抑制一氧化氮合成對(duì)急性肺損傷炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用

1、    抑制一氧化氮合成對(duì)急性肺損傷炎癥反應(yīng)的 調(diào)節(jié)作用         摘要：目的：研究抑制一氧化氮對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)肺損傷炎癥反應(yīng)的影響。方法：ELISA檢測(cè)TNF、IL-1、IL-6和IL-10濃度，Griess法測(cè)定亞硝酸鹽濃度。肺濕干重比反映小鼠肺損傷程度。結(jié)果：小鼠腹腔注射LPS20mgkg后，血漿及肺泡灌洗液(BALF)中TNF、IL-1、IL-6、IL-10和亞硝酸鹽濃度顯著升高。LPS注射前30min給予地塞米松70mgkg，血漿TNF、IL-

2、1、IL-6、IL-10及亞硝酸鹽濃度明顯降低，而BALF中IL-1、IL-6、IL-10濃度明顯降低。給予一氧化氮合酶抑制劑S-硫酸甲基異硫脲（SMT）85 mgkg，血漿IL-1和IL-6明顯升高，BALF中TNF明顯升高，而IL-1、IL-6和IL-10無明顯改變。與LPS組相比，地塞米松組肺濕干重比明顯降低，而SMT組相反。結(jié)論：抑制一氧化氮引起促炎性細(xì)胞因子釋放增加，并加重肺損傷。關(guān)鍵詞：一氧化氮細(xì)胞因子急性肺損傷Effects of nitric oxide inhibition on inflammatory response in acute lung injuryQiu Ha

3、ibo，Chen Dechang，Pan Jiaqi，et alDepartment of Critical Care Medicine，Nanjing Railway Medical College Hospital，Nanjing 210009AbstractAim：To observe the effects of nitric oxide inhibition on inflammatory reaction by lipopolysaccharides（LPS）-induced lung injuryMethods：The levels of tumor necrosis facto

4、r-（TNF），interleukin-1(IL-1），IL-6，and IL-10 in mouse bronchoalveolar lavage fluid（BALF）and plasma were measured by ELISANitrite was measured by Griess reactionIn animal model，the degree of LPS-induced acute lung injury was evaluated by the wet and dryweight ratio of lungResults：The levels of TNF，IL-1

5、，IL-6，IL-10 and nitrite in mice plasma and BALF after LPS 20 mgkg ip increased markedly at 12 hDexamethasone（Dex）70mgkg injected ip at 30 min before ip LPS decreased the concentrations of TNF，IL-1，IL-6，IL-10，and nitrite in plasmaBut IL-1，IL-6，and IL-10 decreased in BALFS-methylisothiourea sulfate（SM

6、T），a nitric oxide synthetase inhibitor，85mgkg injected ip at 30 min before LPS increased the levels of IL-1，and IL-6 in plasmaIn BALE，TNF increased，whereas IL-1，IL-6，and IL-10 remained unchangedCompared to LPS group，the wet and dry lung weight ratio decreased significantly in Dex group，but the ratio

7、 increased in SMT groupConclusion：Inhibition of nitric oxide may result an enhanced production of proinflammatory cytokines and an increased LPS-induced lung injuryKey wordsNitric oxideCytokineAcute lung injury目前，急性肺損傷仍然是危重病人的重要病死原因之一，深入探討其發(fā)病機(jī)理和有效治療手段具有重要的臨床意義1。機(jī)體炎癥反應(yīng)失控是導(dǎo)致急性肺損傷的根本原因2。在復(fù)雜的炎癥反應(yīng)中，腫瘤壞死因

8、子（TNF）、白細(xì)胞介素1（IL-1）和IL-6是導(dǎo)致急性肺損傷最重要的促炎性細(xì)胞因子3。抑制促炎性細(xì)胞因子釋放可能對(duì)控制急性肺損傷有益。一氧化氮是一種重要的自由基，參與機(jī)體復(fù)雜的生理過程。以往認(rèn)為一氧化氮是促炎介質(zhì)，參與組織損傷4。但最近的研究顯示一氧化氮對(duì)急性肺損傷具有一定的保護(hù)作用。為深入探討一氧化氮對(duì)肺損傷的作用，我們采用選擇性一氧化氮合酶抑制劑，抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，觀察其對(duì)促炎性細(xì)胞因子及肺損傷的影響。1材料與方法1.1材料脂多糖（LPS，EColi 0127：B8）、地塞米松和S-硫酸甲基異硫脲（SMT）購自Sigma。TNF、IL-1、IL-6和IL-10 ELISA試劑盒購

9、自Biosource。亞硝酸鹽檢測(cè)試劑盒購自邦定公司。昆明小鼠(雄性，1822g）購自中國醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。1.2方法通過LPS 20mgkg腹腔注射，復(fù)制小鼠急性肺損傷動(dòng)物模型。動(dòng)物分為生理鹽水、LPS、地塞米松和SMT組。生理鹽水、地塞米松和SMT組動(dòng)物分別在LPS注射前30min腹腔注射生理鹽水1ml、地塞米松70mgkg和SMT 85mgkg。LPS注射后12h處死動(dòng)物，留取肺泡灌洗液(BALF)和血漿，待測(cè)細(xì)胞因子和一氧化氮代謝產(chǎn)物。BALF留取方法：動(dòng)物處死后，切開頸部皮膚，分離氣管，穿刺插入靜脈留置針，生理鹽水灌洗肺肺泡支氣管，每次23ml，反復(fù)4次，將回收的灌洗液離心（20

10、00r×10min，4)，上清液分裝。肺濕重干重比的測(cè)定：小鼠處死后，開胸取雙肺，仔細(xì)切除肺外支氣管和脂肪組織，秤重則為肺濕重，之后，將肺置入80烤燥箱中，干燥48h至肺臟恒重。秤干肺組織重量，則為肺干重。細(xì)胞因子測(cè)定嚴(yán)格按說明書操作。通過比色法(即Griess法）檢測(cè)血漿和BALF中的亞硝酸鹽濃度。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)以x±s表示，各組間比較采用t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1地塞米松和SMT對(duì)肺損傷的影響LPS注射12h后，小鼠肺濕干重比顯著增加。與LPS組比較，地塞米松組動(dòng)物肺濕干重比顯著降低，而SMT組顯著升高（P0.05)(表1)。表1地塞米松和SMT對(duì)肺損傷濕干重比的影響（n7

11、，x±s）分組肺損傷濕干重比生理鹽水3.96±0.52*內(nèi)毒素5.95±0.99地塞米松4.54±1.06*SMT7.13±0.95*     與內(nèi)毒素組比較，*P0.05 2.2地塞米松和SMT對(duì)促炎性細(xì)胞因子釋放的影響與LPS組比較，地塞米松導(dǎo)致動(dòng)物血漿TNF、IL-1、IL-6及一氧化氮濃度顯著降低，同時(shí)BALF中IL-1、IL-6和IL-10濃度顯著降低。SMT導(dǎo)致血漿中IL-1和IL-6濃度顯著增加，但在BALF中，TNF升高，IL-1、IL-6和IL-10無明顯改變(表2)。表2地塞米松和SM

12、T對(duì)促炎性細(xì)胞因子釋放的影響（n5，x±s）分組TNF （ngL）IL-1 （ngL）IL-6 （ngL）血漿BALF血漿BALF血漿BALF生理鹽水0*0*0.2±0.2*14.7±2.4*80.3±44.9*204.3±27.2*內(nèi)毒素132.5±5.0229.3±20.3183.7±58.6168.8±41.93290.1±924.1374.8±233.7地塞米松72.8±20.0*216.0±65.90*57.9±8.7*67.6±45.

13、3156.8±93.6*SMT272.3±147.81128.6±336.9*228.5±36.8*250.9±113.75678.3±759.1*642.4±406.3     與內(nèi)毒素組比較，*P0.05 2.3地塞米松和SMT對(duì)IL-10和一氧化氮釋放的影響與LPS組比較，地塞米松和SMT均導(dǎo)致BALF中一氧化氮水平顯著降低，但對(duì)血漿一氧化氮水平無顯著影響。SMT導(dǎo)致BALF中IL-10顯著降低，但地塞米松和SMT對(duì)血漿中IL-10釋放均無明顯影響(表3)。表3地塞米松和SMT對(duì)

14、IL-10和一氧化氮釋放的影響（n5，x±s）分組IL-10 （ngL）亞硝酸鹽（molL）血漿BALF血漿BALF生理鹽水98.3±4.3118.9±27.1*8.8±5.0*7.2±1.4*內(nèi)毒素277.4±164.1302±126.827.6±17.917.9±4.1地塞米松232.3±93.5168.5±38.8*15.1±8.212.4±7.9*SMT238.9±144.6265.3±48.716.1±11.013.1

15、7;2.5*     與內(nèi)毒素組比較，*P0.05 3討論本研究著重探討了一氧化氮在急性肺損傷中的作用。肺濕干重比是反映肺毛細(xì)血管通透性的重要指標(biāo)，一定程度上能夠反映肺損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)顯示腹腔注射LPS后，急性肺損傷小鼠的肺濕干重比顯著增加，血漿和BALF中TNF、IL-1和IL-6等促炎介質(zhì)水平均顯著增加，同時(shí)血漿和BALF中一氧化氮釋放也顯著增加。提示一氧化氮參與了急性肺損傷的病理生理過程。本觀察顯示抑制一氧化氮合成導(dǎo)致肺濕干重比顯著增加，說明抑制一氧化氮可導(dǎo)致急性肺損傷惡化，提示一氧化氮對(duì)肺損傷具有保護(hù)性作用。這與以往的認(rèn)識(shí)明顯不同。本實(shí)驗(yàn)顯示以

16、SMT選擇性抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，BALF中TNF釋放顯著增加，血漿中IL-1和IL-6釋放也顯著增加。由此提示抑制一氧化氮合成，可導(dǎo)致TNF、IL-1和IL-6等促炎性細(xì)胞因子釋放增加，相反，一氧化氮可能對(duì)促炎性細(xì)胞因子釋放具有抑制作用。這一結(jié)果與Van Dervort的研究正好相反，他們發(fā)現(xiàn)一氧化氮對(duì)LPS誘導(dǎo)的TNF釋放具有抑制作用5。當(dāng)然，F(xiàn)lorquin的研究支持我們的結(jié)果，F(xiàn)lorquin發(fā)現(xiàn)抑制一氧化氮合成，可使B型腸毒素誘導(dǎo)的小鼠血漿TNF水平顯著升高6。由此可推測(cè)，抑制一氧化氮合成導(dǎo)致的肺損傷加重，可能與促炎介質(zhì)釋放反饋性增加有關(guān)。IL-10作為一種抗炎介質(zhì)，對(duì)促炎介質(zhì)釋放

17、具有抑制作用，防止促炎反應(yīng)失控7。本研究顯示小鼠腹腔注射LPS后，血漿和BALF中IL-10釋放均顯著增加。但值得注意的是，SMT抑制一氧化氮釋放后導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子釋放增加的同時(shí)，抗炎介質(zhì)IL-10的釋放并未增加，由此可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控加重，引起炎癥性的自身性組織破壞，使肺損傷惡化。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，在體外抑制一氧化氮釋放，并不影響TNF的合成8，這與本文在體內(nèi)研究結(jié)果不一致?？赡芘c在體內(nèi)情況下TNF的釋放受多種其它細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞的影響和調(diào)節(jié)有關(guān)。地塞米松是一氧化氮合酶的強(qiáng)烈抑制劑9。本觀察顯示地塞米松對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺損傷具有預(yù)防作用，血漿和BALF中TNF、IL-1和IL-6濃度顯

18、著降低，說明地塞米松對(duì)肺損傷的防治作用與其抑制促炎性細(xì)胞因子釋放有關(guān)。但非常有趣的是，地塞米松和SMT均對(duì)一氧化氮釋放具有強(qiáng)烈抑制作用，但SMT可引起促炎性細(xì)胞因子釋放增加，而地塞米松卻對(duì)促炎性細(xì)胞因子具有強(qiáng)烈的抑制作用?？梢姡厝姿珊蚐MT對(duì)一氧化氮具有類似的效應(yīng)，但對(duì)促炎性細(xì)胞因子具有不同的作用，其機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。總之，本研究顯示抑制一氧化氮可導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子釋放增加，進(jìn)而導(dǎo)致肺損傷惡化。一氧化氮可能對(duì)急性肺損傷具有保護(hù)性作用。作者單位：邱海波，南京鐵道醫(yī)學(xué)院附院急診科ICU210009 南京；陳德昌，潘家琦，劉大為，馬遂中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)院參考文獻(xiàn)1Ber

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20、t we do and do not know about cytokine regulationCrit Care Med，1996，24：1631723Shapiro L，Gelfand JACytokines and sepsis：pathophysiology and therapyNew Horizons，1993，1：13224Nathan CNitric oxide as a secondary product of mammalian cellsFASEB J，1992，6：305130585Van Dervort AL，Yan L，Madara PJ，et alNitric oxide regulates endotoxin-induced TNF production by human neu