《抗體工程制藥》

1、整理課件 抗體工程制藥抗體工程制藥整理課件一.概述 抗體抗體( (工程工程) )制藥制藥生物技術(shù)制藥生物技術(shù)制藥領(lǐng)域的重要組成部分領(lǐng)域的重要組成部分整理課件整理課件抗體抗體：能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有 免疫功能的球蛋白免疫功能的球蛋白。整理課件抗體的產(chǎn)生過(guò)程：抗體的產(chǎn)生過(guò)程： 機(jī)體免疫系統(tǒng)受抗原機(jī)體免疫系統(tǒng)受抗原物質(zhì)刺激后，物質(zhì)刺激后，B B淋巴淋巴細(xì)胞細(xì)胞被激活，增殖和被激活，增殖和分化為漿細(xì)胞，由漿分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成和分泌的球細(xì)胞合成和分泌的球蛋白。蛋白。整理課件 免疫球蛋白免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)(immunoglobulin

2、,Ig)分子量范圍分子量范圍從從150,000150,000到到950,000950,000道爾頓。道爾頓。IgGIgG在血清中含量最高，達(dá)在血清中含量最高，達(dá)7575 80%,80%,是抗感染是抗感染 的主要抗體的主要抗體; ;IgMIgM是五類免疫球蛋白中分子量最大的，為是五類免疫球蛋白中分子量最大的，為 五聚體五聚體, ,是對(duì)一個(gè)抗原作出反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的是對(duì)一個(gè)抗原作出反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的 ；IgAIgA在黏膜表面、乳腺、淚腺形成，主要參在黏膜表面、乳腺、淚腺形成，主要參 與局部的免疫反應(yīng)與局部的免疫反應(yīng); ;IgDIgD在血清中含量很低在血清中含量很低; ;IgEIgE在血清含量最少。在血清含量最

3、少。整理課件動(dòng)物血清中產(chǎn)生抗體的時(shí)間示意圖抗原刺激的第一至三周，IgM生成；抗原再刺激后， Ig將取代IgM整理課件抗體研究的發(fā)展階段：抗體研究的發(fā)展階段：以以18901890年年BehringBehring發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)為代表為代表, ,用用抗原免疫動(dòng)物來(lái)獲得抗原免疫動(dòng)物來(lái)獲得多克隆抗體多克隆抗體。以以19751975年年Milstein & KohlerMilstein & Kohler創(chuàng)建創(chuàng)建制備制備單克隆抗體單克隆抗體(McAb)(McAb)為代表。為代表。以以19941994年年Winter,Winter,創(chuàng)建了創(chuàng)建了噬菌體抗體庫(kù)噬菌體抗體庫(kù)(repertoire of a

4、ntibodies displayed on (repertoire of antibodies displayed on phages)phages)技術(shù)技術(shù), ,以基因工程方法制備抗體為代以基因工程方法制備抗體為代表。在此基礎(chǔ)上發(fā)展成抗體工程。表。在此基礎(chǔ)上發(fā)展成抗體工程。整理課件多克隆抗體多克隆抗體: : 一種抗原一種抗原具有具有多個(gè)多個(gè)抗原決定簇抗原決定簇, ,每個(gè)每個(gè)抗原決定簇都能刺激抗原決定簇都能刺激B B細(xì)胞產(chǎn)生一種細(xì)胞產(chǎn)生一種抗體。這樣所獲得的免疫血清是多種抗抗體。這樣所獲得的免疫血清是多種抗體的混和物。體的混和物。單克隆抗體單克隆抗體( (Monoclonal antibod

5、yMonoclonal antibody McAb): McAb): 由由一個(gè)一個(gè)抗原決定簇抗原決定簇刺激的、刺激的、單一單一的的B B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合增殖后所產(chǎn)生的、細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合增殖后所產(chǎn)生的、高度均一高度均一的抗體。的抗體。1 234整理課件多克隆抗體和單克隆抗體多克隆抗體和單克隆抗體Pure single AbAfter immunization, the mouse spleen contains B cells producing specific antibodies.Each B cell produces only one kind of antibody, whi

6、ch binds to its specific antigen. Conventional antiserum is the mixture of all antibodies producedby B cells from spleen.If a single B cell was picked up and cultured, then it will produce only one kind of antibody. But B cell can not survive well in the culture.Each hybridoma line can produce pure

7、single antibody, called monoclonal antibody.If B cell is fused with myeloma, the fused cell might be cultured and produce antibody.Adapted from Milstein (1980) Scientific American, Oct. p.581234mmmm12341234MonoclonalantibodiesCell fusionSpleen cells+MyelomaxAntiseumAntigenImmunizationA mixture of al

8、l Ab1 234BALB/ c12341 234B cellPure single AbAfter immunization, the mouse spleen contains B cells producing specific antibodies.Each B cell produces only one kind of antibody, which binds to its specific antigen. Conventional antiserum is the mixture of all antibodies producedby B cells from spleen

9、.If a single B cell was picked up and cultured, then it will produce only one kind of antibody. But B cell can not survive well in the culture.Each hybridoma line can produce pure single antibody, called monoclonal antibody.If B cell is fused with myeloma, the fused cell might be cultured and produc

10、e antibody.Adapted from Milstein (1980) Scientific American, Oct. p.581234mmmm12341234MonoclonalantibodiesCell fusionSpleen cells+MyelomaxAntiseumAntigenImmunizationA mixture of all Ab1 234BALB/ c12341 234B cell整理課件二二. 單克隆抗體的制備單克隆抗體的制備整理課件二二. .單克隆抗體的制備單克隆抗體的制備單單克克隆隆抗抗體體制制備備過(guò)過(guò)程程圖圖解解整理課件單單克克隆隆抗抗體體制制備備

11、過(guò)過(guò)程程圖圖解解整理課件整理課件一一. .抗原與動(dòng)物免疫抗原與動(dòng)物免疫 1.1.抗原選擇抗原選擇 完整細(xì)胞完整細(xì)胞( (腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞) )；可溶；可溶 性蛋白質(zhì)或多肽性蛋白質(zhì)或多肽; ; 2. 2.免疫動(dòng)物免疫動(dòng)物 小鼠小鼠(Balb/C,(Balb/C,鼠齡鼠齡6-86-8周周) )或或 大鼠大鼠 (Lou);(Lou); 整理課件3.3.常用的骨髓瘤細(xì)胞系常用的骨髓瘤細(xì)胞系 SP2/0 SP2/0，細(xì)，細(xì) 胞，都是次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶胞，都是次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 (HGPRT)(HGPRT)的缺乏株的缺乏株。4.4.免疫方法免疫方法: : 體外免疫法；體內(nèi)免疫法體外免疫

12、法；體內(nèi)免疫法整理課件n體內(nèi)免疫法體內(nèi)免疫法 - - 顆粒性抗原顆粒性抗原( (如細(xì)菌、細(xì)胞如細(xì)菌、細(xì)胞) )的免疫原性強(qiáng)的免疫原性強(qiáng), ,可不加佐劑可不加佐劑, ,可溶性抗原則按每可溶性抗原則按每只小鼠只小鼠10-100ug10-100ug抗原與抗原與弗氏完全佐劑弗氏完全佐劑等量混合等量混合后注入腹腔內(nèi)后注入腹腔內(nèi). . 弗氏完全佐劑弗氏完全佐劑（FreundFreunds complete s complete adjuvant,FCAadjuvant,FCA）: : 由礦物油（如降脂烷或液由礦物油（如降脂烷或液體石蠟等）、乳化劑和滅活的分枝桿菌組成的體石蠟等）、乳化劑和滅活的分枝桿菌組成

13、的乳化佐劑。乳化佐劑。 弗氏不完全佐劑弗氏不完全佐劑不含不含分枝桿菌分枝桿菌 整理課件 免疫佐劑（adjuvant ) （1）定義：先于抗原或同時(shí)與抗原混合注射機(jī)體 可增強(qiáng)抗原的免疫原性的物質(zhì)。 （2）應(yīng)用 弱免疫原性物質(zhì)； 免疫原劑量不足。 （3）佐劑種類 1)油性乳劑弗氏佐劑弗氏佐劑（Freund adjuvant） 2)無(wú)機(jī)化合物 3)微生物及其產(chǎn)物 4)脂質(zhì)體 5)細(xì)胞因子整理課件二二. .細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) 1.1.細(xì)胞融合的基本方法細(xì)胞融合的基本方法(PEG(PEG促融促融) ) 脾細(xì)胞脾細(xì)胞 骨髓骨髓瘤瘤細(xì)胞細(xì)胞( (“永久永久”細(xì)胞

14、細(xì)胞) ) (1 (110108 8) (2) (2 3 310107 7) ) 聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG) 37-40 37-40 2mins 2mins 融合細(xì)胞融合細(xì)胞（雜交瘤細(xì)胞）（雜交瘤細(xì)胞） 用作細(xì)胞融合劑的聚乙二醇用作細(xì)胞融合劑的聚乙二醇(PEG)(PEG)一般選用一般選用MWMW40004000，常，常用濃度為用濃度為5050，pH8.2 pH8.2 ?？杉尤攵谆鶃嗧靠杉尤攵谆鶃嗧?DMSO)(DMSO)。 20022002年年1212月神舟月神舟4 4號(hào)飛船搭載號(hào)飛船搭載B B淋巴細(xì)胞和淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞升空進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)骨髓瘤細(xì)胞升空進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)整理課

15、件 原理：原理： 細(xì)胞進(jìn)行融合時(shí)，培養(yǎng)液中只有部分細(xì)胞細(xì)胞進(jìn)行融合時(shí)，培養(yǎng)液中只有部分細(xì)胞融合成雜種細(xì)胞，還有大量未融合的雙親細(xì)融合成雜種細(xì)胞，還有大量未融合的雙親細(xì)胞。這就需要選擇分離純化雜種細(xì)胞。為此胞。這就需要選擇分離純化雜種細(xì)胞。為此要要?jiǎng)?chuàng)造一種只讓雜種細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而親本細(xì)創(chuàng)造一種只讓雜種細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而親本細(xì)胞死亡的環(huán)境胞死亡的環(huán)境。這就要利用雜種細(xì)胞和親本。這就要利用雜種細(xì)胞和親本細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)條件的要求和代謝的差異來(lái)進(jìn)行細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)條件的要求和代謝的差異來(lái)進(jìn)行選擇。其中選擇。其中最常用的是最常用的是HATHAT選擇系統(tǒng)選擇系統(tǒng)。整理課件2 2、雜交瘤細(xì)胞的、雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)選擇性培

16、養(yǎng)n常用的選擇培養(yǎng)基為常用的選擇培養(yǎng)基為HATHAT培養(yǎng)基培養(yǎng)基。 次黃嘌呤次黃嘌呤(H)(H)、氨基喋呤、氨基喋呤( (A A能阻斷能阻斷DNADNA合成合成) )、 胸腺嘧啶胸腺嘧啶(T)(T)。n脾細(xì)胞具有脾細(xì)胞具有次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)(HGPRT), ,因此脾因此脾- -瘤融合的雜交瘤細(xì)胞可利用瘤融合的雜交瘤細(xì)胞可利用HGPRTHGPRT酶酶, ,用次黃嘌呤用次黃嘌呤(H)(H)和胸腺嘧啶和胸腺嘧啶(T)(T)合成合成DNA,DNA,使雜交瘤細(xì)胞得以生長(zhǎng)。使雜交瘤細(xì)胞得以生長(zhǎng)。 整理課件HAT選擇培養(yǎng)機(jī)制 主要途徑主要途徑 糖糖氨基酸氨

17、基酸 氨甲喋呤氨甲喋呤（A） 次黃嘌呤次黃嘌呤(H) GMP 核苷酸核苷酸 DNA HGPRT核苷酸前體核苷酸前體 TK(胸苷激酶)胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷(T) dTMP整理課件HAT培養(yǎng)基： H H 為次黃嘌呤，是HGPRT的底物，為DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料） A A 可阻斷正常的DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑制） T T 在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，為DNA合成提供原料整理課件n含有飼養(yǎng)細(xì)胞的含有飼養(yǎng)細(xì)胞的24/9624/96孔板內(nèi)懸浮培養(yǎng)，孔板內(nèi)懸浮培養(yǎng)，2 2 3 3天天換液一次換液一次(HAT(HAT的培養(yǎng)液的培養(yǎng)液7 7天內(nèi)天內(nèi)),),第第7 7

18、 1414天天改改用用HTHT培養(yǎng)液（對(duì)照阻的骨髓瘤細(xì)胞已死亡）培養(yǎng)液（對(duì)照阻的骨髓瘤細(xì)胞已死亡）1414天以后天以后用普通的用普通的RPMI1640RPMI1640完全培養(yǎng)液。完全培養(yǎng)液。n常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞等。胞和胸腺細(xì)胞等。n8 8 9 9天可對(duì)所有克隆生長(zhǎng)孔的培養(yǎng)上清進(jìn)行抗天可對(duì)所有克隆生長(zhǎng)孔的培養(yǎng)上清進(jìn)行抗體檢測(cè)體檢測(cè), ,篩選出產(chǎn)生抗體的陽(yáng)性克隆篩選出產(chǎn)生抗體的陽(yáng)性克隆. .整理課件培培 養(yǎng)養(yǎng) 板板整理課件B B細(xì)胞雜交瘤的技術(shù)流程細(xì)胞雜交瘤的技術(shù)流程整理課件三三. .篩選陽(yáng)性克隆與克隆化篩選陽(yáng)性克隆與克隆化 1

19、. 1.篩選方法：篩選方法： 免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù) 放射免疫技術(shù)放射免疫技術(shù) 免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù) 整理課件（1）免疫酶技術(shù)n原理：將原理：將抗原和抗體抗原和抗體的免疫反應(yīng)和的免疫反應(yīng)和酶的催化酶的催化反應(yīng)反應(yīng)相結(jié)合的技術(shù)。酶與抗體或抗原結(jié)合后，相結(jié)合的技術(shù)。酶與抗體或抗原結(jié)合后，既不改變抗體或抗原的免疫學(xué)反應(yīng)的特異性，既不改變抗體或抗原的免疫學(xué)反應(yīng)的特異性，也不影響酶本身的酶學(xué)活性，在相應(yīng)而合適也不影響酶本身的酶學(xué)活性，在相應(yīng)而合適的作用底物參與下，使的作用底物參與下，使基質(zhì)水解而呈色基質(zhì)水解而呈色，或，或使供氫體由使供氫體由無(wú)色的還原型無(wú)色的還原型變?yōu)樽優(yōu)橛猩难趸陀猩难趸?，從?/p>

20、表明某種抗原或抗體的存在。從而表明某種抗原或抗體的存在。 整理課件整理課件（2）免疫熒光技術(shù) 原理：原理： 將將抗原抗體抗原抗體反應(yīng)的特異性和敏感性與反應(yīng)的特異性和敏感性與顯微示顯微示蹤蹤的精確性相結(jié)合。以的精確性相結(jié)合。以熒光素?zé)晒馑刈鳛闃?biāo)記物，作為標(biāo)記物，與已知的抗體（或抗原）結(jié)合，然后將熒光與已知的抗體（或抗原）結(jié)合，然后將熒光素標(biāo)記的抗體或抗原作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，用于檢素標(biāo)記的抗體或抗原作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，用于檢測(cè)和鑒定抗原或抗體測(cè)和鑒定抗原或抗體。 免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)用于細(xì)胞抗原的抗體檢測(cè)用于細(xì)胞抗原的抗體檢測(cè), ,特特別是檢測(cè)患者活檢組織標(biāo)本。別是檢測(cè)患者活檢組織標(biāo)本。整理課件整理課件（

21、3）放射免疫技術(shù)n原理：將原理：將同位素同位素分析的高靈敏度與分析的高靈敏度與抗原抗原抗體抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合，以反應(yīng)的特異性相結(jié)合，以放射性同放射性同位素位素作為示蹤物的標(biāo)記免疫測(cè)定方法。作為示蹤物的標(biāo)記免疫測(cè)定方法。n放射免疫測(cè)定原理示意圖放射免疫測(cè)定原理示意圖整理課件 2. 2.克隆化克隆化 為提高篩選出來(lái)的陽(yáng)性克隆的穩(wěn)定性，為提高篩選出來(lái)的陽(yáng)性克隆的穩(wěn)定性，將將單個(gè)細(xì)胞通過(guò)無(wú)性繁殖而獲得細(xì)胞集單個(gè)細(xì)胞通過(guò)無(wú)性繁殖而獲得細(xì)胞集團(tuán)的整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程。團(tuán)的整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程。 n有限稀釋法有限稀釋法：通過(guò)一系列稀釋，使每個(gè)細(xì)胞：通過(guò)一系列稀釋，使每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔平均培養(yǎng)孔平均只含一個(gè)細(xì)胞只含一個(gè)細(xì)胞，

22、而分離細(xì)胞，而分離細(xì)胞n軟瓊脂法軟瓊脂法：將雜交瘤細(xì)胞懸液分散在半固體將雜交瘤細(xì)胞懸液分散在半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂糖上，使呈營(yíng)養(yǎng)瓊脂糖上，使呈單個(gè)細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞定位生長(zhǎng)繁殖，定位生長(zhǎng)繁殖，以達(dá)到克隆化的目的。以達(dá)到克隆化的目的。整理課件四四. .雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定 1. 1. 雜交瘤細(xì)胞借助染色體分析鑒定雜交瘤細(xì)胞借助染色體分析鑒定 多數(shù)為端著絲粒染色體多數(shù)為端著絲粒染色體, ,染色體數(shù)目染色體數(shù)目 接近兩種親本細(xì)胞染色體之和。接近兩種親本細(xì)胞染色體之和。 2. 2. 抗體鑒定抗體鑒定 IgIg類和亞類鑒定：免疫擴(kuò)散或類和亞類鑒定：免疫擴(kuò)散或 ELISA ELISA法法

23、 親和力鑒定親和力鑒定整理課件抗體類別鑒定（Ig類和亞類鑒定） 抗體分子因有大小、帶電量、溶解度及其抗體分子因有大小、帶電量、溶解度及其與抗原的作用不同，可分為不同的類和亞類。與抗原的作用不同，可分為不同的類和亞類。 IgGIgG（IgG1IgG1、IgG2IgG2、IgG3IgG3、IgG4IgG4） IgAIgA（IgA1IgA1、IgA2IgA2） IgMIgM（無(wú)）（無(wú)） IgD IgD （無(wú)）（無(wú)） IgE IgE （無(wú)）（無(wú)）整理課件1）免疫擴(kuò)散n指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在液相中液相中特異結(jié)合后，特異結(jié)合后，形成的免疫復(fù)合物受電解質(zhì)影響出現(xiàn)的形成的免疫復(fù)合物受

24、電解質(zhì)影響出現(xiàn)的沉淀線沉淀線現(xiàn)象?，F(xiàn)象。 單向免疫擴(kuò)散單向免疫擴(kuò)散 雙向免疫擴(kuò)散雙向免疫擴(kuò)散 整理課件（2）酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)n原理：先將抗體或抗原包被到某種固相載體表原理：先將抗體或抗原包被到某種固相載體表面，再將待檢樣本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步面，再將待檢樣本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)，驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)，用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離的未用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離的未結(jié)合成分，最后加入酶反應(yīng)底物，根據(jù)底物被結(jié)合成分，最后加入酶反應(yīng)底物，根據(jù)底物被酶催化產(chǎn)生的顏色及其吸光度酶催化產(chǎn)生的顏色及其吸光度(A)

25、(A)值的大小進(jìn)值的大小進(jìn)行定性或定量分析的方法。行定性或定量分析的方法。 整理課件ELISA整理課件ELISA整理課件五五. .單克隆抗體的工業(yè)化生產(chǎn)單克隆抗體的工業(yè)化生產(chǎn) 單克隆抗體的生產(chǎn)包括細(xì)胞培養(yǎng)、單克隆抗體的生產(chǎn)包括細(xì)胞培養(yǎng)、提純和制劑等工藝過(guò)程。提純和制劑等工藝過(guò)程。1.1.雜交瘤細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)n生物反應(yīng)器：氣升式發(fā)酵罐，中空纖維培養(yǎng)生物反應(yīng)器：氣升式發(fā)酵罐，中空纖維培養(yǎng) 罐，微囊發(fā)酵罐罐，微囊發(fā)酵罐n培養(yǎng)基：牛淋巴液，血清培養(yǎng)基：牛淋巴液，血清整理課件2.2.單克隆抗體的大量制備的方法單克隆抗體的大量制備的方法n體外培養(yǎng)法體外培養(yǎng)法 ( (收獲收獲10-4

26、00ug/ml10-400ug/ml抗體抗體) ) 酶標(biāo)板上培養(yǎng)酶標(biāo)板上培養(yǎng) 微載體懸浮培養(yǎng)（固體顆粒用微載體懸浮培養(yǎng)（固體顆粒用DEAE-Sephadex DEAE-Sephadex A50A50等材料）。等材料）。n動(dòng)物體內(nèi)誘生法動(dòng)物體內(nèi)誘生法 用降脂烷用降脂烷/ /液體石蠟注入液體石蠟注入腹腔腹腔, ,然后注射然后注射1 110106 6雜交瘤細(xì)胞，再雜交瘤細(xì)胞，再 收獲收獲5 5 2Omg/ml2Omg/ml抗體?？贵w。支原體污染！支原體污染！整理課件3.3.單克隆抗體單克隆抗體(McAb)的純化的純化純化單克隆抗體流程純化單克隆抗體流程( (大鼠大鼠) )單抗純化方法單抗純化方法:

27、: 超濾法超濾法 鹽析法鹽析法 離子交換法離子交換法 凝膠過(guò)濾法凝膠過(guò)濾法 HPLCHPLC法等法等整理課件三三. .單克隆抗體單克隆抗體藥物的現(xiàn)狀藥物的現(xiàn)狀n250250多種抗體類藥物在臨床試驗(yàn)中多種抗體類藥物在臨床試驗(yàn)中 1/31/3已進(jìn)入三期臨床已進(jìn)入三期臨床 1/41/4已通過(guò)臨床已通過(guò)臨床IIIIII期試驗(yàn)期試驗(yàn)n美國(guó)市場(chǎng)上有美國(guó)市場(chǎng)上有1313種治療用的抗體藥物種治療用的抗體藥物n抗體藥物的銷售額抗體藥物的銷售額0303年抗體類藥物總銷售額達(dá)到年抗體類藥物總銷售額達(dá)到5050億美元億美元整理課件抗體藥物市場(chǎng)銷售額抗體藥物市場(chǎng)銷售額0 020204040606080801001001

28、2012014014016016020022002 20032003 20042004 20052005 20062006 20072007 20082008年份年份銷售額（億美元）銷售額（億美元）2011整理課件全球有超過(guò)全球有超過(guò)200200家上市或未上市公司正在研發(fā)家上市或未上市公司正在研發(fā)用于臨床診斷和治療的單克隆抗體用于臨床診斷和治療的單克隆抗體 正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的抗體公司（正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的抗體公司（38家）：家）：AbgenixAlexion PharmAltarexApplied Molecular EvolutionBASFBiogenBioTransplantCAT(Cam

29、bridge Ab Tech)CelltechCenteonCentocor (Johnson & Johnson) ElanElsaiEli LillyGenzyme TransgenicsGenentechGenmabHoffman-La RocheICOS PharmIDEC Pharm/MitsubishiImClone SysImmunotechKaneboKnoll PharmLeukoSiteMedarexMedimmuneNorvartisOrtho BiotechPasteur-MerieuxProgenicsProtein Design LabScheringSmi

30、thKline BeechamTanox BiosystemsTechnicloneXomaZenyaku整理課件當(dāng)前美國(guó)治療性抗體市場(chǎng)當(dāng)前美國(guó)治療性抗體市場(chǎng)nReoPro (J&J, Centocor,Lilly)ReoPro (J&J, Centocor,Lilly)1994/1994/$461 M$461 MAbciximab,Abciximab,鼠鼠 抗抗GPIIb/IIGPIIb/II抗體抗體, ,防止血小板凝集防止血小板凝集凝血性心血管疾病凝血性心血管疾病 - AMI, - AMI, 不穩(wěn)定型心絞痛不穩(wěn)定型心絞痛nRituxan (IDEC/Genentech/Ro

31、che)Rituxan (IDEC/Genentech/Roche)1997/1997/$303 M$303 MRituximab, Rituximab, 嵌合嵌合 抗抗CD20CD20抗體抗體非霍奇金氏淋巴瘤非霍奇金氏淋巴瘤nHerceptin (Genentech)Herceptin (Genentech)1998/1998/$204 M$204 MTrastuzumabTrastuzumab人源化人源化 抗抗HER-2/NeuHER-2/Neu抗體抗體HER-2 HER-2 過(guò)量表達(dá)乳腺癌過(guò)量表達(dá)乳腺癌nSynagis (Medimmune)Synagis (Medimmune)1998

32、/1998/$285 M$285 MPalivizumabPalivizumab 人源化人源化 抗抗- -RSV F RSV F 糖蛋白抗體糖蛋白抗體 小兒小兒RSVRSV感染感染整理課件當(dāng)前美國(guó)治療性抗體市場(chǎng)當(dāng)前美國(guó)治療性抗體市場(chǎng)nRemicade (Centocor)1998 $130 MInfliximab 嵌合嵌合 抗抗TNF-抗體抗體局限性腸炎局限性腸炎，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎nZenapax (PDL, Roche)1997 $130 MDacliximab,人源化人源化, 抗抗Tac (IL-2 Receptor )抗體抗體移植排斥移植排斥nOrthoclone OKT3 (O

33、rtho Biotech) 1998 $60 MMuromonab 鼠鼠 抗抗CD-3 (T cells)抗體抗體移植排斥移植排斥nSimulect (Novartis)1998 $54 MBasiliximab 嵌合嵌合 抗抗CD25 (IL-2 Receptor) 抗體抗體移植排斥移植排斥n整理課件抗體類型抗體類型鼠源單克隆抗體鼠源單克隆抗體OrthoclonOrthoclone e器官移植排斥器官移植排斥嵌合抗體嵌合抗體PeoproPeopro冠狀動(dòng)脈成形術(shù)，心絞痛冠狀動(dòng)脈成形術(shù)，心絞痛嵌合抗體嵌合抗體RituxanRituxanB B細(xì)胞型非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞型非霍奇金淋巴瘤嵌合抗體嵌合

34、抗體SimulectSimulect器官移植排斥器官移植排斥嵌合抗體嵌合抗體RemicadeRemicade回腸炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎回腸炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎人源化抗體人源化抗體ZenapaxZenapax器官移植排斥器官移植排斥人源化抗體人源化抗體SynagisSynagis嬰兒呼吸道合胞病毒嬰兒呼吸道合胞病毒人源化抗體人源化抗體HerceptiHerceptin n乳腺癌乳腺癌人源化抗體人源化抗體CampathCampath慢性淋巴細(xì)胞白血病慢性淋巴細(xì)胞白血病人源化抗體偶聯(lián)物人源化抗體偶聯(lián)物MylotargMylotarg急性復(fù)發(fā)骨髓白血病急性復(fù)發(fā)骨髓白血病鼠源抗體放射性偶聯(lián)物鼠源抗體放射性偶聯(lián)

35、物ZevalinZevalinB B細(xì)胞型非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞型非霍奇金淋巴瘤整理課件中國(guó)抗體研究現(xiàn)狀中國(guó)抗體研究現(xiàn)狀單抗診斷劑：?jiǎn)慰乖\斷劑：針對(duì)乙型肝炎表面抗原針對(duì)乙型肝炎表面抗原流行性出血熱流行性出血熱抗人抗人T T淋巴細(xì)胞及亞群淋巴細(xì)胞及亞群風(fēng)疹病毒風(fēng)疹病毒黑熱病黑熱病抗人絨毛膜促性腺激素抗人絨毛膜促性腺激素霍亂霍亂抗人白細(xì)胞相關(guān)抗原抗人白細(xì)胞相關(guān)抗原抗人免疫球蛋白的系列抗人免疫球蛋白的系列脊髓灰質(zhì)炎病毒脊髓灰質(zhì)炎病毒呼吸道合胞病毒呼吸道合胞病毒登革熱登革熱9999mTcmTc肺癌單抗片段診斷劑進(jìn)肺癌單抗片段診斷劑進(jìn)入入I I期臨床。期臨床。單抗治療劑：?jiǎn)慰怪委焺旱獾?31131I-I-

36、肝癌單抗片段肝癌單抗片段注射液，注射液，20102010年已完成年已完成V V期臨床期臨床 成為低毒、安成為低毒、安全、有效的全、有效的肝癌靶向治療肝癌靶向治療藥物藥物。 華神利卡汀華神利卡汀2.88w /2.88w /支支乙腦單抗治療劑進(jìn)入乙腦單抗治療劑進(jìn)入、和和期期臨床試驗(yàn)，臨床試驗(yàn)，腎綜合癥出血熱單抗進(jìn)入腎綜合癥出血熱單抗進(jìn)入、和和期臨床。期臨床。整理課件中國(guó)中國(guó)人源基因工程抗體人源基因工程抗體研究獲重大研究獲重大成果成果 中國(guó)預(yù)防醫(yī)科院病毒所青年科學(xué)家中國(guó)預(yù)防醫(yī)科院病毒所青年科學(xué)家梁米芳梁米芳研研究員率領(lǐng)的課題組，在究員率領(lǐng)的課題組，在“治療用人源基因工程抗治療用人源基因工程抗體基礎(chǔ)與

37、應(yīng)用研究體基礎(chǔ)與應(yīng)用研究”中取得多項(xiàng)重要成果。在中取得多項(xiàng)重要成果。在世世界上首先研制成功抗坦病毒、抗甲肝病毒、抗狂界上首先研制成功抗坦病毒、抗甲肝病毒、抗狂犬病毒犬病毒人源基因工程抗體人源基因工程抗體，并獲得擁有自主知識(shí)，并獲得擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的全抗體表達(dá)載體系統(tǒng)。產(chǎn)權(quán)的全抗體表達(dá)載體系統(tǒng)。 與血源制品比較，此抗體具有抗體含量高、與血源制品比較，此抗體具有抗體含量高、無(wú)免疫源性、無(wú)污染源、可連續(xù)規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)，無(wú)免疫源性、無(wú)污染源、可連續(xù)規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)，是一類新興的特異性抗病毒感染的生物工程藥物是一類新興的特異性抗病毒感染的生物工程藥物。此成果為我國(guó)防治病毒性疾病探索出一條新的途此成果為我國(guó)

38、防治病毒性疾病探索出一條新的途經(jīng)，具有良好的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。經(jīng)，具有良好的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。 -2004整理課件原液保存原液保存 細(xì)菌疫苗工藝流程示意圖細(xì)菌疫苗工藝流程示意圖菌種篩選菌種篩選種子批的種子批的建立及檢定建立及檢定菌種接種菌種接種原液合并原液合并半成品半成品 配置配置殺菌殺菌原液收獲原液收獲擴(kuò)大培養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)分裝分裝包裝包裝檢定檢定中國(guó)疫苗研究：中國(guó)疫苗研究：整理課件病毒原病毒原液保存液保存 病毒疫苗病毒疫苗工藝流程工藝流程毒種篩選毒種篩選種子批的種子批的建立及檢定建立及檢定 毒種接種毒種接種#培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞原液合并原液合并 半成品半成品 配置配置病毒滅活病毒滅活病毒的收病毒的收獲過(guò)濾獲

39、過(guò)濾擴(kuò)大細(xì)擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)胞培養(yǎng)分裝分裝包裝包裝檢定檢定 原代細(xì)胞的原代細(xì)胞的 制備或傳代制備或傳代細(xì)胞復(fù)蘇細(xì)胞復(fù)蘇減毒活疫苗減毒活疫苗整理課件抗體的治療應(yīng)用抗體的治療應(yīng)用n抗腫瘤抗腫瘤n抗感染抗感染n抗器官移植排斥反應(yīng)抗器官移植排斥反應(yīng)n治療自身免疫性疾病和變態(tài)反治療自身免疫性疾病和變態(tài)反應(yīng)性疾病應(yīng)性疾病整理課件抗體藥物迅速發(fā)展的主要障礙抗體藥物迅速發(fā)展的主要障礙n人體免疫系統(tǒng)對(duì)鼠人體免疫系統(tǒng)對(duì)鼠源蛋白的排斥反應(yīng)源蛋白的排斥反應(yīng)n抗體抗體人源化人源化是解決是解決問(wèn)題的唯一途徑問(wèn)題的唯一途徑整理課件四四. .單克隆抗體人源化的改進(jìn)單克隆抗體人源化的改進(jìn)n鼠抗體人源化（人鼠抗體人源化（人- -鼠嵌合

40、、改型抗體）鼠嵌合、改型抗體）n小分子抗體（小分子抗體（FabFab、單鏈、單域、超變區(qū)多肽）單鏈、單域、超變區(qū)多肽）n基因工程抗體（雙特異、免疫黏連素、催化抗體）基因工程抗體（雙特異、免疫黏連素、催化抗體）n人源抗體（噬菌體抗體庫(kù)、轉(zhuǎn)基因小鼠）人源抗體（噬菌體抗體庫(kù)、轉(zhuǎn)基因小鼠）n人人- -人抗體人抗體 整理課件整理課件整理課件人鼠嵌合抗體構(gòu)建過(guò)程：人鼠嵌合抗體構(gòu)建過(guò)程：整理課件人抗鼠抗體反應(yīng)(HAMA)整理課件整理課件整理課件整理課件抗體類型抗體類型鼠源單克隆抗體鼠源單克隆抗體OrthoclonOrthoclone e器官移植排斥器官移植排斥嵌合抗體嵌合抗體PeoproPeopro冠狀動(dòng)脈

41、成形術(shù)，心絞痛冠狀動(dòng)脈成形術(shù)，心絞痛嵌合抗體嵌合抗體RituxanRituxanB B細(xì)胞型非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞型非霍奇金淋巴瘤嵌合抗體嵌合抗體SimulectSimulect器官移植排斥器官移植排斥嵌合抗體嵌合抗體RemicadeRemicade回腸炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎回腸炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎人源化抗體人源化抗體ZenapaxZenapax器官移植排斥器官移植排斥人源化抗體人源化抗體SynagisSynagis嬰兒呼吸道合胞病毒嬰兒呼吸道合胞病毒人源化抗體人源化抗體HerceptiHerceptin n乳腺癌乳腺癌人源化抗體人源化抗體CampathCampath慢性淋巴細(xì)胞白血病慢性淋巴細(xì)胞白血病

42、人源化抗體人源化抗體偶聯(lián)物偶聯(lián)物MylotargMylotarg急性復(fù)發(fā)骨髓白血病急性復(fù)發(fā)骨髓白血病鼠源抗體放射性偶聯(lián)物鼠源抗體放射性偶聯(lián)物ZevalinZevalinB B細(xì)胞型非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞型非霍奇金淋巴瘤整理課件整理課件整理課件 整理課件整理課件 整理課件 (3)單域抗體整理課件(4)最小識(shí)別單位整理課件整理課件整理課件整理課件整理課件整理課件整理課件整理課件整理課件整理課件 噬菌體抗體噬菌體抗體整理課件整理課件 整理課件整理課件整理課件整理課件整理課件用用SCIDSCID小鼠制備人單抗小鼠制備人單抗SCIDSCID小鼠小鼠移植入人淋巴細(xì)胞移植入人淋巴細(xì)胞 （人鼠嵌合模型）（人鼠嵌合

43、模型）抗原免疫抗原免疫雜交瘤技術(shù)雜交瘤技術(shù)基因工程基因工程人單抗人單抗整理課件人抗體鼠人抗體鼠將小鼠將小鼠IgIg基因滅活，然基因滅活，然后轉(zhuǎn)入人后轉(zhuǎn)入人IgIg基因，生產(chǎn)出人單抗基因，生產(chǎn)出人單抗遺傳工程鼠遺傳工程鼠整理課件基因工程抗體真核細(xì)胞高效表達(dá)流程圖基因工程抗體真核細(xì)胞高效表達(dá)流程圖整理課件單抗研發(fā)的演變歷程單抗研發(fā)的演變歷程鼠單抗鼠單抗100% 鼠源鼠源OKT-3PanorexZevalin鼠鼠/人崁合單抗人崁合單抗(66-75 % 人源人源)ReoPro, RituxanRemicadeSimulect人源化單抗人源化單抗(90-95 % 人源人源)Zenapax, Mylota

44、rg, Herceptin, CampathSynagis100% 人源人源 整理課件抗體在體外人源化存在的問(wèn)題抗體在體外人源化存在的問(wèn)題n操作過(guò)程復(fù)雜操作過(guò)程復(fù)雜n需付出昂貴的代價(jià)需付出昂貴的代價(jià)n抗體的親和力降低抗體的親和力降低n抗體不是人體免疫系統(tǒng)天然產(chǎn)生抗體不是人體免疫系統(tǒng)天然產(chǎn)生n異源抗體與免疫系統(tǒng)的配合異源抗體與免疫系統(tǒng)的配合整理課件最理想的單克隆抗體最理想的單克隆抗體n100%100%人源人源n人類免疫系統(tǒng)自然產(chǎn)生人類免疫系統(tǒng)自然產(chǎn)生整理課件全人抗體的理論基礎(chǔ)全人抗體的理論基礎(chǔ)n癌癥細(xì)胞、病毒、細(xì)菌對(duì)人機(jī)體而言均為癌癥細(xì)胞、病毒、細(xì)菌對(duì)人機(jī)體而言均為異己物異己物n人體不斷受異己物

45、攻擊，但免疫系統(tǒng)通常人體不斷受異己物攻擊，但免疫系統(tǒng)通常有清除能力有清除能力n免疫系統(tǒng)通過(guò)體液免疫和細(xì)胞免疫對(duì)異己免疫系統(tǒng)通過(guò)體液免疫和細(xì)胞免疫對(duì)異己物做出反應(yīng)物做出反應(yīng)n體液免疫就是針對(duì)異己物天然地產(chǎn)生抗體體液免疫就是針對(duì)異己物天然地產(chǎn)生抗體整理課件全人抗體面臨的關(guān)鍵問(wèn)題全人抗體面臨的關(guān)鍵問(wèn)題n持續(xù)分泌抗體的人持續(xù)分泌抗體的人 B B細(xì)胞細(xì)胞n抗體分泌細(xì)胞的保持抗體分泌細(xì)胞的保持整理課件3030年來(lái)的全人抗體的嘗試年來(lái)的全人抗體的嘗試n鼠骨髓瘤不適合與人鼠骨髓瘤不適合與人B B細(xì)胞融合細(xì)胞融合 - -穩(wěn)定性差穩(wěn)定性差 - -抗體產(chǎn)量低抗體產(chǎn)量低 n非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒 ( (

46、EBV)EBV) 保存抗體分保存抗體分泌細(xì)胞泌細(xì)胞 - -細(xì)胞株不穩(wěn)定細(xì)胞株不穩(wěn)定 - -抗體的產(chǎn)量低抗體的產(chǎn)量低 - -不能特異性地保存抗體分泌細(xì)胞不能特異性地保存抗體分泌細(xì)胞n很難獲得人類骨髓瘤細(xì)胞株很難獲得人類骨髓瘤細(xì)胞株整理課件全人抗體技術(shù)的最新突破全人抗體技術(shù)的最新突破 成功建立人骨髓瘤細(xì)胞系，人源抗體的研究進(jìn)成功建立人骨髓瘤細(xì)胞系，人源抗體的研究進(jìn)入新的里程入新的里程n用途：能穩(wěn)定的保持人用途：能穩(wěn)定的保持人B B細(xì)胞分泌抗體的能力細(xì)胞分泌抗體的能力n發(fā)明人：英國(guó)劍橋大學(xué)的教授發(fā)明人：英國(guó)劍橋大學(xué)的教授n意義：意義： 1 1 在整體水平上研究人類產(chǎn)生的抗體在整體水平上研究人類產(chǎn)生的

47、抗體 2 2 開(kāi)創(chuàng)人類抗體基因組學(xué)的研究開(kāi)創(chuàng)人類抗體基因組學(xué)的研究n評(píng)價(jià)：評(píng)價(jià)： 諾貝爾獎(jiǎng)得主諾貝爾獎(jiǎng)得主Dr.Milstein Dr.Milstein 推薦發(fā)表推薦發(fā)表 在在PNASPNAS，世界權(quán)威雜志，世界權(quán)威雜志“科學(xué)科學(xué)”發(fā)表發(fā)表了了 新聞評(píng)述，劍橋大學(xué)開(kāi)了新聞發(fā)布會(huì)新聞評(píng)述，劍橋大學(xué)開(kāi)了新聞發(fā)布會(huì)整理課件人人雜交瘤技術(shù)人人雜交瘤技術(shù)n開(kāi)發(fā)針對(duì)未知抗原的全人治療用抗開(kāi)發(fā)針對(duì)未知抗原的全人治療用抗體的唯一技術(shù)體的唯一技術(shù)n分離、保存穩(wěn)定分泌天然抗體的分離、保存穩(wěn)定分泌天然抗體的B B細(xì)細(xì)胞先進(jìn)方法。胞先進(jìn)方法。n尋找新型腫瘤相關(guān)抗原的捷徑尋找新型腫瘤相關(guān)抗原的捷徑整理課件人人雜交瘤技術(shù)

48、的優(yōu)勢(shì)人人雜交瘤技術(shù)的優(yōu)勢(shì)（1 1）迅速高效的生產(chǎn)天然人類單克隆抗體）迅速高效的生產(chǎn)天然人類單克隆抗體 抗原選定和抗體產(chǎn)生都由人類免疫系統(tǒng)完成，抗原選定和抗體產(chǎn)生都由人類免疫系統(tǒng)完成， 不會(huì)引起自身免疫反應(yīng)，與人體免疫系統(tǒng)配合不會(huì)引起自身免疫反應(yīng)，與人體免疫系統(tǒng)配合良好良好 能獲得最佳親和力和中和活性的抗體能獲得最佳親和力和中和活性的抗體 更合理的自然選擇藥物設(shè)計(jì)方式更合理的自然選擇藥物設(shè)計(jì)方式 加速抗原的發(fā)現(xiàn)和抗體的開(kāi)發(fā)過(guò)程加速抗原的發(fā)現(xiàn)和抗體的開(kāi)發(fā)過(guò)程整理課件人人雜交瘤技術(shù)的優(yōu)勢(shì)人人雜交瘤技術(shù)的優(yōu)勢(shì) （2 2）簡(jiǎn)便、低費(fèi)用的抗原抗體研究生產(chǎn)方式）簡(jiǎn)便、低費(fèi)用的抗原抗體研究生產(chǎn)方式與其他抗體改良技術(shù)相比操作更簡(jiǎn)便與其他抗體改良技術(shù)相比操作更簡(jiǎn)便起始抗體分泌水平較高，可直接用于工起始抗體分泌水平較高，可直接用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)業(yè)規(guī)模生產(chǎn)避免了