發(fā)酵工程 教案 第五章 培養(yǎng)基及設(shè)備的滅菌

1、第五章 培養(yǎng)基及設(shè)備的滅菌第一節(jié) 培養(yǎng)基滅菌的目的、要求和方法一、定義 1，培養(yǎng)基滅菌的定義是指從培養(yǎng)基中殺滅有生活能力的細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)體及其孢子，或從中將其除去。工業(yè)規(guī)模的液體培養(yǎng)基滅菌，殺滅雜菌比除去雜菌更為常用。2，滅菌與消毒的區(qū)別滅菌：用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽孢和孢子消毒：用物理或化學(xué)方法殺死物料、容器、器皿內(nèi)外的病源微生物。二、培養(yǎng)基滅菌的目的 1，在發(fā)酵過(guò)程中夾雜其它雜菌造成的后果生產(chǎn)菌和雜菌同時(shí)生長(zhǎng)，生產(chǎn)菌喪失生產(chǎn)能力；在連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中，雜菌的生長(zhǎng)速度有時(shí)會(huì)比生產(chǎn)菌生長(zhǎng)得更快，結(jié)果使發(fā)酵罐中以雜菌為主；雜菌及其產(chǎn)生的物質(zhì)，使提取精制發(fā)生困難；雜菌

2、會(huì)降解目的產(chǎn)物；雜菌會(huì)污染最終產(chǎn)品，雜菌會(huì)污染最終產(chǎn)品；發(fā)酵時(shí)如污染噬菌體，可使生產(chǎn)菌發(fā)生溶菌現(xiàn)象。2，工業(yè)上具體措施包括（1）使用的培養(yǎng)基和設(shè)備須經(jīng)滅菌；（2）好氧培養(yǎng)中使用的空氣應(yīng)經(jīng)除菌處理；（3）設(shè)備應(yīng)嚴(yán)密，發(fā)酵罐維持正壓環(huán)境；（4）培養(yǎng)過(guò)程中加入的物料應(yīng)經(jīng)過(guò)滅菌；（5）使用無(wú)污染的純粹種子。3，培養(yǎng)基滅菌的目的殺滅培養(yǎng)基中的微生物，為后續(xù)發(fā)酵過(guò)程創(chuàng)造無(wú)菌的條件。4，培養(yǎng)基滅菌的要求（1）達(dá)到要求的無(wú)菌程度（10-3）（2）盡量減少營(yíng)養(yǎng)成分的破壞，在滅菌過(guò)程中，培養(yǎng)基組分的破壞，是由兩個(gè)基本類型的反應(yīng)引起的：培養(yǎng)基中不同營(yíng)養(yǎng)成分間的相互作用；對(duì)熱不穩(wěn)定的組分如氨基酸和維生素等的分解。5，

3、滅菌的方法（1）化學(xué)法 化學(xué)藥品滅菌法 （2）物理法 干熱滅菌法 濕熱滅菌法射線滅菌法 6，濕熱滅菌的原理每一種微生物都有一定的最適生長(zhǎng)溫度范圍。當(dāng)微生物處于最低溫度以下時(shí)，代謝作用幾乎停止而處于休眠狀態(tài)。當(dāng)溫度超過(guò)最高限度時(shí)，微生物細(xì)胞中的原生質(zhì)膠體和酶起了不可逆的凝固變性，使微生物在很短時(shí)間內(nèi)死亡，加熱滅菌即是根據(jù)微生物這一特性而進(jìn)行的。7，濕熱滅菌中的相關(guān)定義殺死微生物的極限溫度稱為致死溫度。在致死溫度下，殺死全部微生物所需的時(shí)間稱為致死時(shí)間；在致死溫度以上，溫度愈高，致死時(shí)間愈短。微生物的熱阻：是指微生物在某一特定條件（主要是溫度和加熱方式）下的致死時(shí)間。相對(duì)熱阻是指某一微生物在某條件

4、下的致死時(shí)間與另一微生物在相同條件下的致死時(shí)間的比值。各種微生物對(duì)濕熱的相對(duì)熱阻微生物相對(duì)熱阻營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和酵母細(xì)菌芽孢霉菌孢子病毒和噬菌體1.03×106210158，濕熱滅菌的優(yōu)點(diǎn)蒸汽來(lái)源容易，操作費(fèi)用低，本身無(wú)毒；蒸汽有強(qiáng)的穿透力，滅菌易于徹底；蒸汽有很大的潛熱；操作方便，易管理。2 濕熱滅菌的理論基礎(chǔ)一，培養(yǎng)基濕熱滅菌需解決的工程問(wèn)題1，將培養(yǎng)基中的雜菌總數(shù)N0 殺滅到可以接受的總數(shù)N（10-3）， 需要多高的溫度、多長(zhǎng)的時(shí)間為合理。 菌溫度和時(shí)間的確定取決于： （1）雜菌孢子的熱滅死動(dòng)力學(xué) （2）反應(yīng)器的形式和操作方式 （3）培養(yǎng)基中有效成分受熱破壞的可接受范圍 二、微生物的熱

5、死滅動(dòng)力學(xué)方程實(shí)驗(yàn)證明，微生物營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的均相熱死滅動(dòng)力學(xué)符合化學(xué)反應(yīng)的一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，即：N：任一時(shí)刻的活細(xì)菌濃度（個(gè)/L）t：時(shí)間（min）K：比熱死速率常數(shù)（min-1）取邊界條件t0=0，N=N0，對(duì)（1）積分得或?qū)嶒?yàn)還證明，細(xì)菌孢子的熱殺滅動(dòng)力學(xué)與營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的有所不同。它表現(xiàn)為非對(duì)數(shù)的死亡動(dòng)力學(xué)。這可能與孢子壁的化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)有關(guān)。但當(dāng)溫度超過(guò)120C時(shí)，熱阻極強(qiáng)的嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子的熱殺滅動(dòng)力學(xué)也接近對(duì)數(shù)死亡動(dòng)力學(xué)即符合一級(jí)反應(yīng)規(guī)律。三、溫度對(duì)K的影響微生物的熱死滅動(dòng)力學(xué)接近一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，它的比熱死滅速率常數(shù)K與滅菌溫度T的關(guān)系可用阿累尼烏斯方程表征 A：頻率因子（min-1）E：

6、活化能（J/mol） R：通用氣體常數(shù)J/（mol.k）從方程（4）可以看出：（1）活化能E的大小對(duì)K值有重大影響。其它條件相同時(shí)，E越高，K越低，熱死速率越慢。（2）不同菌的孢子的熱死滅反應(yīng)E可能各不相同。對(duì)方程（4）兩邊取對(duì)數(shù)，得方程（5）K是E和T的函數(shù)，K的對(duì)T的變化率與有關(guān)，對(duì)方程（5）兩邊對(duì)T取導(dǎo)數(shù)，得方程（6）。由方程（6）可得出結(jié)論：反應(yīng)的E越高，lnK對(duì)T的變化率越大，即T的變化對(duì)K的影響越大試驗(yàn)表明，細(xì)菌孢子熱死滅反應(yīng)的E很高，而某些有效成分熱破壞反應(yīng)的E較低（見(jiàn)下表）。將溫度提高到一定程度，會(huì)加速細(xì)菌孢子的死滅速度，縮短滅菌時(shí)間，由于有效成分的E很低，溫度的提高只能稍微增

7、大其破壞速度，但由于滅菌時(shí)間的顯著縮短，有效成分的破壞反而減少。受熱物質(zhì)E（J/mol）維生素B12維生素B1鹽酸鹽嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子肉毒梭菌孢子枯草桿菌孢子9623292048283257343088317984如嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子的EBS =67000× 4.184（J/mol），維生素B1的EVB=22000× 4.184 （J/mol），將滅菌溫度從105C提高到127C，KVB從0.02（min-1）提高到0.06（min-1），KBS從0.12（min-1）提高到40.0（min-1）。嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子和維生素B1的lnK-1/T圖嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子死

8、滅程度為N/N0=10-16時(shí)，滅菌溫度對(duì)維生素B1破壞的影響滅菌溫度（C）達(dá)到滅菌程度的時(shí)間（min）維生素B1的損失（%）100110120130140150843757.60.8510.1070.01599.9989271031第三節(jié) 培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì)第四節(jié)一、無(wú)菌的標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)微生物熱死滅方程，要求滅菌后達(dá)到絕對(duì)無(wú)菌是很難做到的，也是不必要的。因此在工程設(shè)計(jì)中常取N=10-3。二、分批滅菌1，分批滅菌的設(shè)計(jì)在發(fā)酵罐中進(jìn)行實(shí)罐滅菌，是典型的分批滅菌。全過(guò)程包括升溫、保溫、降溫三個(gè)過(guò)程。孢子熱死亡的規(guī)律符合積分得（8）在分批滅菌過(guò)程中 因?yàn)樯郎?、冷卻階段T是時(shí)間t的函數(shù)，K不是常數(shù)，所以：

9、 式中Kh是保溫階段的孢子比熱死亡速度常數(shù)分批滅菌中幾種換熱方式的溫度-時(shí)間變化關(guān)系T：介質(zhì)溫度（K）；T0：介質(zhì)初溫（K）；t：時(shí)間（min）；h：蒸汽相對(duì)于介質(zhì)的熱焓（kJ/kg）；s：蒸汽的重量流率（kg/min）；M：介質(zhì)重量(kg)；Cp：介質(zhì)比熱kJ/(kg.K)； TH：熱源溫度(K)；U：總傳熱系數(shù)kJ/（m2.min.K）；q：傳熱速率（kJ/min）；Cp：冷卻劑比熱；W：冷卻劑流率；TCO：冷卻劑溫度 2，計(jì)算舉例（自學(xué)）參見(jiàn)：微生物工程工藝原理P226、倫世儀主編生化工程P13。 3，保證間歇滅菌成功的要素（1）內(nèi)部結(jié)構(gòu)合理(主要是無(wú)死角)，焊縫及軸封裝置可靠，蛇管無(wú)穿

10、孔現(xiàn)象（2）壓力穩(wěn)定的蒸汽（3）合理的操作方法。 4，培養(yǎng)基間歇滅菌過(guò)程中應(yīng)注意的問(wèn)題 （1）溫度和壓力的關(guān)系（2）泡沫問(wèn)題（3）投料過(guò)程中，麩皮和豆餅粉等固形物在罐壁上殘留的問(wèn)題（4）滅菌結(jié)束后應(yīng)立即引入無(wú)菌空氣保壓發(fā)酵罐的接管圖三、連續(xù)滅菌的設(shè)計(jì) 1，1， 連續(xù)滅菌的流程2， （1）噴射加熱連續(xù)滅菌噴射加熱連續(xù)滅菌流程典型的噴射加熱連續(xù)滅菌時(shí)的溫度和時(shí)間曲線圖（2）薄板換熱器連續(xù)滅菌薄板換熱器連續(xù)滅菌流程薄板換熱器連續(xù)滅菌時(shí)的溫度和時(shí)間曲線圖（3）噴淋冷卻連續(xù)滅菌噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程2，連續(xù)滅菌設(shè)計(jì)及計(jì)算舉例（自學(xué)）參見(jiàn)：微生物工程工藝原理P228，倫世儀主編生化工程P22。 3，連續(xù)滅菌

11、設(shè)備的結(jié)構(gòu)及計(jì)算（1）設(shè)備結(jié)構(gòu)：套管式連消塔噴嘴式連消塔連消器噴射加熱器薄板換熱器維持罐（2）連消塔計(jì)算（自學(xué)）參見(jiàn)發(fā)酵工程與設(shè)備P53四、連續(xù)滅菌與間歇滅菌的比較 1，連續(xù)滅菌的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)保留較多的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量容易放大較易自動(dòng)控制；糖受蒸汽的影響較少；縮短滅菌周期；在某些情況下，可使發(fā)酵罐的腐蝕減少；發(fā)酵罐利用率高；蒸汽負(fù)荷均勻。缺點(diǎn)設(shè)備比較復(fù)雜，投資較大。 2，分批滅菌的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)設(shè)備投資較少染菌的危險(xiǎn)性較小人工操作較方便對(duì)培養(yǎng)基中固體物質(zhì)含量較多時(shí)更為適宜缺點(diǎn) 滅菌過(guò)程中蒸汽用量變化大，造成鍋爐負(fù)荷波動(dòng)大，一般只限于中小型發(fā)酵裝置。五、影響滅菌的因素 （1）培養(yǎng)基成分對(duì)滅菌的影響油脂，糖類及

12、一定濃度的蛋白質(zhì)可增加微生物的耐熱性，另一些物質(zhì)，如高濃度的鹽類，色素等可削弱其耐熱性。（2）培養(yǎng)基的物理狀態(tài)對(duì)滅菌的影響（3）培養(yǎng)基中微生物數(shù)量對(duì)滅菌的影響（4）培養(yǎng)基中氫離子濃度對(duì)滅菌的影響培養(yǎng)基中氫離子濃度直接影響滅菌的效果。培養(yǎng)基的 酸堿度越大，所需殺滅微生物的溫度越低。 （5）微生物細(xì)胞中水分對(duì)滅菌的影響細(xì)胞含水越多，蛋白質(zhì)變性的溫度越底（6）微生物細(xì)胞菌齡對(duì)滅菌的影響老細(xì)胞水分含量低、低齡細(xì)胞水分含量高（7）空氣排除情況對(duì)滅菌的影響（8）攪拌對(duì)滅菌的影響（9）泡沫對(duì)滅菌的影響六、發(fā)酵罐的滅菌 培養(yǎng)基的滅菌如果是采用連續(xù)滅菌法。則發(fā)酵罐應(yīng)在加入滅菌的培養(yǎng)基前先行單獨(dú)滅菌。通常是用蒸汽加熱發(fā)酵罐的夾套或設(shè)管并從空氣分布管中通入蒸汽，充滿整個(gè)容器后，再?gòu)呐菤夤苤芯従徟懦?。容器?nèi)的蒸汽壓力保持1公斤，20分鐘。在保溫結(jié)束后，關(guān)