17β雌二醇對(duì)胃粘膜細(xì)胞系GES1中ERα蛋白表達(dá)影響

1、17 &雌二醇對(duì)胃粘膜細(xì)胞系 GES-1中ER-a蛋白表達(dá)的影響6張尚昆（江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室湖北武漢430056）摘要：觀察不同濃度雌二醇處理不同時(shí)間的情況下，人正常胃粘膜細(xì)胞系GES-1中ER-a蛋白表達(dá)量的變化，探討正常胃粘膜細(xì)胞中雌激素對(duì) ER-a蛋白表達(dá) 可能存在的影響.方法：GES-1 細(xì)胞經(jīng) 5X10-6mol/L、5X10-8mol/L、10-12mol/L 和 10-14mol/L 的 17 &雌二醇（17 -estradiol, E2）處理 24h,應(yīng)用 Western Blot 及灰 度分析的方法檢測(cè)蛋白表達(dá)量的改變，平均光密度值采用 t

2、檢驗(yàn)分析。關(guān)鍵詞：雌激素；ER-a;正常胃黏膜細(xì)胞系胃癌是中國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一"，其男女發(fā)病率為2： 1。Sipponen等發(fā)現(xiàn) 女性胃癌發(fā)生時(shí)間較男性推遲10-15年，絕經(jīng)期后發(fā)病率與男性相近'2。經(jīng)典的雌激素受體 a （estrogen receptor ,aER- a，又稱(chēng) ER- a 66在胃癌中表達(dá)率遠(yuǎn) 較乳腺癌低（2%-28%），長(zhǎng)期以來(lái)胃癌被認(rèn)為是非雌激素依賴(lài)性腫瘤。近期 研究發(fā)現(xiàn)，選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑他莫昔芬（Tamoxifen，TAM ）與胃癌的發(fā)生有關(guān)2，雌激素在多種傳統(tǒng)意義上的非雌激素依賴(lài)腫瘤中發(fā)揮重要作用 I刀，但是，雌激素對(duì)正常胃細(xì)胞系是否也有影響

3、的研究尚不清楚。ER- a 3是 2005年發(fā)現(xiàn)的獨(dú)立存在的ER- a 66的同源異構(gòu)體。其在乳腺癌中 被證明與乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)相關(guān)，尤其是在ER-a陰性的乳腺癌中發(fā)揮重要作用，并已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ER- a 36寸ER- a 6« ER- B具有抑制作用'2'。ER- a 36®胃癌中 的表達(dá)情況和生物學(xué)作用未見(jiàn)報(bào)道。來(lái)自我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，人胃癌組織中 存在ER-a 36分子表達(dá)（mRNA和蛋白質(zhì)），并且癌組織中表達(dá)量高于癌旁組 織及正常組織，胃癌組織及胃癌細(xì)胞株中ER- a 36的表達(dá)高于 ER- a 66胃癌ER- a 36mRNAS達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)3&

4、#39;。A B3 iTo"1冃癌近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，胃癌與雌激素以及雌激素受體有關(guān)。在胃癌組織中檢測(cè)出了雌激素受體的存在。王陸佰等'8采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)了 4 株胃癌細(xì)胞 AGS、BGC-823、MKN-45、SGC-7901 中 ER- o36和 ER- a 66hRNA 的表達(dá)情況；采用半定量 RT-PCR方法檢測(cè)20例人胃腺癌組織中腫塊、癌旁組 織及正常組織中的 ER- a 36和ER- o66mRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示：ER- c36和 ER-a 66勺mRNA在胃癌細(xì)胞株和人體胃癌樣本中均有表達(dá)。胃癌細(xì)胞株中ER-036 表達(dá)量高于 ER- o66;

5、人體樣本中 ER-a6在正常組織表達(dá)量最高，ER- o36 在癌組織中表達(dá)量最高，且與患者的年齡、腫瘤的大小、組織學(xué)分級(jí)以及淋巴 結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。研究結(jié)果顯示：ER- «36在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮的作用可能大于ERa 66 ER- o36mRNA的高表達(dá)與胃癌的生物學(xué)行為相關(guān)。2雌激素受體ER- a的生物學(xué)效應(yīng)初步研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ER- «36具有細(xì)胞因子的作用，在細(xì)胞的生長(zhǎng)與凋亡 中發(fā)揮重要作用。傳統(tǒng)的雌激素受體 ER-(66為核受體，主要分布在細(xì)胞核中， 屬于核受體超家族成員，由配體激活存在于核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，行使其生物學(xué)效 應(yīng)。通過(guò)成骨細(xì)胞膜實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，與經(jīng)典的雌激素受體ER- &

6、#171;66不同，ER- 636為膜受體I，大量分布于細(xì)胞膜的表面，接收來(lái)自細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。作 為膜受體的ER- 636在生理、病理過(guò)程中發(fā)揮了與經(jīng)典ER- 036不同的生物學(xué)效應(yīng)。一般情況下，它可以介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，在細(xì)胞的內(nèi)外信息交流中發(fā) 揮重要作用。研究顯示，ER- 03既可以被雌激素激活，又可以被抗雌激素激活，通過(guò)Caveolin-1介導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路的激活促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖 1 Caveoli n-1單倍不足可以促進(jìn)正常乳腺細(xì)胞的早期轉(zhuǎn)化111】，其機(jī)制與ER-66介導(dǎo)的PI3 K/AKT信號(hào)通路的激活有關(guān)1;雌激素受體ER- 636參與了子宮內(nèi) 膜癌中睪酮誘導(dǎo)的

7、細(xì)胞增殖信號(hào)通路的調(diào)節(jié)1此外，雌激素受體ER- 636在肝癌和胃癌信號(hào)通路調(diào)節(jié)中亦發(fā)揮著重要的生理學(xué)作用。由于這種新型的雌激 素受體在機(jī)體中各個(gè)器官的分布以及調(diào)節(jié)作用與傳統(tǒng)的雌激素受體ER- 636具有一定的差異性，因此，值得我們更進(jìn)一步地研究和探討。3 ER-a在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)雌激素(estrogen, E)是一種由內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的類(lèi)固醇性激素，雌激素與 其靶器官乳腺等組織的腫瘤發(fā)生密切相關(guān)13。雌激素通過(guò)與雌激素受體(estrogen receptor，ER)的結(jié)合，傳遞細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)，對(duì)靶器官組織的腫瘤形 成產(chǎn)生影響。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，雌激素及雌激素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在非雌 激素依賴(lài)的

8、腫瘤如肺癌、膀胱癌及大腸癌等的發(fā)生中具有非常重要的作用 胃癌中雌激素及雌激素受體作用機(jī)制的研究，雖起步較早但一直未取得突破性 進(jìn)展。雌激素及雌激素受體在胃癌發(fā)生與發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移中是否存在并發(fā)揮何 種作用，相關(guān)研究仍無(wú)定論。早期的研究認(rèn)為，ER表達(dá)水平與胃癌病人的腫瘤大小、性別、年齡無(wú)明顯關(guān)系15 目前研究多認(rèn)為，ER陽(yáng)性的胃癌多為低分 化，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及漿膜侵犯，生物學(xué)行為不良，預(yù)后不佳1。國(guó)內(nèi)趙新漢等應(yīng)用原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)ER mRNA較ER蛋白有更高的陽(yáng)性表達(dá)，且多集中于 管狀腺癌、低分化腺癌、印戒細(xì)胞癌，ER mRNA的表達(dá)與胃癌生物學(xué)特征密切相關(guān)。Takanoa1等發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中

9、ER-u mRNA陽(yáng)性表達(dá)率為51%, ER- 沖RNA陽(yáng)性表達(dá)率為 73%;而在正常胃組織，ER- 6mRNA陽(yáng)性表達(dá)率為37%，ER-師RNA陽(yáng)性表達(dá)率為88%，且二者的表達(dá)變化和胃癌的轉(zhuǎn)移密切相 關(guān)。ER- 636是最早發(fā)現(xiàn)的雌激素受體-6亞型(即傳統(tǒng)觀念的ER-6，已有研究發(fā) 現(xiàn)在那些對(duì)雌激素敏感的細(xì)胞的增殖過(guò)程中，ER- 636可以起到活化促進(jìn)生長(zhǎng)基因表達(dá)的重要作用 。ER-636是王兆一等在2005年克隆并發(fā)現(xiàn)的雌激素受體- 6的新亞型，分子質(zhì)量為 35.7kU，經(jīng)過(guò)基因序列的測(cè)定、克隆技術(shù)和蛋白質(zhì)技 術(shù)的證實(shí)后，將該蛋白質(zhì)命名為 ER- a 3滬。與ER-a6相比，ER- o36

10、'廠缺少 AF-1和AF-2兩個(gè)轉(zhuǎn)錄功能激活域，其主要定位于細(xì)胞膜，通過(guò)膜雌激素受體 介導(dǎo)快速信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，產(chǎn)生各種生物學(xué)效應(yīng)，并與腫瘤細(xì)胞的分化、增殖及 凋亡等有密切關(guān)系。4雌激素的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用當(dāng)前仍存在爭(zhēng)議。Harris on等報(bào)道，雌激素不能調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)，而 近期觀點(diǎn)認(rèn)為，雌激素能促進(jìn)胃癌生長(zhǎng) '13'。本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)E2阿促進(jìn)胃癌細(xì)胞 生長(zhǎng)，在10-10, 10-11和10-12mol/L時(shí)，隨著E2 3濃度的降低生長(zhǎng)速度加快。該現(xiàn)象 與絕經(jīng)前期女性（生理狀態(tài)下高雌激素水平）胃癌發(fā)病率較男性胃癌低，絕經(jīng) 期后這種差異消失的臨床特點(diǎn)具有一致性 R。本研究首先

11、使用無(wú)酚紅培養(yǎng)基處 理細(xì)胞以去除細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中酚紅的類(lèi)雌激素作用，然后，使用1%的活性炭處理的胎牛血清進(jìn)行胃癌細(xì)胞培養(yǎng)，以降低其他生長(zhǎng)激素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，在 此基礎(chǔ)之上，給予不同濃度的E2 0處理細(xì)胞可以準(zhǔn)確的反映雌激素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的 作用效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雌激素確有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng)，且與雌激素的濃度有 關(guān)。據(jù)此推測(cè)，E2 可促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)。ER-a 3是2005年發(fā)現(xiàn)的ER-a的同源異構(gòu)體'2'。其蛋白分子質(zhì)量為36 kU,基因結(jié)構(gòu)特征為：缺少轉(zhuǎn)錄激活域 AF1和部分AF2，但保留有DNA結(jié)合 域、部分二聚化域和部分配體結(jié)合域，啟動(dòng)子與ER-a 66完全不同，并具有17個(gè)氨

12、基酸長(zhǎng)度的特征性序列。ER- a 36在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)及生物學(xué)作用尚無(wú)文 獻(xiàn)報(bào)告。本項(xiàng)研究在不同E2B處理?xiàng)l件下，觀察了 ER- a 3基因和蛋白質(zhì)水 平的表達(dá)變化。在mRNA水平，給予不同濃度的E2 B處理，ER-a 36勺表達(dá)量均 較未處理組增高，并有濃度依賴(lài)效應(yīng)。而在蛋白質(zhì)水平，ER-a 36勺表達(dá)變化與mRNA水平并非有完全一致的關(guān)系。表現(xiàn)為 ER- a 3蛋白的表達(dá)量與E2 B濃度呈 現(xiàn)依賴(lài)效應(yīng)，但在24h時(shí)，ER-a 36S白的表達(dá)量高于未處理組，而 48h時(shí)則均 低于未處理組。其結(jié)果顯示，給予雌激素作用后，胃癌細(xì)胞的ER-a 36 mRNA水平呈現(xiàn)持續(xù)的增加（24h和48h），

13、而ER-a 368白質(zhì)的表達(dá)量則出現(xiàn)先上升 （24h）后下降（48h）的變化趨勢(shì)。據(jù)此我們推測(cè)，雌激素可能通過(guò)調(diào)控位于 細(xì)胞膜上的ER- a 36分子，介導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)，E2-ER- a 36途徑在胃癌生長(zhǎng)調(diào) 控中可能發(fā)揮重要作用?；贓R-a 36在乳腺癌和結(jié)直腸癌中的生物學(xué)作用和相關(guān)作用機(jī)制的研究， 我們前期的工作發(fā)現(xiàn)，并結(jié)合上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，ER- a 3魴子可能在雌激素介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮比 ER-a 66g為重要的作用'仮。首先，在無(wú)雌激素 培養(yǎng)背景和雌激素處理的情況下，E2 P處理24h時(shí)，ER- a 3在 mRNA和蛋白表 達(dá)水平上隨著雌激素濃度的升高而增高，說(shuō)明

14、E2 B對(duì)胃癌細(xì)胞的促生長(zhǎng)作用是通過(guò)ER-a 36實(shí)現(xiàn)的，且胃癌細(xì)胞中存在轉(zhuǎn)錄水平對(duì) ER-a 3盼子的調(diào)控'其 次，在E2 B處理48h時(shí)，雖然ER- a 3在 mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)量仍與 E2 p 濃度變化一致，但蛋白表達(dá)量卻明顯降低，說(shuō)明隨著雌激素作用時(shí)間延長(zhǎng)，胃 癌細(xì)胞可能在翻譯水平對(duì)ER-a 3涪在調(diào)控，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步證實(shí)'16。5結(jié)束語(yǔ)本項(xiàng)研究通過(guò)使用不同濃度的17B雌二醇(17Bestradiol, E2)對(duì)人正常胃 粘膜細(xì)胞株GES-1進(jìn)行處理，觀察胃黏膜細(xì)胞ER-0蛋白水平的變化，探討雌激 素對(duì)胃正常細(xì)胞可能存在的調(diào)控作用。參考文獻(xiàn)123吳春曉，鄭瑩

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