VP-A-010-00紅霉素中二氯甲烷殘留檢驗方法驗證方案0112要點

1、編號：VP-A-012-00版本號：00紅霉素中二氯甲烷和三氯甲烷殘留檢驗方法驗證報告紅霉素中二氯甲烷和三氯甲烷殘留檢驗方法驗證報告Validation Report of Methylene Chloride and Chloroform ResidueTestMethod in Erythromycin驗證方案編號：VP-A-012-00版本號：00目 錄1. 概述21.1產品概述2.1.1.1產品名稱21.1.2產品化學結構式 21.2方法建立概述 2.2. 檢測方法32.1溶劑殘留接受標準 3.2.2方法描述3.2.2.1 儀器32.2.2 試劑32.2.3溶液配制32.2.4色譜條件

2、 32.2.5系統(tǒng)適應性42.2.6計算43驗證內容53.1試劑及儀器5.A. 檢測用試劑5B. 樣品5C. 儀器和設備53.2驗證溶液配制 5.3.3 操作6.3.4驗證項目6.3.4.1 精密度 63.4.2 .線性83.4.3回收率83.4.4定量限、檢測限 93.4.5.耐用性 104.驗證結果評定與結論 11121.概述1.1產品概述1.1.1產品名稱中文名：紅霉素英文名：ERYTHROMYCIN1.1.2產品化學結構式分子式：C37H67NO13結構式：ErythromycinMol. Formula叫R1R2A6 了出刑0詣734OHch3BC37H67NO12718Hch3CC

3、36H55NO13720OHH1.2方法建立概述我公司生產的紅霉素在生產過程中使用了二氯甲烷，該溶劑的測定方法按照 VP-A-004-00進行了驗證，但是由于使用了 FID檢測器，對二氯甲烷的靈敏度不高，因此 驗證結并不是很理想，特別是當二氯甲烷的濃度較低時，準確度難以保證，該方法使用電子捕獲檢測器（ECD對二氯甲烷的檢測重新驗證。試劑二氯甲烷中含有少量三氯甲烷， 因此同時對三氯甲烷也需要檢測監(jiān)控。色譜系統(tǒng)和條件參照美國藥典（USP 467專論和歐洲藥典（Ph.Eur）2.4.24專論。2.檢測方法2.1溶劑殘留接受標準溶劑二氯甲烷三氯甲烷限度600ppm60ppm2.2方法描述2.2.1儀器

4、萬分之一分析天平 Agile nt6890N GC with 7694E Headspace2.2.2試劑DMSO（HPLC）二氯甲烷（AR）;三氯甲烷（AR2.2.3溶液配制樣品溶液：取樣品約0.50g，精密稱定，用DMS溶解，并稀釋至50ml;溶劑溶液：取二氯甲烷約3.0g，三氯甲烷約0.3g，精密稱定，用DMSOS解，并稀釋至100ml，精密量取1.0ml，用水稀釋至100ml,精密量取1.0ml，用水稀釋至10ml?？瞻兹芤海喊凑杖軇┤芤旱呐渲品椒ㄅ渲瓶瞻兹芤?，但是沒有二氯甲烷和三氯甲烷。供試液：精密量取5.0ml樣品溶液+1.0ml空白溶液于20ml頂空瓶中；（三樣）對照液A:精密量

5、取5.0ml樣品溶液+1.0ml溶劑溶液于20ml頂空瓶中；（三樣） 對照液B:精密量取5.0ml DMSO +1.0ml空白溶液于20ml頂空瓶中.2.2.4色譜條件色譜柱：DB624 30mX 0.32mnrK 1.8um載氣：氮氣；流速：35cm/s ;頂空溫度：樣品瓶溫105C ；定量環(huán)溫110C ;傳輸線溫110C；進樣條件：加熱平衡45min，樣品瓶加壓0.5min，定量環(huán)充樣0.03min，定量環(huán)平衡0.2min，進樣 1.0min ；爐溫：40E保持15min,以20C/min的速度升溫至240E，保持2min；檢測器：ECD溫度250E，進樣口溫度140C。操作進樣對照液B；

6、進樣對照液A；進樣供試液。2.2.5系統(tǒng)適應性對照液A三針的RSD不大于10%2.2.6計算CH2CL2A Mr 100(AR - AT) M TppmCHCL3At M r 100(Ar -At) MtPPm其中：Ar為供試液平均峰面積；AR為對照液平均峰面積；M為對照液二氯甲烷或三氯甲烷的稱樣量;m為樣品的稱樣量。3驗證內容3.1試劑及儀器A 檢測用試劑試劑名稱批號廠家等級DMSO408168美國天地公司HPLC二氯甲烷20040325國藥集團化學試劑有限公司AR三氯甲烷0603092廣東汕頭市西隴化工廠ARB樣品樣品名稱紅霉素/批號ERY2-200707001/C 儀器和設備儀器名稱型號

7、數量校正有效期至氣相色譜儀6890N12009年5月17日自動頂空進樣器7694E12009年5月17日3.2驗證溶液配制樣品溶液配制：取樣品約2.5g，精密稱定，用DMS溶解并稀釋至250ml。對照儲備液：取二氯甲烷約 3.0g，三氯甲烷約0.3g，精密稱定，用DMS（溶解并稀釋 至100ml，精密量取1.0ml， 用水稀釋至100ml。 各濃度對照液：分別取對照儲備液 1.0ml，2.0ml，4.0ml，5.0ml和7.5ml于5個50ml 容量瓶中，用水稀釋至刻度。配制成 20% 40% 80% 100唏口 150%勺對照液?？瞻兹芤海喊凑諏φ找旱呐渲品椒ㄅ渲瓶瞻兹芤?，但是沒有二氯甲烷和

8、三氯甲烷。0%溶液：精密量取5.0ml樣品溶液+1.0ml空白溶液于20ml頂空瓶中（平行三樣）；20%-150%羊品溶液：精密量取5.0ml樣品溶液+1.0ml對應濃度對照液于20ml頂空瓶中（平行三樣）；100%對照溶液：精密量取 5.0ml DMSO +1.0ml對應濃度對照液（100%）于20ml頂空瓶 中（平行六樣）。3.3操作按照0%、20%、40%、80%、100%、150%樣品溶液、100%對照的順序進樣，記錄各 樣的峰面積，結果見表1。（以下記錄峰面積均為扣除空白后面積）表1溶液0%20%40%80%100%150%100%對照二氯甲烷55.4373.6719.41221.2

9、1516.12159.51615.01536.651.5383.6713.11233.91480.52099.61535.51546.556.0390.6736.01178.41450.02011.61516.21545.8平均值54.3382.6722.81211.21482.22090.21549.3RSD4.5%2.2%1.6%2.4%2.2%3.6%2.2%三氯甲烷372.01329.42634.44841.56295.39615.56536.66326.9332.51357.72603.44905.56144.99277.76271.76359.5363.81415.52707.44

10、724.56039.58909.26184.36296.2平均值256.11367.62648.44823.86159.99267.56329.2RSD5.8%3.2%2.0%1.9%2.1%3.8%1.9%操作人/日期：3.4驗證項目3.4.1.精密度1 系統(tǒng)精密度計算40%、80%、150%樣品溶液各自三針的RSD，查看系統(tǒng)精密度（具體數據參見表1）,結果見表2。表2溶液濃度40%80%150%二氯甲烷RSD1.6%2.4%3.6%三氯甲烷RSD2.0%1.9%3.8%2 方法精密度計算100%對照液6針的RSD,查看方法精密度，結果見表 3表3測定次數123456RSD二氯甲烷面積161

11、5.01536.61535.51546.51516.21545.82.2%三氯甲烷面積6536.66326.96271.76359.56184.36296.21.9%結論：該方法精密度良好，RSD均小于3.0%，能滿足分析要求。操作者/日期：3中間精密度按照3.3.2配制溶液40% （三份）、80% （三份）、和150% （三份），100%寸照溶液（六 份），在另一天由另一 QC員進行實驗。計算中間精密度，結果見表 4、表5。表4溶液濃度40%RSD80%RSD150%RSD二氯甲烷482.54.5%998.61.5%1621.72.0%477.41028.91583.3444.11011.6

12、1647.2三氯甲烷1951.53.6%4298.51.9%7371.92.2%1981.94464.97197.71850.14366.47523.3結論：中間精密度良好，RSD均小于5.0%，表明方法重現性較好操作者/日期：表5測定次數123456RSD二氯甲烷面積1290.01264.41216.01211.71226.21201.92.8%三氯甲烷面積6046.95560.45353.25309.25384.35366.85.1%結論：結果表明儀器精密度良好， 操作者/日期：RSD 小于 10.0%。3.4.2.線性把20%、40%、80%、100%, 150%樣品溶液的峰面積平均值分

13、別減去溶液0%的平均值，以溶液中二氯甲烷和三氯甲烷的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，進行二元線性回 歸，計算方法的線性和相關系數，結果見表 6。表6溶液濃度0%20%40%80%100%150%二氯甲烷峰面積54.3382.6722.81211.21482.22090.2調整面積/328.3668.51156.81427.92035.9三氯甲烷峰面積256.11367.62648.44823.86159.99267.5調整面積/1059.52351.34368.45683.48553.1二氯甲烷線性公式：y=43.215x + 112.26r2=0.9976三氯甲烷線性公式：y=1957.5x

14、 52.095r2=0.99962要求：r 0.98結論：線性關系良好，線性范圍分別為：二氯甲烷119891ppm,三氯甲烷1287ppm。 操作者/日期：3.4.3回收率把樣品溶液20%、40%、80%、100% 150%的峰面積平均值分別減去溶液 0%的平均值, 再除以對照100%的平均值，分別乘以5、2.5、1.25、1.0、0.667。以考察各個濃度下方法 的回收率。回收率應在80%-120%之間，結果見表7。溶液濃度0%20%二氯甲烷峰面積54.3382.6調整峰面積/328.3回收率/106%三氯甲烷峰面積256.11367.6調整峰面積/1059.5回收率/84%結論：二氯甲烷及

15、三氯甲烷回收率均在 80%1 收率為97%，說明用該方法進行測定，準確度- 但仍能滿足分析要求。操作者/日期：40%80%100%150%722.81211.21482.22090.2668.51156.81427.92035.9108%93%92%88%2648.44823.86159.99267.52351.34368.45683.48553.193%86%90%90%20%之間，符合回收率要求。二氯甲烷平均回 高；三氯甲烷平均回收率為89%，略偏低，3.4.4定量限、檢測限把對照100卿DMS不斷稀釋，計算待測信號的信噪比，以確定 待測溶劑的檢測限和 定量限，以及他們在樣品中的含量限度，

16、結果見表 &表8檢測限定量限S/N濃度(ug/ml)樣品中殘留量S/N濃度(ug/ml)樣品中殘留量二氯甲烷2.90.36ppm11.9120ppm三氯甲烷3.80.010.3ppm11.70.031ppm結論：由上述實驗可以看出，使用 ECD檢測器進行檢測，靈敏度高，響應值大。二氯甲烷 檢測限為6ppm，疋量限為20ppm；三氯甲烷檢測限為 0.3ppm,疋量限為1ppm。 操作者/日期：3.4.5.耐用性用對照100%S液來考察方法的耐用性，僅進行單因素條件試驗，不進行正交試驗（即 只改變某一個條件，其它條件不變），以二氯甲烷及三氯甲烷的峰面積為考查對象，計算 RSD結果見表9。方面包括如

17、下：1）頂空瓶平衡時間考查 40min、45min、50min ；2）色譜柱初始溫度考查 42C、40C、38C3 ）載氣流速 35cm/s、38cm/s、32cm/s表9123二氯甲烷三氯甲烷RTAreaRSDRTAreaRSD4540354.6811104.41.0%8.5763997.31.2%4538354.8721082.69.0923902.34542354.4601097.68.0213942.44040354.6571285.52.9%8.5354542.22.9%4540354.6561266.48.5324494.65040354.6581214.18.5374295.34540384.3131207.16.5%7.8884421.18.1%4540354.6811104.48.5763997.34540325.1311064.89.4133772.2結論：通過上述試驗可以看出，頂空平衡時間及色譜柱初始溫度的微小改變對結果基本上無 影響，其RSD勻小于3.0%;流速的改變對結果影響較大， RSD大于5.0%。操作者/日期：編號：VP-A-012-00版本號：00紅霉素中二氯甲烷和三氯甲烷殘