雌二醇對兔血管平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的影響

1、    雌二醇對兔血管平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)型 一氧化氮合酶的影響        【摘要】目的通過測定兔血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)一氧化氮(NO)產(chǎn)物及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表達(dá)，驗證雌二醇影響NO合成的機(jī)制。方法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量作為培養(yǎng)兔血管平滑肌細(xì)胞NO產(chǎn)物的指標(biāo)，用Northern雜交方法檢測培養(yǎng)兔血管平滑肌細(xì)胞iNOS表達(dá)。結(jié)果(1)雌二醇呈時間依賴關(guān)系(024 h, P<0.05）和劑量依賴關(guān)系（10-710-3 mol

2、/L，P<0.01)，增加白細(xì)胞介素-1刺激的血管平滑肌細(xì)胞所致NO產(chǎn)物。(2)雌二醇的這種效應(yīng)被NOS阻滯劑NG-單甲基-L-精氨酸(L-NMMA）阻滯。(3)雌二醇明顯增加白細(xì)胞介素-1刺激下的培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞iNOS mRNA的表達(dá)(P<0.01)。結(jié)論雌二醇通過激活白細(xì)胞介素-1刺激下的培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞的iNOS mRNA表達(dá)從而增加NO合成，提示雌激素抗動脈粥樣硬化可能部分是通過NO增加而介導(dǎo)的?！娟P(guān)鍵詞】雌二醇；一氧化氮；肌，平滑，血管 The effect of 17-estradiol on inducible nitric oxide synthase in

3、rat vascular smooth muscle cellsJIA Zhen, XIANG Nong, SUN Ming, et al. （Department of Cardiology, Beijing Friendship Hospital, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100050, China）【Abstract】ObjectiveTo evaluate the effect of 17-estradiol (E2) on nitric oxide (NO) synthesis by measuring the

4、production of NO and the expression of inducible NO synthase (iNOS) mRNA in cultured rabbit vascular smooth muscle cells (VSMC). MethodsNO product in the cultured cells was determined by measuring nitrite contents of the culture media and the expression of iNOS was assessed by Northern blot analysis

5、. Results17-estradiol significantly increased NO production in VSMC with a time-dependent (0-24 h, P<0.05) and a dose-dependent pattern (10-7-10-3 mol/L, P<0.01). The effect of 17-estradiol was significantly inhibited in the presence of NG-monomethyl-L-arginine. 17-estradiol increased NO produ

6、ction and iNOS mRNA expression in VSMC stimulated by interleukin-1. Conclusions17-estradiol augments NO synthesis in VSMC stimulated by interleukin-1 through inducing the expression of iNOS. This finding probably may account for the antiatherosclerotic effect of estrogen on the prevention of coronar

7、y artery disease.【Key words】17-estradiol;Nitric oxide;Muscle, smooth, vascular雌激素替代治療明顯減少冠狀動脈損傷事件的發(fā)生，已有一系列潛在機(jī)制用來解釋雌激素對冠狀動脈的保護(hù)作用1，其中一個保護(hù)機(jī)制是雌激素誘導(dǎo)一氧化氮（NO）釋放增多2。NO由NO合酶（NOS）催化L-精氨酸合成的。NO合酶有三種形式：型即神經(jīng)原型NOS（nNOS)；型即細(xì)胞因子刺激的誘導(dǎo)型NOS（iNOS)；型即內(nèi)皮源性結(jié)構(gòu)型NOS(eNOS)。iNOS不僅在內(nèi)毒素或(和)細(xì)胞因子處理的神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞中表達(dá)，且在內(nèi)毒素或(和)細(xì)

8、胞因子處理的主動脈環(huán)和培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)中表達(dá)3。雌二醇對血管內(nèi)皮細(xì)胞的iNOS的作用已有報道4，而對血管平滑肌細(xì)胞的保護(hù)作用研究較少, 故本研究通過雌二醇對兔血管平滑肌細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)和NO合成的影響，從而探討雌二醇對血管平滑肌細(xì)胞保護(hù)作用的可能機(jī)制。材料與方法1.材料：雌二醇(E2)、 NG-單甲基-L-精氨酸(L-NMMA)購于美國Sigma公司,Trizal試劑盒由上海華美公司提供, Griess reagent 試劑盒購于中國軍事科學(xué)院, 667 bp iNOS cDNA和GAPDH cDNA 由湖南醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院向旭東博士提供, 重組人白細(xì)胞介素-1(

9、IL-1)由湖南醫(yī)科大學(xué)臨床藥理中心牛喜林博士提供，其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。新西蘭白兔(雄性，2.22.8 kg/只)，由湖南醫(yī)科大學(xué)動物室提供,動物實驗經(jīng)湖南醫(yī)科大學(xué)動物管理辦公室批準(zhǔn)。2.細(xì)胞培養(yǎng)：用1%烏拉坦麻醉新西蘭白兔，在無菌條件下，取46 cm長胸主動脈，用加105 IU/L青霉素、10 g/L鏈霉素的Hanks液清洗3次，去除內(nèi)皮細(xì)胞，取中膜內(nèi)層，剪成1 mm大小的碎片，用23 ml 0.1%的I型膠原酶消化4 h，離心（1 000 rpm) 7 min，去上清液，用Hanks清洗2次，最后用含青霉素(105 IU/L)、鏈霉素(100 g/L)及20%小牛血清的199培養(yǎng)基

10、(pH 7.2)稀釋，放入50 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，靜置于37的CO2培養(yǎng)箱3天，待細(xì)胞呈放射形伸展、部分細(xì)胞長成單層和多層交錯致密層后即可傳代。用0.125%胰蛋白酶及0.2%EDTA消化細(xì)胞以12分瓶接種，進(jìn)行傳代。取38代細(xì)胞進(jìn)行實驗。3. NO測定: NO產(chǎn)物測定根據(jù)培養(yǎng)液中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量來確定5。分別用雙蒸水、IL-1(10 g/L）和IL-1（10 g/L）+E2（10-4 mol/L）刺激細(xì)胞(n=6)24 h，于0、6、12、18、24 h測定細(xì)胞培養(yǎng)液中NO產(chǎn)物；分別用E2及E2+IL-1(10 g/L) 刺激細(xì)胞(n=6)24 h,E2濃度從10-7 mol/L逐漸增

11、加至10-3 mol/L，測定細(xì)胞培養(yǎng)液中NO產(chǎn)物；用L-NMMA（1 mmol/L）預(yù)處理細(xì)胞(n=6) 2 h，再加用IL-1（10 g/L）及IL-1 (10 g/L)+E2 (10-4 mol/L)預(yù)處理細(xì)胞24 h,測定培養(yǎng)液中NO產(chǎn)物。4. Northern Blot雜交：按Traizal試劑盒說明書操作提取VSMC的總RNA。用隨機(jī)引物法標(biāo)記探針,按試劑盒說明書操作，將a-32PdATP分別標(biāo)記于200 ng iNOS探針,將已標(biāo)記的探針煮沸變性10 min，分別加入預(yù)雜交液中，密封雜交塑料袋后在雜交爐（42）雜交24 h。用X光片進(jìn)行放射自顯影，附加增感屏，-70曝光7天。用光

12、密度掃描儀掃描X光片，以O(shè)DiNOS/ODGAPDH取值進(jìn)行評價iNOS mRNA的表達(dá)。5. 統(tǒng)計學(xué)方法: 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。用SPSS6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，采用方差分析及t檢驗等方法。結(jié)果1白細(xì)胞介素-1對血管平滑肌細(xì)胞NO產(chǎn)物的影響：雌二醇（10-4 mol/L）呈時間依賴關(guān)系增加白細(xì)胞介素-1（10 g/L）刺激下的血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生NO產(chǎn)物。持續(xù)用雌二醇（10-4 mol/L）預(yù)處理血管平滑肌細(xì)胞, 白細(xì)胞介素-1刺激的NO產(chǎn)物濃度明顯增加（P<0.01），通過24 h的雌二醇預(yù)處理，白細(xì)胞介素-1刺激細(xì)胞產(chǎn)生的NO產(chǎn)物是未經(jīng)雌二醇處理的二倍(P<0.

13、05)。見1。1E2刺激VSMC產(chǎn)生NO的時效關(guān)系2劑量依賴關(guān)系：隨著雌二醇劑量加大（從10-710-4 mol/L)，白細(xì)胞介素-1刺激下的細(xì)胞產(chǎn)生的NO產(chǎn)物逐漸增加(P<0.01)，當(dāng)雌二醇劑量增加到10-3 mol/L時其效應(yīng)亦不再升高，在無白細(xì)胞介素-1刺激狀況下，雌二醇本身并不明顯增加NO產(chǎn)物。見2。2E2刺激VSMC產(chǎn)生NO的量效關(guān)系3先用NO合酶阻滯劑L-NMMA（1 mmol/L）預(yù)處理細(xì)胞2 h，雌二醇(10-4 mol/L)和白細(xì)胞介素-1（10 g/L）的效應(yīng)完全消失。見3。4Northern 雜交：未處理及僅雌二醇處理的細(xì)胞iNOS mRNA無明顯表達(dá)，通過白細(xì)胞

14、介素-1處理的細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)，而同時用白細(xì)胞介素-1和雌二醇處理的細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)尤為明顯（P<0.01)。3L-NMMA阻滯E2刺激VSMC產(chǎn)生NO的效應(yīng)討論相對男性和絕經(jīng)后婦女而言，雌激素降低了絕經(jīng)前婦女動脈粥樣硬化和冠心病事件發(fā)生率，雖雌激素的心血管保護(hù)作用已得到公認(rèn)，但其心血管的保護(hù)作用機(jī)理仍不十分清楚。到目前為止已提出了血脂、凝血因子、血糖代謝、胰島素的變化和動脈血壓的下降等方面來解釋雌激素誘導(dǎo)的心血管保護(hù)作用1，但這些方面仍不能完全解釋雌激素對心血管系統(tǒng)的正效應(yīng)。許多研究支持這樣一個觀點6，7：雌激素誘導(dǎo)NO釋放增加可能參與了心

15、血管的保護(hù)作用，因為在心血管疾病中（如高血壓病和動脈粥樣硬化）伴隨細(xì)胞因子增加(如IL-1),而NO含量是低下的。NO對心血管有保護(hù)作用，如血管舒張，阻滯血小板粘附和轉(zhuǎn)移，阻止血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移；從而證明NO是一個潛在的抗動脈粥樣硬化和抗纖維化的因子。本研究雌二醇影響血管平滑肌細(xì)胞NO合成的機(jī)理，表明雌二醇呈劑量依賴關(guān)系增加通過白細(xì)胞介素-1誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的NO產(chǎn)物。當(dāng)白細(xì)胞介素-1預(yù)處理后加雌二醇處理數(shù)小時后雌二醇的刺激效應(yīng)明顯增加，而雌激素本身無效應(yīng)。因而為雌二醇與NO產(chǎn)物之間存在因果關(guān)系提供了依據(jù)。試驗證明：性激素能調(diào)節(jié)NOS的活性,懷孕期動物以及通過雌二醇處理的非懷孕期雌性

16、和雄性動物的骨骼肌中NOS mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)8，9。目前大鼠iNOS基因已從巨噬細(xì)胞中克隆出來，而且在血管平滑肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)iNOS, 相對而言，iNOS更易于被激活，干擾素-（INF-）和脂多糖（LPS）能迅速增加基因的表達(dá)，雖然NO通過iNOS合成慢于通過cNOS，但其合成卻明顯高于cNOS合成10。本研究發(fā)現(xiàn)，雌二醇使白細(xì)胞介素-1誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)增加，表明iNOS增加可能是通過雌二醇介導(dǎo)的，故認(rèn)為NOS活性增加是由于酶合成（誘導(dǎo)型酶）增加所致。本研究結(jié)果證明離體iNOS的激素調(diào)節(jié)影響了iNOS表達(dá)。正常情況下白細(xì)胞介素-1并不增加，在高血壓病和動脈粥樣硬化等

17、病理情況下明顯增加，這樣可促進(jìn)雌激素發(fā)揮更有效的作用。NO可以在各種病理狀態(tài)下從血管組織中產(chǎn)生，并且調(diào)節(jié)血管收縮性和血管組織的細(xì)胞增殖。本研究證明雌二醇可以通過細(xì)胞因子刺激血管平滑肌細(xì)胞增加NO產(chǎn)生，其機(jī)制之一，可能是增加其iNOS水平。（本文編輯：諸永康）作者單位:賈真（100050 北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院心內(nèi)科）顧復(fù)生（100050 北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院心內(nèi)科）向農(nóng)（湖南醫(yī)科大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院心內(nèi)科）孫明（湖南醫(yī)科大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院心內(nèi)科）周宏研（湖南醫(yī)科大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院心內(nèi)科）參考文獻(xiàn)1，Stamfer MJ, Colditz GA, Willett WC, et

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