.1 供試?yán)ハx的采集及飼養(yǎng) 23         2.1.2 供試藥品及主要儀器 23         2.1.3 東亞飛蝗EST數(shù)據(jù)庫中羧酸酯酶基因的搜索 23-24    &#

9、160;    2.1.4 羧酸酯酶基因引物設(shè)計 24-25         2.1.5 篩選抗性相關(guān)羧酸酯酶基因 25-27             2.1.5.1 總RNA的提取 25-26             2.1.5.2 總RNA的純化及第一鏈cDNA的合成 26-

10、27             2.1.5.3 實時熒光定量PCR法篩選抗性相關(guān)羧酸酯酶基因 27         2.1.6 抗性相關(guān)羧酸酯酶基因不同組織部位的表達(dá) 27-28             2.1.6.1 總RNA的提取及純化 27      &#

11、160;      2.1.6.2 第一鏈cDNA的合成 27             2.1.6.3 抗性相關(guān)羧酸酯酶基因在敏感種群和抗性品系中組織分布 27-28         2.1.7 抗性相關(guān)羧酸酯酶基因在不同齡期的表達(dá) 28            

12、; 2.1.7.1 總RNA的提取及純化 28             2.1.7.2 第一鏈cDNA的合成 28             2.1.7.3 抗性相關(guān)羧酸酯酶基因不同齡期的mRNA差異表達(dá) 28     2.2 結(jié)果與分析 28-33         2.2.1 東

13、亞飛蝗羧酸酯酶基因在EST數(shù)據(jù)庫中的搜索 28         2.2.2 抗性相關(guān)羧酸酯酶基因的篩選 28-29         2.2.3 抗性相關(guān)羧酸酯酶基因組織組織分布特征 29-32         2.2.4 抗性相關(guān)羧酸酯酶基因不同齡期的表達(dá)特性 32-33     2.3 討論 33-35 第三章 東亞飛蝗羧酸酯酶基因克隆 35-45

14、60;   3.1 材料與方法 35-39         3.1.1 供試?yán)ハx 35         3.1.2 主要試劑及主要儀器 35         3.1.3 東亞飛蝗羧酸酯酶基因的克隆 35-39             3.1.3.1 總RNA的

15、提取及純化 35             3.1.3.2 RACE cDNA的合成 35-36             3.1.3.3 羧酸酯酶基因RACE引物設(shè)計 36             3.1.3.4 羧酸酯酶基因3和5RACE末端快速擴(kuò)增 36-37

16、60;           3.1.3.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收與純化 37-38             3.1.3.6 PCR產(chǎn)物與載體的連接反應(yīng) 38             3.1.3.7 轉(zhuǎn)化與菌體擴(kuò)大培養(yǎng) 38      

17、;       3.1.3.8 質(zhì)?；厥铡z測及測序 38             3.1.3.9 核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列分析 38-39         3.1.4 羧酸酯酶基因聚類分析 39     3.2 結(jié)果與分析 39-43         3.2

18、.1 東亞飛蝗羧酸酯酶基因的RACE擴(kuò)增結(jié)果 39         3.2.2 羧酸酯酶基因核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列 39-40         3.2.3 羧酸酯酶基因聚類分析結(jié)果 40-43     3.3 討論 43-45 第四章 東亞飛蝗羧酸酯酶基因在抗藥性中的功能研究 45-53     4.1 材料與方法 45-48       

19、;  4.1.1 供試?yán)ハx的采集與飼養(yǎng) 45         4.1.2 供試藥品 45-46         4.1.3 生物測定 46         4.1.4 雙鏈RNA的引物設(shè)計 46         4.1.5 雙鏈RNA的合成 46-47     

20、0;       4.1.5.1 總RNA的提取與純化 46             4.1.5.2 cDNA的合成 46-47             4.1.5.3 PCR擴(kuò)增 47            

21、 4.1.5.4 體外反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈RNA 47         4.1.6 東亞飛蝗羧酸酯酶基因沉默對其表達(dá)的影響 47         4.1.7 羧酸酯酶基因沉默后東亞飛蝗對馬拉硫磷敏感性分析 47-48     4.2 結(jié)果與分析 48-50         4.2.1 東亞飛蝗敏感品系和天津田間種群2齡若蟲對馬拉硫磷敏感性的比較 48  

22、       4.2.2 東亞飛蝗羧酸酯酶基因沉默對其表達(dá)的影響 48-49         4.2.3 羧酸酯酶基因沉默后東亞飛蝗對馬拉硫磷敏感性分析 49-50     4.3 討論 50-53 全文總結(jié) 53-55 參考文獻(xiàn) 55-63     3.3 討論 43-45 第四章 東亞飛蝗羧酸酯酶基因在抗藥性中的功能研究 45-53     4.1 材料與方法 45-48

23、        4.1.1 供試?yán)ハx的采集與飼養(yǎng) 45         4.1.2 供試藥品 45-46         4.1.3 生物測定 46         4.1.4 雙鏈RNA的引物設(shè)計 46         4.1.5 雙鏈RNA的合成

24、 46-47             4.1.5.1 總RNA的提取與純化 46             4.1.5.2 cDNA的合成 46-47             4.1.5.3 PCR擴(kuò)增 47      &

25、#160;      4.1.5.4 體外反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈RNA 47         4.1.6 東亞飛蝗羧酸酯酶基因沉默對其表達(dá)的影響 47         4.1.7 羧酸酯酶基因沉默后東亞飛蝗對馬拉硫磷敏感性分析 47-48     4.2 結(jié)果與分析 48-50         4.2.1 東亞飛蝗敏

26、感品系和天津田間種群2齡若蟲對馬拉硫磷敏感性的比較 48         4.2.2 東亞飛蝗羧酸酯酶基因沉默對其表達(dá)的影響 48-49         4.2.3 羧酸酯酶基因沉默后東亞飛蝗對馬拉硫磷敏感性分析 49-50     4.3 討論 50-53 全文總結(jié) 53-55 參考文獻(xiàn) 55-63     3.3 討論 43-45 第四章 東亞飛蝗羧酸酯酶基因在抗藥性中的功能研究 45-53

27、    4.1 材料與方法 45-48         4.1.1 供試?yán)ハx的采集與飼養(yǎng) 45         4.1.2 供試藥品 45-46         4.1.3 生物測定 46         4.1.4 雙鏈RNA的引物設(shè)計 46    

28、0;    4.1.5 雙鏈RNA的合成 46-47             4.1.5.1 總RNA的提取與純化 46             4.1.5.2 cDNA的合成 46-47             4.1.5.3 PCR擴(kuò)增

29、 47             4.1.5.4 體外反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈RNA 47         4.1.6 東亞飛蝗羧酸酯酶基因沉默對其表達(dá)的影響 47         4.1.7 羧酸酯酶基因沉默后東亞飛蝗對馬拉硫磷敏感性分析 47-48     4.2 結(jié)果與分析 48-50    &

30、#160;    4.2.1 東亞飛蝗敏感品系和天津田間種群2齡若蟲對馬拉硫磷敏感性的比較 48         4.2.2 東亞飛蝗羧酸酯酶基因沉默對其表達(dá)的影響 48-49         4.2.3 羧酸酯酶基因沉默后東亞飛蝗對馬拉硫磷敏感性分析 49-50     4.3 討論 50-53 全文總結(jié) 53-55 參考文獻(xiàn) 55-63     3.3 討論 43

31、-45 第四章 東亞飛蝗羧酸酯酶基因在抗藥性中的功能研究 45-53     4.1 材料與方法 45-48         4.1.1 供試?yán)ハx的采集與飼養(yǎng) 45         4.1.2 供試藥品 45-46         4.1.3 生物測定 46         4.1.4 雙

32、鏈RNA的引物設(shè)計 46         4.1.5 雙鏈RNA的合成 46-47             4.1.5.1 總RNA的提取與純化 46             4.1.5.2 cDNA的合成 46-47        

33、60;    4.1.5.3 PCR擴(kuò)增 47             4.1.5.4 體外反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈RNA 47         4.1.6 東亞飛蝗羧酸酯酶基因沉默對其表達(dá)的影響 47         4.1.7 羧酸酯酶基因沉默后東亞飛蝗對馬拉硫磷敏感性分析 47-48    

34、4.2 結(jié)果與分析 48-50         4.2.1 東亞飛蝗敏感品系和天津田間種群2齡若蟲對馬拉硫磷敏感性的比較 48         4.2.2 東亞飛蝗羧酸酯酶基因沉默對其表達(dá)的影響 48-49         4.2.3 羧酸酯酶基因沉默后東亞飛蝗對馬拉硫磷敏感性分析 49-50     4.3 討論 50-53 全文總結(jié) 53-55 參考文獻(xiàn) 55-63     3.3 討論 43-45 第四章 東亞飛蝗羧酸酯酶基因在抗藥性中的功能研究 45-53     4.1 材料與方