兔髂動脈內(nèi)膜損傷后PDGF-BmRNA在血管壁原位表達(dá)增強(qiáng)

1、    兔髂動脈內(nèi)膜損傷后PDGF-B mRNA在血管壁原位表達(dá)增強(qiáng)    +2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A    文章編號 1000-4718(2000)07-0603-03    The in situ expression of PDGF-B mRNA increased after the denudation of    rabbit iliac arteries  &

2、#160; JI Jun, FANG Wei-hua, SI Lu-sheng, LING Wen-ping    (Department of Pathology, Shenzhen Cardiovascular Hospital, Shenzhen 518001， China)    Abstract AIM: To elucidate the in vivo mechanisms of the proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCS)

3、 in injuried arteries. METHODS: A VSMCS proliferative model was constructed by injury of rabbit iliac arteries with balloon catheters and a probe designed for rabbit platelet-derived growth factor B chain (PDGF-B ) mRNA was used to detect the expression of it by intimal VSMCS on the vascular cross s

4、ections using an in situ hybridization technique at the indicated times. The relation of this expression to the proliferation of VSMCS by their expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and vascular intimal areas were estimated. RESULTS: The expression of PDGF-B mRNA of intimal VSMCS w

5、as increased when calculating the intimal PDGF-B mRNA positive cells per millimetre area at ×400 magnification with average numbers of 31.93±14.64 in 1 week group, 26.50±9.25 in 2 weeks group and 24.85±13.65 in 4 weeks group. This was in accordance with the expression of PCNA by

6、VSMCS and the increase of intimal areas. CONCLUSION: The local production of PDGF-B by VSMCS via an autocrine mechanism is responsible for the continuous proliferation of these cells and formation of neointima after the injury. The probe designed is very useful for detecting rabbit PDGF-B mRNA. 

7、;   MeSH Muscle, smooth, vascular; Cells; Platelet-derived growth factor;Hybridization    血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCS)增殖涉及動脈粥樣硬化、再狹窄、高血壓病的多種病理過程，受血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor B chain，PDGF-B)的刺激1 。已證實(shí)，體外培養(yǎng)的血管壁細(xì)胞亦可產(chǎn)生PDGF-B2。然而，原位檢測球囊損傷的小鼠或大

8、鼠血管壁PDGF-B mRNA表達(dá)較為困難。為此，我們以兔為對象建立其髂動脈球囊損傷模型，用自行設(shè)計(jì)、合成的PDGF-B cDNA探針和原位雜交方法檢測內(nèi)皮損傷后血管內(nèi)膜細(xì)胞表達(dá)PDGF-B mRNA及其與VSMCS增生的關(guān)系。    材 料 和 方 法    一、 建立血管模型、分組和標(biāo)本制備    新西蘭純種兔40只，體重2.32.5 kg，雄性(第一軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供)，經(jīng)5%戊巴比妥(2535 mg*kg-1,iv)麻醉，向股淺動脈逆行插入直徑2.5 mm×

9、;20的球囊導(dǎo)管至腹主動脈造成髂動脈內(nèi)皮剝脫。術(shù)后普通飲食喂養(yǎng)。將動物分1、2 和4周觀察組每組10只；正常對照10只。各組于觀察結(jié)束后處死，立刻經(jīng)靜脈加壓滴注4%多聚甲醛固定后，無菌取出髂動脈，將每條髂動脈標(biāo)本分為近端段、中段和遠(yuǎn)端段，每段約810 mm， 常規(guī)石蠟包埋。將每個(gè)標(biāo)本的近、中、遠(yuǎn)各段分別作連續(xù)切片，切片厚度4 m，每段約切片200張，每隔10 張取切片做常規(guī)HE 染色、特殊染色(彈力纖維染色、 VG染色和Masson三色染色)、免疫組化和原位雜交。    二、免疫組織化學(xué)染色    采用標(biāo)記抗生蛋白

10、鏈菌素生物素染色法(labelled streptavidin biotin method，LSAB，DAKO 公司)。 一抗分別為鼠抗SMC-actin單克隆抗體(稀釋度為1200，DAKO)和鼠抗增殖細(xì)胞核抗原單克隆抗體(稀釋度為1400，DAKO)。按試劑盒說明操作。 分別選擇兔正常髂動脈中層VSMCS (-actin)和人肺低分化腺癌(增殖細(xì)胞核抗原)作為陽性對照，用PBS取代一抗體作陰性對照。計(jì)數(shù)各段動脈橫切面內(nèi)膜中200個(gè)細(xì)胞所占的增殖細(xì)胞核抗原陽性細(xì)胞數(shù)，求其平均值作為實(shí)際計(jì)數(shù)。    三、形態(tài)測量   

11、60;應(yīng)用多功能真彩色病理像分析系統(tǒng)(北京航空航天大學(xué)像中心產(chǎn)品)直接測量動脈近、中和遠(yuǎn)段各橫切面內(nèi)膜面積，求出平均數(shù)作為實(shí)際測量值。    四、寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)、合成與標(biāo)記    兔PDGF-B cDNA序列在文獻(xiàn)中未見報(bào)道。我們對比分析了大鼠、貓、豬和人PDGF-B cDNA序列，根據(jù)其同源性和探針設(shè)計(jì)原則自行設(shè)計(jì)和人工合成了檢測兔PDGF-B mRNA的探針。其序列如下：5-GAT CGC ACC AAT GCC AAC TTC CTG GTG TGG CCG CCC TGC GTG GAG GTG CAG

12、-3。采用Dig-11-ddUTP/dATP 3加尾法(試劑盒：Boehringer mannheim)標(biāo)記寡核苷酸探針。用斑點(diǎn)雜交方法估計(jì)探針標(biāo)記的效率和特異性(1)。    五、原位雜交及陽性產(chǎn)物判斷    將常規(guī)原位雜交方法進(jìn)行部分改良，方法簡述如下：切片經(jīng)常規(guī)雜交前處理后行DNA復(fù)性(42 ，10 min)；雜交(探針濃度1.5 ng*L-1)后行2×、0.5×和0.1×SSC粗洗，正常羊血清封閉，加抗地高辛抗體堿性磷酸酶復(fù)合物，NBT/BCIP避光顯色，常規(guī)封片。陽性信號為紫

13、蘭色顆粒狀沉淀物分布在VSMCS胞漿內(nèi)(2)。 為排除非特異性顯色及背景，設(shè)組織對照：正常兔髂動脈壁細(xì)胞雜交反應(yīng)為陰性；探針對照：省去標(biāo)記探針雜交為陰性反應(yīng)；標(biāo)記探針與未標(biāo)記探針競爭試驗(yàn)：加足量(10倍量)未標(biāo)記探針孵育后再加標(biāo)記探針雜交反應(yīng)為陰性。高倍視野(400×)下計(jì)數(shù)內(nèi)膜中(0.25 mm×mm)×4 面積中陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算均數(shù)作為實(shí)際計(jì)數(shù)。    各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示， 用t 檢驗(yàn)判斷均數(shù)差異顯著性。    結(jié) 果    

14、一、損傷后血管壁病理改變    損傷造成內(nèi)皮及部分內(nèi)膜壞死脫落，內(nèi)彈力板斷裂，血栓形成。1周時(shí)，內(nèi)膜增厚并主要由細(xì)胞構(gòu)成，大多為SMC-actin陽性，偶見巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和少許中性白細(xì)胞。之后數(shù)周，內(nèi)膜間質(zhì)增多加寬，管腔明顯狹窄，僅靠近腔面12層細(xì)胞仍保持增生肥大。內(nèi)膜面積測量結(jié)果見表1。 結(jié)果顯示，隨著損傷后時(shí)間延長內(nèi)膜面積逐漸增加， 2周前增加較明顯，之后逐漸變緩。    表1 血管損傷后不同時(shí)期內(nèi)膜面積的變化    Tab 1 Vascular intimal ar

15、ea measurement after injury(±s,n=10) Group    Intimal area (mm2)    1 week    0.52±0.18*    2 weeks    1.44±1.04    4 weeks    1.74±1.13

16、0;   *P<0.05, vs 2 weeks group; P<0.05, vs 1 week group    二、增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)與分布    正常血管壁不表達(dá)或僅見中層少數(shù)VSMCS和內(nèi)皮細(xì)胞微弱的表達(dá)。受損1周時(shí)，陽性細(xì)胞明顯增多并分布于內(nèi)膜全層，占內(nèi)膜細(xì)胞的43%73%(平均58.65%)(3) ；之后數(shù)周，陽性細(xì)胞減少，主要分布靠近管腔的內(nèi)膜，2和4周分別為44%49% (平均20.30%)和10%38% (平均18%)。 動脈中層持續(xù)有少數(shù)散在弱陽性細(xì)胞

17、。結(jié)果見表2。    表2 血管損傷后不同時(shí)期內(nèi)膜細(xì)胞PCNA的表達(dá)    Tab 2 PCNA expression of intimal VSMCS after injury(±s,n=10) Group    PCNA-positive cell numbers    1 week    117.30±21.73*    2 wee

18、ks    40.60±20.26    3 weeks    36.00±15.91    *P<0.05, vs 2 weeks group; P<0.05, vs 1 week group    三、PDGF-B mRNA在血管壁的表達(dá)和分布    正常血管壁未見陽性信號；損傷后增生的內(nèi)膜中見較多陽性細(xì)胞；中膜亦見少量散

19、在分布；計(jì)數(shù)損傷后不同時(shí)期內(nèi)膜中陽性細(xì)胞的結(jié)果見表3?？梢妰?nèi)膜表達(dá)PDGF-B mRNA持續(xù)至少4周(4)且與VSMCS增殖關(guān)系密切(r=0.8900，P<0.05)。表3 損傷后不同時(shí)期內(nèi)膜PDGF-B mRNA表達(dá)    Tab 2 PDGF-B mRNA expression of intimal cell after    injury(±s,n=10) Group    PDGF-B mRNA positive cells(1 mm2) &

20、#160;  1 week    31.93±14.63    2 weeks    26.50± 9.29    4 weeks    24.85±13.65    討 論    雖然球囊損傷后血管內(nèi)膜病變持續(xù)發(fā)展與血管壁細(xì)胞產(chǎn)生PDGF-B等生長因子有關(guān)3，但檢測小

21、鼠受損的血管橫斷面未發(fā)現(xiàn)有PDGF-B mRNA表達(dá)；之后，Lindner等4以同樣的方法檢測大鼠血管壁PDGF-B mRNA， 僅發(fā)現(xiàn)新生內(nèi)膜靠近腔面有散在少數(shù)的陽性細(xì)胞；改用特殊的an on face 技術(shù)展露全部腔面細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分VSMCS亞群表達(dá)PDGF-B mRNA且與新生內(nèi)膜的形成密切相關(guān)。對兔此方面的研究較少，主要是探針較難獲得。我們首次根據(jù)不同種屬PDGF-B cDNA序列的同源性自行設(shè)計(jì)合成了檢測兔PDGF-B mRNA的特異性寡核苷酸探針，對損傷的兔髂動脈壁橫切面進(jìn)行了檢測。 于損傷后1周增生的內(nèi)膜中PDGF-B mRNA陽性細(xì)胞明顯增多并達(dá)高峰，此時(shí)，亦是內(nèi)膜增生快速

22、期和VSMCS增殖的高峰階段，相關(guān)分析顯示PDGF-B mRNA表達(dá)與VSMCS增殖關(guān)系密切。此等表達(dá)的量和分布與增殖的一致性表明，它與VSMCS增殖和內(nèi)膜增厚有關(guān)。之后數(shù)周，內(nèi)膜仍維持一定PDGF-B mRNA表達(dá)水平并主要是靠近血管腔的內(nèi)膜陽性細(xì)胞較多， 這恰與增殖的VSMCS分布一致，表明PDGF-B可能在維持VSMCS增殖和內(nèi)膜病變的發(fā)展過程中起一定作用。我們觀察到在內(nèi)膜損傷后2周新生內(nèi)膜中細(xì)胞基質(zhì)開始增多并逐漸成為增生內(nèi)膜的主要成分。是否PDGF-B mRNA持續(xù)表達(dá)與細(xì)胞間質(zhì)的形成有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。我們設(shè)計(jì)的探針為原位研究PDGF-B mRNA表達(dá)及其調(diào)節(jié)和反義寡核苷酸治療提供了方便。    基金項(xiàng)目 深圳市科技局科研基金資助   &