慢病毒生產(chǎn)及使用操作手冊簿

1、實(shí)用文檔慢病毒生產(chǎn)及使用操作手冊一、實(shí)驗(yàn)流程制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，三種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提，共轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng) 48和72h后，分別收集 富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，病毒上清液通過超離心濃縮病毒。 以下內(nèi)容由漢恒生物科技（上海）有限公司精心整理總結(jié)。二、實(shí)驗(yàn)材料（一）慢病毒載體、包裝細(xì)胞和菌株該病毒包裝系統(tǒng)為三質(zhì)粒系統(tǒng)，組成為pspax2, pMD2G, pHBLV TM系列質(zhì)粒。1、載體信息（見附錄）2、細(xì)胞株 293T，慢病毒的包裝細(xì)胞，為貼壁依賴型成上皮樣細(xì)胞，生長培養(yǎng)基為 DMEMfr 10% FBS）。貼壁細(xì)胞

2、經(jīng)培養(yǎng)生長增殖形成單層細(xì)胞。3、菌株 大腸桿菌菌株DH5a。用于擴(kuò)增慢病毒載體和輔助包裝載體質(zhì)粒。三、包裝細(xì)胞293T細(xì)胞的培養(yǎng)（一）293T細(xì)胞的凍存隨著傳代的次數(shù)增加，293T細(xì)胞會出現(xiàn)生長狀態(tài)下降、突變等。為了防止此類現(xiàn)象的 出現(xiàn)，我們需要在開始就對細(xì)胞進(jìn)行大量凍存，以保證實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和持續(xù)性。在細(xì)胞對數(shù)生長期進(jìn)行凍存，增加細(xì)胞復(fù)蘇成活率。1、去掉上清液，加入 PBS洗去殘留的培養(yǎng)基；2、加入0.25%的胰酶，消化12min后，鏡下觀察細(xì)胞變圓，細(xì)胞間間隙加大時，去除 胰酶，加入新鮮培養(yǎng)基吹打混勻，移入離心管中。3、細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞全部晃下，加入 3mL 37 C預(yù)熱的10 % DMEM

3、用10mL移液管 進(jìn)行吹打，較大力吹打 68次即可，不留死角，之后，將所有細(xì)胞吸出，置于 15mL離心 管中，取50ul 混勻后的細(xì)胞于 1.5mL eppendorf 管中，力口入450ul 10% DMEM即為10 倍稀釋，混勻，取10ul細(xì)胞于計(jì)數(shù)板 中計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)板上共 4大格，每大格16小格。計(jì) 數(shù)時，4大格均計(jì) 數(shù)，總數(shù)除以4 （得每大格細(xì)胞數(shù)），再乘以10 （10倍稀釋），即 為實(shí) 際n萬/mL細(xì)胞濃度。4、細(xì)胞離心，1000rpm, 5min。去掉上清。5、根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果加入細(xì)胞凍存液（70%£全培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO重懸細(xì)胞，密度為3 x 10 6個/

4、ml。6、分裝進(jìn)細(xì)胞凍存管，放入凍存盒中，放入-80 C超低溫冰箱。7、第二天將細(xì)胞放于液氮罐中長久保存，并作記錄。保存過程中，要不時復(fù)蘇細(xì)胞檢 測細(xì)胞存活率，觀察細(xì)胞狀態(tài)等。（二）293T細(xì)胞的傳代當(dāng)細(xì)胞生長到匯合率達(dá)到 80%- 90%寸需要對細(xì)胞進(jìn)行傳代操作，以擴(kuò)大細(xì)胞數(shù)量，維 持細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。1、消化細(xì)胞，方法同細(xì)胞凍存。2、細(xì)胞離心結(jié)束后，加入完全培養(yǎng)基重懸。3、根據(jù)具體情況，將細(xì)胞分到10cm培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿補(bǔ)足到10ml培養(yǎng)基。4、將培養(yǎng)皿平穩(wěn)放回 37C、5%CO和95咐目對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（三）293T細(xì)胞的復(fù)蘇當(dāng)細(xì)胞傳代次數(shù)過多， 細(xì)胞狀態(tài)變差時，或者細(xì)胞出現(xiàn)

5、污染事故時，需要丟棄并對最初凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇。1、設(shè)置溫度為3742 c的水浴。2、查看細(xì)胞庫記錄，根據(jù)記錄從液氮罐中取出凍存的細(xì)胞（需戴上棉手套，防止被凍 傷），迅速丟入水浴鍋中并快速晃動，盡量在 12min內(nèi)使細(xì)胞溶液完全溶解。3、將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，并在其中加上1ml新鮮的完全培養(yǎng)基， 混勻后離 心，1000rpm, 5min。4、去掉上清，加入 5ml新鮮的完全培養(yǎng)基，混勻沉淀后，轉(zhuǎn)入6cm培養(yǎng)皿。5、將培養(yǎng)皿平穩(wěn)放入 37C、5%CO和95咐目對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6、第二天觀察細(xì)胞存活率。給細(xì)胞換一下培養(yǎng)基。以后每天觀察細(xì)胞生長情況。四、慢病毒包裝和濃縮（一）質(zhì)粒擴(kuò)

6、增構(gòu)建好的慢病毒載體和輔助質(zhì)粒需經(jīng)過大量抽提，濃度大于1ug/ul,A260/280 在1.7-1.8間方可用以包毒。推薦使用Qiagen大抽試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒的大量去內(nèi)毒素抽提。（二）傳293T細(xì)胞將培養(yǎng)293T細(xì)胞T75瓶中的培養(yǎng)基吸凈，加入2mL 4度冰箱取出的0.25%胰酶，使其均勻覆蓋瓶底，置于 37度培養(yǎng)箱中3-5min ,取出，搖晃可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞于底部脫離，將其全部 晃下，加入3mL 37度水浴中預(yù)熱的10% DMEM移液槍用10mL移液管進(jìn)行吹打，較大力吹 打6-8次即可，不留死角，瓶口處較難吹打可將移液管對準(zhǔn)培口，小力將培養(yǎng)基打出即可覆蓋到接近瓶口的細(xì)胞。之后，將所有細(xì)胞吸出，置于1

7、5mL離心管中，取50ul混勻后的細(xì)胞于1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10 % DMEM即為10倍稀釋，混勻，取 10ul細(xì)胞于 計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)板上共4大格，每大格16小格。計(jì)數(shù)時，4大格均計(jì)數(shù)，總數(shù)除以 4（得每大格細(xì)胞數(shù)），再乘以10 （10倍稀釋），即為實(shí)際 n萬/mL細(xì)胞濃度。傳代當(dāng)天記為第一天，若第二天進(jìn)行轉(zhuǎn)染，鋪 900-1000萬/T75;若第三天轉(zhuǎn)染，鋪 350-400萬/T75。 每瓶T75加10mL 10% DMEM&養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染當(dāng)天觀察細(xì)胞密度，80-90 %滿即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前無需換培養(yǎng)基。（三）做月旨轉(zhuǎn) complexDMEIW在

8、37度水浴中預(yù)熱，LipoFiter TM轉(zhuǎn)染試劑需恢復(fù)至室溫方可使用，使用前需搖勻。轉(zhuǎn)染每瓶T75的complex成分如下:pspax10 dgPMD2G10 dgpHBLVM系列載體10 dg轉(zhuǎn)染后6h換新鮮培液。注：LipoFiter TM轉(zhuǎn)染試劑為漢恒生物產(chǎn)品，使用說明參考LipoFiter TM說明書。（四）病毒收集轉(zhuǎn)染后48和72h分別兩次收集病毒上清（24h收集后置換新鮮培液），收集后以0.45科m濾器過濾，于40 mL超速離心管中，4 , 72000g/min離心120分鐘;（五）病毒重懸和保存500ul新鮮培養(yǎng)液重懸病毒沉淀，置于 -80度甚至液氮保存。五、感染目的細(xì)胞（一）

9、細(xì)胞準(zhǔn)備將狀態(tài)良好的目的細(xì)胞接種到24孔板，使細(xì)胞濃度為1x105/ml細(xì)胞，接種細(xì)胞數(shù)量因細(xì)胞的生長速度而略有不同，一般是保證第二天進(jìn)行病毒感染的時候細(xì)胞匯合率介于50%至70%：接。（二）病毒感染l.polybrene 的選擇：Polybrene:是帶正電的小分子， 與細(xì)胞表面的陰離子結(jié)合，提高慢病毒對細(xì)胞的感染效率，通常加入polybrene能提高感染效率210倍。Polybrene有一定的細(xì)胞毒性，有的細(xì)胞對polybrene的毒理反應(yīng)明顯，因此細(xì)胞感染時是否適合polybrene需要摸索；不同細(xì)胞對polybrene的敏感度不同，可以用110（ig/ml 的范圍篩選合適的濃度，以24

10、h內(nèi)細(xì)胞無明顯毒性反應(yīng)為佳，可參考文獻(xiàn)并進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索，polybrene 最常用的工作濃度為 68（ig/ml。注：1 ）漢恒生物的自產(chǎn)的Polybrene 產(chǎn)品，用戶可用以進(jìn)行輔助感染。提供的Polybrene母液保存在-20 （可保存1年以上），避免反復(fù)凍融3次以上，否則活性受影響。4c可保存2周。2） Polybrene預(yù)實(shí)驗(yàn)請先以對照病毒進(jìn)行摸索，部分細(xì)胞系MOI及Polybrene 的使用參見附表2。2 .感染細(xì)胞最佳MOI的測定MOI （ Multiplicity of Infection ,感染復(fù)數(shù)）是指每個細(xì)胞感染的病毒數(shù)，通常 MOI 越高，病毒整合到染色體的數(shù)量以及目的蛋

11、白的表達(dá)量越高。對于分裂活躍的細(xì)胞，比如Hela、293細(xì)胞，MOI=13時，80%A上的細(xì)胞均表達(dá)目的基因。而對于非分裂細(xì)胞，比如原代細(xì)胞，感染效率較低。需要進(jìn)行 MOI梯度摸索實(shí)驗(yàn)，選擇適合的MOI進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3 .感染步驟按實(shí)驗(yàn)需要將細(xì)胞鋪板（比如12孔板）。細(xì)胞數(shù)以第 2天密度約50私宜。37 C培養(yǎng)過夜。對于Polybrene可施加的細(xì)胞：準(zhǔn)備完全培養(yǎng)基和Polybrene 混合物，Polybrene 終濃度為摸索得到的最適終濃度。移去培養(yǎng)基并添加0.5 ml Polybrene/培養(yǎng)基混合物于每孔中（適用于24孔板，其他孔板請相應(yīng)調(diào)整體積。）對于不適用Polybrene的細(xì)胞，以上步

12、驟省略，直接進(jìn)入下面步驟。感染前，從冰箱取出并在37c水浴中快速融化病毒，吸去細(xì)胞原有培養(yǎng)基，加入1/2體積新鮮培養(yǎng)基，再將病毒原液加入細(xì)胞中，輕輕8字混勻。（具體加入的病毒數(shù)可參考附表1） 37 c小體積感染4小時，4小時后補(bǔ)齊培養(yǎng)基至正常體積。（感染時培養(yǎng)基體積表格 如下）病毒小培養(yǎng)體積感染表皿色表面積/cm對應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)液體 積病毒感染對應(yīng)細(xì)胞 培養(yǎng)液體積96-well-c20.3cm100ul50ul24-wellc 22 cm500ul250ul12-well4cm1ml500ul6-well210cm2ml1ml60mm220cm4ml2ml100mmcc 260cm10ml5ml慢

13、病毒感染4小時后補(bǔ)足至培養(yǎng)體積，感染24小時后換液，腺病毒感染2小時后直接換液感染后第二天（約24小時），吸去含病毒的培養(yǎng)液， 換上新鮮的完全培養(yǎng)液， 繼續(xù)37 C 培養(yǎng)。感染后48小時，對于帶 GFP報告基因的病毒，可通過熒光顯微鏡觀測GFP表達(dá)效率，對于攜帶Puromycin抗性基因的病毒，換上含適當(dāng)濃度的 Puromycin的新鮮完全培養(yǎng)液，篩 選穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞株（詳見下方）。注意：溶化的shRNA慢病毒顆粒置于冰上。反復(fù)凍溶或長時間將病毒顆粒暴露于常溫 可使病毒效價降低。4 .Puromycin抗性篩選：Puromycin標(biāo)準(zhǔn)的施加終濃度范圍為110（ig/ml,不同細(xì)胞 puromy

14、cin的工作濃度不同，請查找相關(guān)文獻(xiàn)（部分細(xì)胞參考用量見下圖），另外請?jiān)O(shè)不感染篩選對照（未經(jīng)過病毒 感染的野生型細(xì)胞），加入等量等濃度的puromycin 。部分細(xì)胞puromycin參考值Cell lineSpeciesPuromycin ( g/ml)293Human3HeLaHuman3B16Mouse1-3PC1.0Hamster10MC3T3-E1Mouse10H9C2Rat1MCF-7Human1-3MDA-MB義 X XHuman1-3HepG2Human2HT1080Human1A549Human1.5H1299Human2Human embroyonic stem cells

15、 (Human ESCSHuman1更多Puromycin使用濃度更新中，詳情請參考公司網(wǎng)站每2-3天換含puromycin的完全培養(yǎng)液一次，至不感染篩選對照組細(xì)胞被puromycin殺光，可進(jìn)行以下兩步操作（依照具體實(shí)驗(yàn)需要選擇）。不挑取單克?。簩⒏腥静⒑Y選后的細(xì)胞進(jìn)行傳代，并繼續(xù)施加puromycin進(jìn)行維持性篩選培養(yǎng)。連續(xù)篩選并傳3代后，凍存保重穩(wěn)定細(xì)胞株。挑取單克?。簩⒏腥静⒑Y選后的細(xì)胞挑選至少5個克隆進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增，并繼續(xù)施加puromycin進(jìn)行維持性篩選培養(yǎng)。擴(kuò)增完畢后western blot或者QPC斡測目的蛋白的表達(dá)。挑取表達(dá)適中的穩(wěn)定細(xì)胞株，連續(xù)篩選并傳3代后，凍存保重穩(wěn)定細(xì)

16、胞株。5 .感染懸浮細(xì)胞上面介紹的是針對貼壁細(xì)胞的感染方法，若是懸浮或半懸浮細(xì)胞，則需要通過平角離心轉(zhuǎn)染法，即將適量的病毒液加入細(xì)胞培養(yǎng)皿后，封好口，放入平角離心機(jī)后，低速 （500g-1000g/min ）離心1h,然后放入培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)即可。若由于實(shí)驗(yàn)條件有限，沒有平角離心機(jī)，可用離心管代替，將細(xì)胞吹打吸入離心管中，進(jìn)行低速離心，去掉大部分上清，然后加入適量的病毒液，室溫放置15min （不能超過半小時），然后將細(xì)胞和病毒液同時吸出轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中繼續(xù)病毒感染過夜后換液即可。6 .對于極難感染的細(xì)胞對于極難感染白細(xì)胞，如 DC （樹突狀細(xì)胞）等，可采用多次感染的方法，即感染 24小 時后，更

17、換新鮮病毒進(jìn)行二次感染，可顯著提升感染效率。附1:漢恒生物慢病毒質(zhì)粒圖譜過表達(dá)1 .單標(biāo)記2 .雙標(biāo)記IRES載體慢病毒過表達(dá)載體，ZSGreen/puro標(biāo)記T2A系列載體:ZsGreen-T2A-PuroRFP-T2A-PuroLuc-T2A-PuroZsGreen-T2A-LucRFP-T2A-luc干擾1.單標(biāo)記2.雙標(biāo)記IRES系列載體慢病毒shRNA干擾載體,ZSGreen/puro 標(biāo)記T2A系列載體：5LIRpLCnn / IpHBLV'UZsOHen-nA'PuwQ?»lbu.IAZjtirMnZsGreen-T2A-Puro”1®.Pl。

18、0n pHBLV.W.Luc TiA Puw1LS?SbsJXJvJtZALutLuc-T2A-PuroAntpf1Lufiurnr .尸 vHF"©” “sFBLVUf-RJTT PUJflBiniHIJ.雙'.11Hl1' 3 江葭八'n -Ri%T2ARjpRFP-T2A-Purof 4 .3。 V KHIZ/k/ h1mm"4ZaCrecnZsGreen-T2A-LucJLTRpf3LV-U6-RFPTM-LiK./y ' EmRIT2ARJFRFP-T2A-luc特殊用途用于融合蛋白構(gòu)建慢病毒載體啟動子替換1 ：跟血區(qū)地

19、向點(diǎn).9淳) SdaiGDZE)Tet-on system 慢病毒載體：單病毒系統(tǒng)，無須另外表達(dá)rtTA ,出毒率低，只做建系用，無法提供病毒Tet-on過表達(dá)系統(tǒng)，目的基因 插入MCS區(qū)，只在 DOX存在 下才表達(dá)，puro可持續(xù)表達(dá)， 用于篩選Tet-on干擾系統(tǒng)，應(yīng)用 mir30的sh-mir 結(jié)構(gòu)，與tuboRFP融合表達(dá)，加 DOX 時RFP和sh-mir結(jié)構(gòu)啟動表達(dá)，因此 會看到加Dox后24小時有熒光出現(xiàn)； puro為持續(xù)表達(dá)，用于篩選 注意：sh-mir合成非常貴附2:慢病毒滴度測定方法簡介：1、細(xì)胞準(zhǔn)備將生長狀態(tài)良好的 293T細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至1x105/ml,加入96孔

20、板，100ul/孔,為每個病毒準(zhǔn)備6個孔。放入37C, 5%CO潴養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2、加病毒第二天，在EP管中做3倍梯度稀釋，連續(xù) 6個稀釋度。稀釋方法如下：每種病毒準(zhǔn) 備6個1.5mlEP管，每管加入90ul培養(yǎng)液，往第一個管中加入 10ul病毒原液，混勻后， 吸取10ul加入第二個管混勻。以此類推，做十個稀釋度(103*10-3 )。3、追加培養(yǎng)液第三天，吸去帶有病毒的培養(yǎng)液，在每個孔中再加入100ul完全培養(yǎng)液，以利于細(xì)胞的生長。4、觀察結(jié)果并計(jì)算滴度第五天，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。滴度(PFU/ml)=細(xì)胞數(shù)*熒光百分比*MOI*病毒稀釋倍數(shù)*103附3:漢恒生物目的細(xì)胞慢病毒感染復(fù)數(shù)（M

21、OI與體積對應(yīng)表規(guī)格大約數(shù)目MOI 值加入病毒數(shù)獸 里慢病也MOI摸索時加入的體積梯度/ul96well2-5 X 10420-5 00.4-2.5 X 1064-25ul4; 12; 2048well_51-2 X 1020-5 00.2-1 X10720-100ul20; 60; 10024well2-3 X 10520-5 00.4-1.5 X10740-150ul40; 120; 20012well5X 10520-5 01-2.5 X107100-250U l100; 300; 5006well1-2 X10620-5 080.2-1 X100.2-1ml200; 600; 1000

22、35mmdish1-2 X10620-5 00.2-1 X1080.2-1ml200; 600; 100060mmdish2-4 X 10620-5 00.4-2 X1080.4-2ml400; 1200; 2000100mmdish6-10 X 10620-5 081.2-5 X101.2-5ml1200; 3600; 6000150mmdish1-2 X10720-5 00.2-1 X1092-10ml2000; 6000; 10000慢病毒滴度以108/ml為準(zhǔn)，其他滴度需相應(yīng)換算；大約細(xì)胞數(shù)目是根據(jù)80%-100%田胞密度估算而出，具體細(xì)胞數(shù)請種細(xì)胞時進(jìn)行 細(xì)胞計(jì)數(shù)。1) 24板長滿了

23、細(xì)胞大約有 3X105個細(xì)胞。 如果一天后要長到70% (2.1 X 105),建議1.2 1.4 X 105個細(xì)胞。因?yàn)榧?xì)胞剛放進(jìn)去的前幾個小時需要粘在生長表面及適應(yīng)新的生長 條件，不會達(dá)到24小時翻一倍的速度。其他規(guī)格培養(yǎng)可參照此確定相應(yīng)culture細(xì)胞量。2) MO值：MOI是multiplicity of infection的縮寫，中文譯為感染復(fù)數(shù) ，實(shí)際的含義即為每個細(xì)胞被多少個有活力病毒所感染。各種細(xì)胞的最適MO值有差別，請客戶正式實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最適MOL附4:慢病毒MOI感染參數(shù)注：不同實(shí)驗(yàn)室由于細(xì)胞的來源、代數(shù)和細(xì)胞狀態(tài)等因素的影響，MOI值也略有差異,以下數(shù)據(jù)是在細(xì)

24、胞感染效率在85-100%細(xì)胞狀態(tài)良好的情況下獲得的，僅供參考。細(xì)胞系名稱細(xì)胞描述MOI值范圍能否添加polybreneK562人白血病細(xì)胞20 40可Jurkat人白血病細(xì)胞株50 80/、可kasumi人白血病細(xì)胞株10 30/、可NB4人白血病細(xì)胞株50 80/、可U937人單核細(xì)胞20 40可THP-1人單核細(xì)胞株50 80可GBC-SD人膽囊癌細(xì)胞株30 50/、可H929人多發(fā)性骨髓瘤 癥細(xì)胞系100150/、可H1299人非小細(xì)胞性肺 癌細(xì)胞13可95D人肺巨細(xì)胞癌24可A549人肺腺癌20 40可SPC-A-1人肺腺癌細(xì)胞100150可7402人肝癌細(xì)胞10 15可Hep 3B

25、人肝癌細(xì)胞10 30可Hep G2人肝癌細(xì)胞10 30可SMMC-7721人肝癌細(xì)胞10 30可Huh-7人肝癌細(xì)胞系10 30可Hela人宮頸癌細(xì)胞株10 30可HOS人骨肉瘤細(xì)胞系20 40可Hep-2人喉癌細(xì)胞株10 30可HL-60人急性髓系白血 病細(xì)胞株>100可HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞10 30可PKO人結(jié)腸癌細(xì)胞24可SW480人結(jié)腸癌細(xì)胞株10 30可DLD-1人結(jié)直腸腫瘤細(xì) 胞株10 30可SK-OV-3人卵巢癌細(xì)胞株24可SHG-44人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞10 30可U251人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤1八-3可U87人腦星型膠質(zhì)母 細(xì)胞瘤1八-3可293T人胚腎上皮細(xì)胞1八-3可HUVE

26、C-2C人臍靜脈血管內(nèi) 皮細(xì)胞10 30可PC-3人前列腺癌細(xì)胞20-40可MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞10 30可MCF-7人乳腺癌細(xì)胞株20-40/、可Tca8113人舌鱗狀細(xì)胞癌10 30可RPE人視網(wǎng)膜色素上 皮細(xì)胞10 30可AGS人胃癌細(xì)胞100150可BGC-823人胃癌細(xì)胞100150可SGC-7901人胃癌細(xì)胞10 30可MKN-28人胃癌細(xì)胞株20 40可MKN-45人胃低分化腺癌 細(xì)胞株20 40可BxPc-3人胰腺癌細(xì)胞20 40可CFPAC-1人胰腺癌細(xì)胞50 80可Panc-1人胰腺癌細(xì)胞24可HEC-1-B人子宮內(nèi)膜癌細(xì) 胞株24可NIH-3T3小鼠成纖維細(xì)胞

27、 系20 40可Raw264.7小鼠單核巨噬細(xì) 胞白血病細(xì)胞1030（感染后分 化）/、可CHO中國倉鼠卵巢細(xì) 胞20 40可HSC-T6大鼠肝星型細(xì)胞10 30/、可C6大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì) 胞>100可NRK大鼠腎細(xì)胞10 30可附5:漢恒生物各病毒載體感染目的細(xì)胞比較腺病是慢病母逆轉(zhuǎn)錄病毒感染方式直接加入直接加入直接加入換液時間感染后2h感染后24h感染后24h是否需要篩選不需要，腺病毒感 染能力很強(qiáng)需要篩選獲得 穩(wěn)TE感染株，慢病母 的感染能力不強(qiáng)需要篩選獲得 穩(wěn)定感染株，逆轉(zhuǎn)錄 病毒的感染能力不 強(qiáng)觀察時間如帶有GFP等熒 光標(biāo)簽，24h后可觀察 到熒光，36h可達(dá)到表 達(dá)高峰，若不

28、帶后熒光 標(biāo)簽，則需要鑒定帶啟GFP熒光 標(biāo)簽，24h后可以觀 察到表達(dá)，36h達(dá)到 高峰，若不帶后熒光 標(biāo)簽，則不引直接觀 察到，需要鑒定帶啟GFP熒光 標(biāo)簽，24h后可以觀 察到表達(dá)，36h達(dá)到 高峰，若不帶后熒光 標(biāo)簽，則不引直接觀 察到，需要鑒定是否需要助轉(zhuǎn)劑不需要有時需要，但是 根據(jù)具體情況操作， 因?yàn)橹D(zhuǎn)劑，如 polybrene ,對細(xì)胞 的傷害比較大，有的 細(xì)胞可能承受/、了有時需要，但是 根據(jù)具體情況操作， 因?yàn)橹D(zhuǎn)劑，如 polybrene ,對細(xì)胞 的傷害比較大，有的 細(xì)胞可能承受/、了附6:漢恒生物病毒包裝周期表腺病是慢病母過表達(dá)干擾過表達(dá)感染目的序 列獲得35天24天目的序 列獲得35天24天穿梭質(zhì) 粒構(gòu)建312天312天重組表 達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建812天812天質(zhì)粒重 組510天510天慢病毒 包裝510天510天腺病毒 包裝12 15天12 15天病毒濃 縮（可選）12天1