黃曲霉毒素檢驗（二）

1、黃曲霉毒素檢驗（二） 三、酶聯(lián)免疫分析法 1原理酶標微孔板用已知抗原包被后，洗除未吸附的抗原，加入一定量抗體抗原反應液(抗體與待測樣品提取液的混合液)，競爭孵育，在固相載體表面形成抗原抗體復合物：洗除多余抗體及游離的抗原抗體復合物，加入酶標志的其次抗體，與吸附在固體表面的抗原抗體復合物相結(jié)合，再加入酶的底物，在酶的催化作用下，底物被氧化，生成有色物質(zhì)，按照樣品的吸光度值，用標準曲線法計算樣品中抗原(aftb1)的含量。 2分析步驟 (1)樣品處理：樣品用甲醇-水(55+45)和提取，水浴揮干，殘渣用一定量甲醇-磷酸鹽緩沖溶液溶解、定量轉(zhuǎn)移至試管中，靜置備用。 對于脂肪含量低的大米、小米等樣品，

2、可以挺直用提取。 (2)測定：包被微孔板：用afb1-牛血清白蛋白(bsa)結(jié)合物包被酶標微孔板，4過夜；抗原抗體反應：將稀釋后的afb1單克隆抗體(一抗)與相同體積不同濃度的afb1標準溶液混合，4靜置：用作標準系列溶液；根據(jù)相同辦法，將afb1抗體與等體積的樣品提取液混合，4靜置，用作樣品分析溶液；封閉：用洗液洗滌包被好的酶標板后，用封閉液封閉；測定：將封閉好的酶標板再次洗滌后，加入抗原抗體反應液，一定條件下，競爭孵育。未結(jié)合的抗體和游離的抗原抗體復合物被洗掉，向酶標板孔內(nèi)加酶標二抗，孵育。加底物顯色，終止反應。在酶標儀上，在490nm波特長測定各孔的吸光度值。 3辦法解釋 (1) eli

3、sa法需要嚴格控制測定條件，否則誤差大，數(shù)據(jù)不行靠。本辦法對afb1的檢出限為0.01ug/kg。 (2)本辦法是間接競爭elisa法，因此，樣品中afb1的含量越高，吸光度值越低。二抗按照一抗的來源挑選，如一抗是鼠單抗，則二抗挑選酶標志的羊抗鼠或兔抗鼠抗體。 四、高效液相色譜法 (一)多功能柱凈化-柱前衍生高效液相色譜法 1原理樣品中的黃曲霉毒素經(jīng)乙腈-水提取，過濾，濾液經(jīng)多功能凈化柱后，凈化液中黃曲霉毒素用衍生，c18柱分別，熒光檢測器檢測，以保留時光定性，標準曲線法定量。 2分析步驟 (1)樣品處理：稱取適量粉碎勻稱的樣品，加乙腈-水(86+14)溶液振蕩提取，過濾，濾液供凈化用。取一定

4、量濾液加入多功能凈化柱的玻璃管內(nèi)，將多功能凈化柱的填料管插入玻璃管中，并緩慢推進填料管，凈化后的液體被收集到多功能凈化柱的收集池中。 (2)衍生化反應：取凈化液適量，在真空下或氮吹條件下吹干，溶解，用在(401)烘箱中衍生。衍生后再次吹干，用乙腈-水(15+85)溶解，混勻，離心，上清液供測定用。標準系列溶液按同法衍生化處理。(3)色譜參考條件：c18色譜柱(125 mm2.1mm, 5um)；柱溫30；流淌相為乙腈-水，梯度洗脫；流速為0.5ml/min；熒光檢測器，ex：360nm, em：440nm。 3辦法解釋多功能凈化柱是一種內(nèi)裝有反相離子交換吸附劑的小柱，能吸附脂肪、色素和碳水化合

5、物等干擾物質(zhì)，從而達到凈化的作用；提取液過多功能柱凈化時，速度要慢，過快會引起雜質(zhì)去除不徹低。本辦法檢測黃曲霉毒素b1、b2、g1、g2時，色譜出峰挨次為g1、b1、g2、b2。 (二)免疫親和層析-高效液相色譜法 1原理試樣用甲醇-水提取后，用免疫親和層析柱凈化，以水或含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液洗柱除去雜質(zhì)，再用甲醇洗脫交聯(lián)在柱上的黃曲霉毒素，洗脫液經(jīng)高效液相色譜分別，柱后衍生后，熒光檢測器檢測，標準曲線法定量。 2.分析步驟 (1)樣品處理：取適量試樣加入和甲醇-水(7+3)，高速攪拌提取，過濾，精確取一定量濾液，用水稀釋，過玻璃纖維濾紙12次，濾液備用。醬油樣品按照含水量挑選加甲醇的量，食醋樣品需用ph 7.0磷酸鹽緩沖液稀釋后，再加提取。將免疫親和柱與玻璃注射器相接，樣品提取液注入玻璃注射器中，以水淋洗柱子2次，再用定量體積的甲醇洗脫，洗脫液供檢測用。醬油、食醋樣品提取液過柱后，需先用含0.1吐溫的磷酸鹽緩沖液清洗，再用水淋洗。 (2)測定：柱后衍生和色譜參考條件為c18色譜柱(150mm4.6mm, 5um )；甲醇-水(45+55)作流淌相，流速為0.8ml/min；柱后衍生化系統(tǒng)；0.05碘溶液衍生，反應管溫度70；熒光檢測器：ex: 365nm，em：440nm。