Livin基因在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的分子生物學(xué)特性

1、Livin基因在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的分子生物學(xué)特性    【關(guān)鍵詞】  Livin基因; 非小細(xì)胞肺癌; 分子生物學(xué) 原癌基因和抑癌基因所編碼的蛋白存在于細(xì)胞的各個(gè)組成部分中，包括細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體和細(xì)胞膜。通過(guò)對(duì)原癌和抑癌基因蛋白結(jié)構(gòu)和功能的分析，發(fā)現(xiàn)許多原癌基因和抑癌基因位于信號(hào)通路中的不同部位，參與許多重要的細(xì)胞活動(dòng)過(guò)程，如細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、DNA復(fù)制和損傷修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)、細(xì)胞周期調(diào)控等，在細(xì)胞凋亡、衰老過(guò)程當(dāng)中起重要作用，也在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。Livin蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of

2、 apoptosis protein，IAP)家族的新成員之一，具有抗細(xì)胞凋亡作用，并明顯地在腫瘤組織中特異性表達(dá)。目前的研究表明， Livin基因在各系統(tǒng)的正常組織中很少表達(dá)，但在胚胎組織或發(fā)育組織、淋巴細(xì)胞性白血病、胃癌、膀胱癌、乳腺癌和黑色素瘤等多種組織中廣泛表達(dá)。非小細(xì)胞肺癌（non?small?cell lung cancer，NSCLC）的腫瘤細(xì)胞系中也有Livin基因的表達(dá)，但其與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥性等之間的確切關(guān)系尚不清楚。Livin基因特異性地表達(dá)于腫瘤組織，有可能成為NSCLC早期診斷的分子標(biāo)志物，并為基因治療提供新靶點(diǎn)1-3。本文就Livin基因在NSCLC中的表達(dá)及

3、其抗細(xì)胞凋亡作用、信號(hào)傳導(dǎo)途徑與調(diào)節(jié)機(jī)制等分子生物學(xué)特性作一綜述。     1  Livin基因及蛋白結(jié)構(gòu)功能的多樣性     IAP是一類(lèi)重要的抗細(xì)胞凋亡因子，其共同的結(jié)構(gòu)特征是N端含有一個(gè)或多個(gè)(最多為3個(gè))串聯(lián)的桿狀病毒IAP重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(baculovirus IAP repeats domain，BIRs)和C端含有一個(gè)環(huán)指結(jié)構(gòu)域(RING finger domain，RING)。目前已發(fā)現(xiàn)人類(lèi)IAP家族有8個(gè)成員，即NIAP,XIAP(ILP1/MIHA)，cIAP1(HIAP2/MIHB)

4、，cIAP2(HIAP1/MIHC)，survivin(TIAP)，apollon(Bruce)，ILP2(TsIAP) 和livin(ML?IAP/KIAP)2。     Livin蛋白是IAP家族的一個(gè)新成員，一些實(shí)驗(yàn)室采用IAP同源序列(BIR或RING)尋找的方法，分別從人類(lèi)基因組cDNA文庫(kù)中克隆得到Livin核苷酸序列，從不同的組織中發(fā)現(xiàn)了Livin基因的表達(dá)。Kasof等3在發(fā)育組織和腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)并命名了Livin基因。Lin等4從人胎腎cDNA文庫(kù)中分離到該基因，故稱其為KIAP（kidney inhibitor of apoptosi

5、s protein，KIAP）。Vucic等5發(fā)現(xiàn)Livin基因在G361 和 SK?Mel29兩種黑色素瘤細(xì)胞源株中高表達(dá)，將其命名為MLIAP（melanoma inhibitor of apoptosis protein）。Ashhab等6發(fā)現(xiàn)了該基因存在2個(gè)剪接變異體（isoforms），分別命名為L(zhǎng)ivin 和Livin 。 同時(shí)，Lin等4用熒光原位雜交方法確定Livin基因位于人20號(hào)染色體20q13.3區(qū)域，全長(zhǎng)4.6 kb，包含7個(gè)外顯子。此外還發(fā)現(xiàn)存在長(zhǎng)約2.2,2.8和4.0 kb的轉(zhuǎn)錄子，Livin蛋白N端僅包含一個(gè)BIR結(jié)構(gòu)，包含4個(gè)螺旋和一個(gè)三股抗平行 片層，與相應(yīng)

6、的氨基酸殘基共同構(gòu)成疏水核心。C端含有一個(gè)RING環(huán)指結(jié)構(gòu)4,6，氨基酸殘基C124,C127,H44及C151與鋅原子結(jié)合，借以穩(wěn)定整個(gè)重疊結(jié)構(gòu)。         Livin蛋白有和兩種變異體，分別由298和280個(gè)氨基酸組成，二者相差18個(gè)氨基酸，此區(qū)域由介于BIR和RING結(jié)構(gòu)之間的第6外顯子5端54 bp的基因序列編碼。Livin蛋白主要表達(dá)于胞質(zhì)，但Kasof等3認(rèn)為livin蛋白的細(xì)胞內(nèi)分布與Survivin蛋白相似，Livin蛋白既在胞質(zhì)內(nèi)呈絲狀表達(dá)，同時(shí)也表達(dá)于胞核，并認(rèn)為livin蛋白 C末端的R

7、ING結(jié)構(gòu)對(duì)介導(dǎo)其在亞細(xì)胞水平上的分布具有重要作用。Livin基因mRNA 3端非翻譯區(qū)多腺苷酸化與存在未剪接加工成熟的前體RNA有關(guān)，不同的剪輯有不同的變異體及亞型，這種結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)有可能解釋Livin基因蛋白存在多個(gè)結(jié)構(gòu)功能。如BIR結(jié)構(gòu)域內(nèi)單個(gè)氨基酸的突變就能發(fā)揮其抗凋亡作用，作者的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)在A549細(xì)胞中表達(dá)的Livin 蛋白缺少66個(gè)核苷酸的變異體，其確切的功能意義尚不清楚。但Livin基因蛋白結(jié)構(gòu)的變化與其功能的多樣性存在明顯的相關(guān)性。     2  Livin基因在NSCLC中的表達(dá)    

8、Livin基因僅在少數(shù)正常組織中表達(dá)，各家報(bào)道的研究結(jié)果存在較大差異，目前還不能確定Livin基因在人正常組織中的表達(dá)譜及其生理意義2,7。Tanabe等7采用 RT?PCR法對(duì)15例正常肺組織和38例NSCLC組織作對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)Livin mRNA在NSCLC組織陽(yáng)性率為73.6%，正常肺組織陽(yáng)性率為6.7%，顯示Livin基因在NSCLC中呈高表達(dá)，同時(shí)證明Livin基因與Survivin基因在NSCLC中的表達(dá)并不相關(guān)。Crnkovic?Mertens 等1,8同時(shí)采用NSCLC組織和NSCLC源 HeLa細(xì)胞株培養(yǎng)檢測(cè)Livin基因及其兩種異構(gòu)體Livin 和Livin 的表達(dá)，結(jié)果

9、顯示Livin 和Livin 在NSCLC中呈高表達(dá)。采用RNAi技術(shù)分別使異構(gòu)體基因沉默，發(fā)現(xiàn)Livin 和Livin 基因的功能意義不完全相同， Livin 在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。國(guó)內(nèi)崔肅等9采用RT?PCR法檢測(cè)NSCLC組織中Livin mRNA和Livin  mRNA的表達(dá)，并用Western blot方法分析Livin蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示45例NSCLC組織中Livin mRNA表達(dá)陽(yáng)性率為71.1，兩種異構(gòu)體基本同時(shí)表達(dá)，Livin mRNA的表達(dá)量略高于Livin mRNA。而在癌旁正常肺組織和肺良性瘤樣病變組織呈低表達(dá)，陽(yáng)性率分別為5.7和6.7。而且Livin

10、mRNA表達(dá)陽(yáng)性標(biāo)本中均能檢測(cè)到Livin蛋白表達(dá)。陳淼等10采用免疫組織化學(xué)(SABC)的方法檢測(cè)Livin蛋白在40例NSCLC組織以及12例正常和肺良性疾病組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示22例腺癌和18例鱗癌組織中的Livin蛋白陽(yáng)性率分別為45.5?和50.0?，而正常肺組織和肺良性疾病組織均未檢出Livin蛋白表達(dá)。他們同時(shí)觀察到不同分化程度NSCLC組織之間Livin蛋白的表達(dá)無(wú)顯著性差異。有和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中Livin蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率分別為72.7?和11.1?,兩組的顯著性差異標(biāo)志著不同的生物學(xué)特性。孫建國(guó)等11 的研究結(jié)果顯示，48例NSCLC組織中Livin mRNA表達(dá)陽(yáng)

11、性率為22.9%，其表達(dá)與NSCLC組織學(xué)類(lèi)型相關(guān)，腺癌中Livin mRNA表達(dá)陽(yáng)性率達(dá)45.5%，明顯高于鱗癌和大細(xì)胞癌，而癌旁組織和肺良性疾病組織均未檢出陽(yáng)性結(jié)果，而且Livin 蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)相一致。研究還發(fā)現(xiàn)放、化療后NSCLC組織中的Livin表達(dá)的陽(yáng)性率為43.5%，顯著高于未放、化療組織，提示放、化療可明顯誘導(dǎo)Livin蛋白的表達(dá)，這可能與臨床上NSCLC對(duì)化療藥物和放療耐受有關(guān)。         目前，Livin基因在NSCLC組織中特異性地高表達(dá)的現(xiàn)象已引起許多學(xué)者的關(guān)注1，但Livin

12、 mRNA的表達(dá)與NSCLC患者的病理分型、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等的相關(guān)關(guān)系尚未完全闡明，Livin基因作為NSCLC的分子標(biāo)志物，成為診斷和治療NSCLC新靶點(diǎn)的可能性已引起人們的極大興趣。     3  Livin抗細(xì)胞凋亡作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制     Kasof等3,8研究顯示，Livin蛋白N端的羧基與Caspase?3,7,9的直接結(jié)合，阻斷了caspase發(fā)揮凋亡作用的途徑，從而抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。將Livin基因轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，受轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)由FADD（Fasassociate

13、d protein with death domain）,Bax,RIP,RIP3及DR6誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可被有效阻斷。Vucic等13將Livin基因轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF7細(xì)胞，證實(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)Fas,TNFR?1（tumor necrosis factor receptor? 1）,DR4（death receptor 4）及DR5介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有顯著的抑制作用。許多化療藥物可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞DNA的損傷而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，轉(zhuǎn)染Livin基因的MCF7細(xì)胞可有效對(duì)抗阿霉素以及4TBP（4 tertiary butylphenol）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。但是各家報(bào)道Livin 和Livin 蛋白的抗細(xì)胞凋亡作用

14、存在一定差異。Yang等14,15觀察在Jurkat T淋巴細(xì)胞株中，Livin基因可明顯抑制由TNF及抗CD95抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其抗細(xì)胞凋亡作用強(qiáng)于Bcl 2。Livin 對(duì)STS誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞凋亡表現(xiàn)出一定的抑制作用，而Livin 則無(wú)此作用。Crnkovic?Mertens 等8 采用RNA干擾技術(shù)分別使內(nèi)源性Livin 和Livin 基因沉默，檢測(cè)兩者的抗凋亡作用，結(jié)果顯示Livin 可顯著抑制依托泊苷（etoposide）和紫外線放射治療（UV irradiation）等誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡，但Livin 則不明顯。更多的研究則認(rèn)為L(zhǎng)ivin 和Livin 基因均具有抗

15、細(xì)胞凋亡作用，二者可能具有不同的激活途徑有待進(jìn)一步證實(shí)。     許多研究證實(shí)12-16，Livin蛋白介導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制存在不同的調(diào)節(jié)途徑，通過(guò)與激活形式的Caspase 3和Caspase 7結(jié)合，抑制其活性。Livin蛋白還可與未加工的或斷裂形式的Caspase 9結(jié)合，可抑制由Apaf 1（apoptosis protein activating  factor 1）、細(xì)胞色素C及dATP誘導(dǎo)的Caspase 9激活作用。 Livin蛋白與Caspase的結(jié)合抑制作用具有高度的特異性和親和性，BIR結(jié)構(gòu)域內(nèi)單個(gè)氨基酸的突變即可導(dǎo)致Livi

16、n蛋白與Caspase的結(jié)合作用的減弱或消失，致使Livin蛋白抗細(xì)胞凋亡作用的明顯降低甚至完全喪失，這也許可成為基因治療的調(diào)節(jié)點(diǎn)。Sanna 等12的研究顯示，Livin可激活MAP（mitogen activated protein）激酶JNK1和JNK2，但對(duì)JNK3無(wú)激活作用，而Livin蛋白對(duì)JNK1的激活作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于JNK2，并且這是Livin蛋白對(duì)抗TNF和ICE介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用的重要途徑之一。 JNK蛋白家族可直接由MKK4/MKK7激活，但Livin蛋白對(duì)JNK1的激活并不依賴于MKK4/MKK7信號(hào)途徑，而是通過(guò)TAB1/TAK1途徑實(shí)現(xiàn)。 TAK1是MAP3激酶之一，在

17、TGF1的刺激下TAK1可激活JNK1。 TAB1是TAK1的共活化因子（coactivator），TAB1本身對(duì)于JNK1無(wú)激活作用，但可促進(jìn)TAK1介導(dǎo)的JNK1激活作用。Livin蛋白可與TAB1結(jié)合，并進(jìn)一步激活TAK1。此外，Vucic 等13證實(shí)SMAC（ second mitochondrial activator of caspases, SMAC）及活性肽片段可與Livin蛋白的BIR結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，抑制Livin蛋白與caspase的結(jié)合及其抗細(xì)胞凋亡作用。因此存在著由SMAC介導(dǎo)的對(duì)Livin蛋白抗細(xì)胞凋亡作用的負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)制。   

18、0;     4  Livin基因治療NSCLC的臨床應(yīng)用前景     鑒于Livin基因具有明顯的抗細(xì)胞凋亡作用以及在腫瘤組織中的特異性表達(dá)，人們注意到其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，并開(kāi)始探討Livin用于腫瘤基因治療的可行性。應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)可獲得穩(wěn)定表達(dá)Livin 和Livin 的NSCLC A549細(xì)胞克隆。孫建國(guó)等17用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)研究A549細(xì)胞生長(zhǎng)情況，用MTT法檢測(cè)其對(duì)放、化療的敏感性，用細(xì)胞周期分析法觀察細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Livin 和Livin 基因后的細(xì)胞尤其是表達(dá)Livin

19、的A549細(xì)胞，克隆形成能力提高、倍增時(shí)間縮短，對(duì)多種化療藥物和放射線敏感性降低，10 Gy放射線照射下僅有0.2%細(xì)胞發(fā)生凋亡?？梢?jiàn) Livin基因參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展，也可能是NSCLC細(xì)胞對(duì)放、化療耐受的重要機(jī)制之一。      Crnkovic?Mertens等18利用基因轉(zhuǎn)染和特異性小干擾RNA(siRNA)技術(shù)，在肺癌SPC?A1細(xì)胞株中建立Livin異構(gòu)體和特異的基因沉默體系，觀察誘導(dǎo)SPC?A1細(xì)胞凋亡效應(yīng)中的不同作用，并用TUNEL法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示內(nèi)源性Livin 和Livin 基因沉默后，SPC?A1細(xì)胞克隆

20、形成能力較對(duì)照組顯著下降，促使SPC?A1細(xì)胞發(fā)生凋亡，表明Livin 和Livin 兩種異構(gòu)體均能作為誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的分子靶點(diǎn)，通過(guò)使Livin基因沉默的靶向誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡可作為手術(shù)、化療、放療等傳統(tǒng)治療的輔助手段。     由于Livin基因僅在腫瘤組織表達(dá)而在正常組織極少表達(dá)，Yagihashi等19用ELISA法在肺癌患者外周血和腫瘤組織中均檢測(cè)到自身Livin蛋白抗體，其組織特異性顯而易見(jiàn)。Hariu等20  用Livin反義核苷酸片段刺激周?chē)馨图?xì)胞，發(fā)現(xiàn)HLA?A24與Livin 7肽具有特殊親和力，Livin蛋白表達(dá)陽(yáng)性的N

21、SCLC患者可檢測(cè)到特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocytes,CTLs），而Livin蛋白表達(dá)陰性NSCLC患者則測(cè)不到CTLs。結(jié)果提示Livin蛋白可成為NSCLC免疫治療的靶點(diǎn)，將Livin 7肽作為免疫制劑具有良好的應(yīng)用前景。綜上所述，Livin基因是腫瘤細(xì)胞凋亡途徑中的一個(gè)信號(hào)調(diào)節(jié)點(diǎn)，其在NSCLC組織中的特異性表達(dá)為NSCLC的診斷提供了新的分子標(biāo)記物，亦可成為NSCLC治療的新靶點(diǎn)21，22。目前，人們已能在基因水平上干預(yù)因基因表達(dá)異常而導(dǎo)致的疾病，尤其是以mRNA為靶標(biāo)的反義藥物，可抑制和消除致病基因的表達(dá)，達(dá)到治療的目點(diǎn)。因此，采用反義核苷酸（a

22、ntisense oligonucleotides）、小分子抑制劑（small?molecule inhibitors）和免疫介入（immune?mediated approaches）等基因治療手段直接阻斷Livin 蛋白與目的分子的結(jié)合，可以促使腫瘤細(xì)胞的凋亡，為NSCLC的治療開(kāi)辟新的途徑23，24。同時(shí)，對(duì)NSCLC患者腫瘤組織和外周血免疫細(xì)胞的Livin蛋白（受體）及其mRNA表達(dá)的聯(lián)合檢測(cè)，有可能成為NSCLC早期診斷、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后的分子標(biāo)記物。      【參考文獻(xiàn)】  1 Crnkovic?Mertens I, Mu

23、ley T, Merster M, et al. The anti?apoptotic livin gene is an important determinant for the apoptotic resistance of non?small cell lung cancer cellsJ. Lung Cancer, 2006,54(2):135-1422 Salvesen GS, Duckett CS. IAP proteins: Blocking the road to deaths doorJ. Nat Rev Mol Cell Biol, 2002,3(6): 401-410.3

24、 Kasof GM, Gomes BC. Livin, a novel inhibitor of apoptosis protein family memberJ. J Biol Chem, 2001, 276(5): 3238-3246.4 Lin JH, Deng G, Huang Q, et al. KIAP, a novel member of the inhibitor of apoptosis protein familyJ. Biochem Biophys Res Commu, 2000,279(3): 820-831.5 Vucic D, Stennicke HR, Pisab

25、arro MT, et al. ML?IAP, a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomasJ. Curr Biol， 2000,10(21): 1359-1366.6 Ashhab Y, Alian A, Polliack A, et al. Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene with different biological properties and tissue distributi

26、on patternJ. FEBS Lett, 2001,495(12): 56-60.7 Tanabe H, Yagihash A, Tsuji N, et al. Expression of survivin mRNA and livin mRNA in non?small?cell lung cancerJ. Lung Cancer, 2004,46(3):299-304.8 Crnkovic?Mertens I, Semzow J, Hoppe?Seyler F, et al. Isoform?specific seilencing of the Livin by RNA interf

27、erence defines Livin beta as key mediator of apoptosis inhibition in HeLa cellsJ. J Mol Med, 2006,84(3):232-240.9 崔 肅，陳東義， 韓力波，等.凋亡抑制蛋白Livin在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義J.中國(guó)腫瘤臨床，2006,33（5）：249-252.10 陳 淼，陶曉南，張曉菊.凋亡抑制蛋白Livin在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義J.廣東醫(yī)學(xué)，2006，27（7）：1014-1015.11 孫建國(guó)，廖榮霞，陳正堂，等.一種新的凋亡抑制蛋白Livin在非小細(xì)胞肺癌組織中的表

28、達(dá)J.重慶醫(yī)學(xué),2004,33(7):982-984.12 Sanna MG, da Silva Correia J, Ducrey O, et al. IAP suppression of apoptosis involves distinct mechanisms: The TAK1/JNK1 signaling cascade and caspase inhibitionJ. Mol Cell Biol, 2002,22(6):1754-1766.    13 Vucic D, Deshayes K, Ackerly H, et al. SMAC

29、negatively regulates the anti?apoptotic activity of melanoma inhibitor of apoptosis(ML?IAP)J. J Biol Chem, 2002,277(14): 12275-12279.14 Yang F, Sarangarajan R, Le Poole IC, et al. The cytotoxicity and apoptosis induced by 4?tertiary butylphenol in human melanocytes are independent of tyrosinase acti

30、vityJ.J Invest Dermatol, 2000，114(1): 157 -164.15 Andersen MH, Reker S, Becker JC, et al. The melanoma inhibitor of apoptosis protein:a target for spontaneous cytotoxic T cell responsesJ. J Invest Dermatol, 2004,122(2):392-399.16 Yan H,Brouha B, Liu T, et al. Proteolytic cleavage of Livin(ML?IAP) in

31、 apoptotic melanoma cells potentially mediated by a non?canonical caspaseJ. J Dermatol Sci, 2006,43(3):189-200.17 孫建國(guó)，廖榮霞，陳正堂,等.Livin異構(gòu)體基因轉(zhuǎn)染對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)及放化療敏感性的影響J. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2005，28（12）：836-840.18 Crnkovic?Mertens I, Hoppe?Seyler F, Butz K. Induction of apoptosis in tumor cells by siRNA?mediated silencing of the Livin/M L?IAP/KIAP geneJ. Oncogene, 2003,22(51): 8330-8336.19 Yagihashi A, Asanuma K, Kobayashi D, et al. Detection of autoantibodies to livin and survivin in sera from lung cancer pat