pET-28b(+)載體

1、pET-28b (+)載體(基本信息、圖譜和多克隆位點(diǎn)信息、簡(jiǎn)介、序歹U)1 .pET28a載體基本信息：質(zhì)粒類(lèi)型：大腸桿菌表達(dá)載體表達(dá)水平：高克隆方法：多克隆位點(diǎn)，限制性內(nèi)切酶載體大小：5368bp5測(cè)序弓 I物及序歹1 :T7: 5-TAATACGACTCACTATAGGG-33測(cè)序引物序列載體標(biāo)簽：T7t: 5-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3N-His, N-Thrombin, N-T7, C-His載體抗性：Kanamycin (卡那霉素)N端含有凝血酶(Thrombin )蛋白酶位切點(diǎn)；pET28ahe的差異主要存在于多克隆位點(diǎn)處病毒類(lèi)型：非病毒2 .pET28a載體質(zhì)粒

2、圖譜和多克隆位點(diǎn)信息：3 .pET28a 載體簡(jiǎn)介pET-28a-c(+)載體帶有一個(gè) N端白His/Thrombin/T7蛋白標(biāo)簽，同時(shí)含有一個(gè)可以選擇的C端His標(biāo)簽。pET28a載體的單一的多克隆位點(diǎn)見(jiàn)上面的環(huán)狀質(zhì)粒圖譜。注意：載體序列是以 pBR322質(zhì)粒的編碼規(guī)矩進(jìn)行編碼的，所以 T7蛋白表達(dá)區(qū)在質(zhì)粒圖譜上面是 反向的。T7 RNA聚合酶啟動(dòng)的克隆和表達(dá)區(qū)域在質(zhì)粒圖譜中也被標(biāo)注了出來(lái)。質(zhì)粒的F1復(fù)制子是被定向的， 所以在T7噬菌體聚合酶的作用下，包含有蛋白編碼序列的病毒粒子能夠產(chǎn)生，并啟動(dòng)蛋白表達(dá)，同時(shí)蛋白表達(dá)將被T7終止子序列(Cat. No. 69337-3)的作用下終止蛋白翻譯

3、。3.pET28a載體簡(jiǎn)介pET-28a-c(+)載體帶有一個(gè) N端白His/Thrombin/T7蛋白標(biāo)簽，同時(shí)n端含有凝血酶(Thrombin)蛋白酶位切點(diǎn)；pET28ahe的差異主要存在于多克隆位點(diǎn)處載體描述：The pET-28a-c(+) vectors carry an N-terminal His?Tag?/ thrombin/ T7?Tag? configuration plus an optional C-terminal His?Tag sequence. Unique sites are shown on the circle map. Note that the seq

4、uence is numbered by the pBR322convention, so the T7 expression region is reversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed byT7 RNA polymeraseis shown below. The f1 origin is oriented so that infection with helper phage will produce virions containingsingl

5、e-stranded DNA that corresponds to the coding strand. Therefore, single stranded sequencing should be performed using the T7 terminator primer (Cat. No. 69337-3).PET-28a-c(+) 向量進(jìn)行N- 末端 His?Tag? / 凝血酶 / T7?Tag? 配置再加上可選的 C- 末端 His?Tag 序列。獨(dú)特的網(wǎng)站顯示在地圖上圈。請(qǐng)注意，序列編號(hào)pBR322公約，所以T7表達(dá)區(qū)域反循環(huán)的地圖上?？寺〉谋磉_(dá)區(qū)域的轉(zhuǎn)錄如下所示的 T7

6、 RNApolymeraseis 編碼鋼絞線。F1 起源是導(dǎo)向，以便輔助噬菌體感染會(huì)產(chǎn)生包含對(duì)應(yīng)于編碼鏈的單鏈DNA 病毒。因此，單個(gè)滯留測(cè)序應(yīng)該使用進(jìn)行 T7 終結(jié)器底漆(貓。69337 3 號(hào))。提取 pet28 質(zhì)粒時(shí)，怎樣才能得到高的濃度Axugen 的試劑盒已經(jīng)很不錯(cuò)了,要是提不出濃度很高的質(zhì)粒,可以試試下面的一些方法：1 、增加收菌次數(shù),相對(duì)提高了質(zhì)粒的量,這樣的話裂解液的量可以適當(dāng)增加；2、裂解要充分,變性和復(fù)性按說(shuō)明應(yīng)該是不超過(guò)5 分鐘 ,合理控制時(shí)間,一般在3 分到 4 分半的時(shí)間都是可以的；3、過(guò)柱子時(shí),吸附的時(shí)間盡量長(zhǎng)一些,可以在這期間做做其他實(shí)驗(yàn)或者吃個(gè)飯什么的；4、如

7、果沒(méi)有必要,不使用去蛋白液,因?yàn)槊窟^(guò)一遍柱子,其損耗越大,不過(guò)這得根據(jù)說(shuō)明的菌種而定；4、最后洗脫回收的時(shí)候,要單方面提高濃度,就要適當(dāng)減少洗脫液的量,我一般都是回收到4050科L的,同時(shí)要增加洗脫次數(shù)，一般兩三次足矣.如果以上方法都用遍了還無(wú)效,就應(yīng)該考慮菌種本身的問(wèn)題,是不是凍融或者傳代次數(shù)過(guò)高,導(dǎo)致質(zhì)粒本身丟失?質(zhì)粒本身在大腸桿菌的拷貝數(shù)是多少?不行的話建議重新將質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中.一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簲U(kuò)增pET28質(zhì)粒先將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，通過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)獲取大量含有質(zhì)粒的大腸桿菌。大腸桿菌的培養(yǎng)需要用到LB 液體培養(yǎng)基。根據(jù)質(zhì)粒帶有的抗生素抗性基因，還需要在LB 中加入適量相應(yīng)

8、抗生素，如氨芐青霉素、卡那霉素等。LB 液體培養(yǎng)基的配方（Luria-Bertani） ： 稱(chēng)取蛋白胨（Tryptone）10 g ， 酵母提取物（Yeast extract） 5g, NaCl 10 g,溶于800ml去離子水中，用 NaOH調(diào)pH至7.5,加去離子水至總體積 1升，高壓下蒸氣滅菌20 分鐘。質(zhì)粒提取目前一般都有商業(yè)化生成的試劑盒銷(xiāo)售，可按照相應(yīng)試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作。轉(zhuǎn)化： 取出感受態(tài)細(xì)胞（也有商品化感受態(tài)銷(xiāo)售），冰浴10 分鐘。 取連接產(chǎn)物10“放入感受態(tài)細(xì)胞中（1001/管），輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，冰浴 30分 鐘。 42熱休克120 秒（按照需要加長(zhǎng)或減少時(shí)間），不能搖動(dòng)

9、Ep 管。冰浴5 分鐘，然后轉(zhuǎn)移到事先預(yù)熱至 37c的無(wú)抗生素的普通 LB培養(yǎng)基800ul, 50700rpm 37 c恒溫振蕩1小時(shí) 30 分鐘。 用無(wú)菌彎頭玻棒鋪菌器將150ul菌液鋪于含有抗生素的LA平板。 鋪菌的LA平板于37正放23 小時(shí)，然后倒置培養(yǎng)16-24 小時(shí)。 將疑似陽(yáng)性克隆的白斑選出，接到新的含有抗生素的LB 中培養(yǎng) 14 小時(shí)左右，做菌液 PCR或抽提質(zhì)粒酶切以進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)化是否成功。轉(zhuǎn)染： 將3 “（約4Wg）純化好的經(jīng)除菌的質(zhì)粒 DNA溶入250 “無(wú)血清培養(yǎng)基 DMEM （無(wú)雙抗 ） 中，輕輕混勻，室溫放置5 mim。再吸取10 “脂質(zhì)體溶入250 “無(wú)血清培養(yǎng)基

10、 DMEM （無(wú)雙抗）中，輕輕混勻，室溫放置5 mim 。 將制備好的DNA與脂質(zhì)體輕輕混合土勻勻,室溫放置20 mim。然后加入1.5 ml無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM （無(wú)雙抗）中，輕輕混勻，即為包裹好的脂質(zhì)體/DNA。將包裹好的脂質(zhì)體/DNA小心滴加至備用細(xì)胞表面，37 C, 5% CO2,飽和濕度中孵育 10小時(shí)。棄去混合液，加入含 10%胎牛血清的DMEM （無(wú)雙抗），繼續(xù)培養(yǎng) 24-48小時(shí)（1）目的：從大腸桿菌中提取質(zhì)粒 DNA （堿裂解法） （ 2）實(shí)驗(yàn)原理：1、溶液I的作用對(duì)于任何生物化學(xué)反應(yīng)，首先要控制好溶液的pH,因此選用適當(dāng)濃度和適當(dāng) pH 值的 Tris-Cl 溶液。加入的葡

11、萄糖可以使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，可以抑制DNase的活性和微生物生長(zhǎng)。此 步驟菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊，否則會(huì)降低抽提得率。2、溶液 II 的作用 NaOH 是最佳的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，碰到了堿后幾乎在瞬間就會(huì)溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer （雙層膜）結(jié)構(gòu)向 micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。SDS也呈堿性，但如果只用 SDS達(dá)不到徹底溶解細(xì)胞的作用，加入SDS主要為下一步做鋪墊。這一步操作要注意兩點(diǎn)：第一，時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，因?yàn)樵?這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會(huì)慢慢斷裂

12、；第二，必須溫柔混合，不然基因組DNA也會(huì)斷裂。3、溶液III的作用SDS在高鹽濃度下發(fā)生沉淀，同時(shí)SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè) SDS分子，所以沉淀也將溶液中的大部分蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)。溶液中的K+置換了 SDS中的Na+而形成了不溶性的 PDS高濃度的鹽使沉淀更完全。同時(shí)，由于基因組DNA很長(zhǎng)，容易被PDS共沉淀。2 M的醋酸可以中和 NaOH,因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的堿性條件會(huì)打斷DNA?；蚪MDNA一旦發(fā)生斷裂，小于 100 kb的片斷，就不容易與 PDS共沉淀。所以堿處理的時(shí) 間要短，而且不得激烈振蕩，否則最后得到的質(zhì)粒上會(huì)有大量的基因組DNA 污染。這一步操作混合均勻后在冰上放置

13、，可以使PDS沉淀更充分。4、酚/氯仿/異戊醇的作用 PDS的沉淀并不能將所有的蛋白質(zhì)沉淀，酚可以使蛋白質(zhì)變性，作用大于氯仿，但水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液，離心后酚相會(huì)跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收。加入氯仿后可以增加其比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收。還有， 酚與水有很大的互溶性，如果單獨(dú)用酚抽提后會(huì)有大量的酚溶解到水相中，而酚會(huì)抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性酶切反應(yīng)），因此如果單獨(dú)用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除。而用酚/氯仿混合液進(jìn)行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時(shí)就會(huì)被除干凈而不必?fù)?dān)心酶切等反應(yīng)不能正常進(jìn)行。異戊醇的添加， 主

14、要可以使離心后上下層的界面更加清晰，方便水相的回收。（ 3）實(shí)驗(yàn)材料、儀器、試劑：溶液I50mmol/l 葡萄糖，25mmol/l Tris HCl （pH8.0） , 20mmol/l EDTA （pH8.0）溶液II: 0.2 N NaOH、1% SDS溶液III : 3 M 醋酸鉀、2 M 醋酸。（ 4）操作步驟1 ）將細(xì)菌沉淀，所得重懸于 100 “用冰預(yù)冷的溶液I中，劇烈振蕩。2 ）溶液I :50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L Tris Cl（pH8.0） 10mmol/LEDTA（pH8.0）溶液I可成批配制，每瓶約100ml,在10lbf/in2（6.895 x 104P

15、a）高壓下蒸氣滅菌 15分鐘，貯存于4C。須確使細(xì)菌沉淀在溶液I中完全分散，將兩個(gè)微量離心管的管底部互相接觸震蕩，可使沉淀迅速分散。2）力口 200 d l新配制的溶液n。溶液n : 0.2mol/L NaOH （臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋?zhuān)?1%SDS蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混合內(nèi)容物。應(yīng)確保離心管的整個(gè)內(nèi)表面均與溶液n接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上。3）加150 “用冰預(yù)冷的溶液出溶液出：5mol/ L乙酸鉀 60ml冰乙酸 11.5ml水28.5ml所配成的溶液對(duì)鉀是3mol/L ，對(duì)乙酸根是5mol/L 。 蓋緊管口，將管倒置后和地振蕩10 秒鐘溶液出在粘稠的細(xì)

16、菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上3 - 5分鐘。4）用微量離心機(jī)于 4C 12 000g離心5分種，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。5）可做可不做：加等量酚：氯仿， 振蕩混勻，用微量離心機(jī)于 4 C以12000g離心2分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。有些工作者認(rèn)為不必用酚：氯仿進(jìn)行抽提，然而由于一些未知的原因，省略這一步，往往會(huì)得到可耐受限制酶切反應(yīng)的DNA。6）用2倍休積的乙醇于室溫沉淀雙錠DNA。振蕩混合，于室溫放置2分鐘。7）用微量離心機(jī)于4c以12 000g離心5分鐘。8）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡(jiǎn)便方法是用一次性使用

17、的吸頭與真空管道相連，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡量使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過(guò)抽真空除去附于管壁的液滴。9）用1ml70%乙醇于4c洗滌雙鏈DNA沉淀，按步驟 8）所術(shù)方法去掉上清，在空氣中使核酸沉淀干燥10 分鐘。i.此法制備的高拷貝數(shù)質(zhì)粒（如Xf3或pUC）,其產(chǎn)量一般約為：每毫升原細(xì)菌培養(yǎng)物35 科 gii.如果要通過(guò)限制酶切割反應(yīng)來(lái)分析DNA,可取1 “ DNA 堿裂解法提取質(zhì)粒。質(zhì)粒提?。▔A裂解法）（1）取1.5ml菌液于1.5mlEP管中，12000rpm x 1min ,棄去上清液.（200ul槍頭吸下）（2）加入100ul溶?夜I,重懸（渾濁狀）（3）向

18、（2）中加入200ul新制溶液II （現(xiàn)配現(xiàn)用，不得超過(guò) 3min）,輕輕翻轉(zhuǎn)（此時(shí)變澄 清），4 c放置2min （打開(kāi)后蓋上有絲狀物）。 4） 4） 加入 150ul 預(yù)冷的溶液III， 加蓋后溫和顛倒數(shù)次（產(chǎn)生白色絮狀物）。 -20放置5min。 5） 10000rpm x 5min ,取上清液于另一干凈EP管中。（6）（避免滴在手上）向上清液中加入等體積（約 400ul）酚/氯仿/異戊酉I （ 25: 24: 1）（取下層，在插入槍頭后再按下，避免槍頭中混有上層保護(hù)液，吸出時(shí)迅速打入Ep 管，防止滴在外面。），振蕩混勻（輕），12000rpm x 3min ,將上清液轉(zhuǎn)移至新的 EP管

19、中。（可再次重復(fù)，抽?。?7）向上清液中加入約800ul 無(wú)水乙醇，混勻，-20放置 20min。（ 8） 12000rpm x 5min ，倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。（ 9）加 1ml 70%乙醇，吹打沉淀，12000rpm x 3min ，倒上清液，扣濾紙上。吸去未倒完乙醇，風(fēng)干。（10）（按總量）力口入 30-50ul, TE 緩沖?夜、1ul RNAse, 37C , 17min 使 DNA 完全溶解。-20 C 保存?zhèn)溆?。大腸桿菌質(zhì)粒提取質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備質(zhì)粒DNA高頻轉(zhuǎn)化大腸桿菌線形質(zhì)粒DNA 5-粘性末端去磷酸PCR技術(shù) 雙

20、酶切（1）分別取兩支0.2mlEP管做上記號(hào)：如 （2）兩個(gè)EP管中分別配置下列的 30L體系：水3ul水3ul10xBuffer3ul10xBuffer3ulNot I2ulNot I2ulBam HI2ulBam HI2ulpET-28a20ulpEGFP-N320ul（3）將兩只EP管混勻后瞬時(shí)離心，放入恒溫培養(yǎng)箱37c酶切1h。瓊脂糖凝聚電泳檢測(cè)酶切結(jié)果取5dL EP管的酶切反應(yīng)液，同時(shí)取 5dL原質(zhì)粒溶液作對(duì)照，進(jìn)行電泳檢測(cè)酶切結(jié) 果。膠回收按照回收試劑盒步驟切膠回收所需酶切產(chǎn)物片段。膠回收試劑盒使用步驟：1）在紫外燈下從電泳膠上切下所需回收的條帶，注意刀片需消毒，膠塊應(yīng)盡量小，使之

21、易融化完全；2）事先將一個(gè)eppendorf管稱(chēng)重，然后將膠塊放入后再次稱(chēng)重， 獲得膠塊的重量； 3）以 每100mg膠塊加入300 6的量加入Binding Buffer,查看膠塊是否浸在液體中；4） 56 C水浴10min以融化膠塊釋放 DNA,期間每2-3min需取出震蕩；5）待膠塊完全融化后按照每100mg膠塊150 6的量加入異丙醇，充分震蕩混勻；6）將High Pure Filter Tube 安裝到 Collection Tube 上；7） 將所有eppendorf管中的液體轉(zhuǎn)移到 High Pure Filter Tube中去，注意不要超過(guò) 700（il, 若超過(guò)需分兩次離心；

22、8） 12000 rpm 離心1 min ,倒掉收集管中的液體；9） 加入500科l Wash Buffer后再次離心1min; 10）倒掉收集管中的液體后再次加 200l的 Wash Buffer, 12000 rpm 離心1 min;11） 小心將Filter Tube取下后裝入一個(gè)新的 Effendorf管上；12） 在濾芯的正中加上301 的 日ution Buffer,室溫放置 1min, 12000 rpm 離心 1 min。DNA的重組連接實(shí)驗(yàn)原理和步驟一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠肨4dna連接酶將載體 pBR322 EcoR I -CIP處理的DNA片段，與目的基因 5.4KbEcoR I片

23、 段連接起來(lái)，構(gòu)建體外重組DNA分子，同時(shí)學(xué)習(xí)幾種 DNA連接的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理重組的DNA分子是在T4DNA連接酶的作用下， 有Mg2+、ATP存在的連接緩沖液系統(tǒng)中，將上述二種酶切后的 DNA分子進(jìn)行連接。（一）DNA連接酶的作用步驟1 .T4DNA連接酶與輔助因子 atp形成酶-AMP復(fù)合物（腺甘酰酶）2 .酶-AMP復(fù)合物再結(jié)合到具有 5磷酸基和3-羥基切口的DNA上，使DNA腺昔化。3 .產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵，把缺口封起來(lái)。（二）DNA的連接方式在T4DNA連接酶的作用下的 DNA連接反應(yīng)，一般是隨機(jī)的，但也可以通過(guò)對(duì)載體、目的基因的處理以控制與調(diào)整 DNA的有效連接。連接的方式

24、有：1 . 自連2 .兩種片段相連3 .三個(gè)片段以上的自連與互連（三 ）連接反應(yīng)的條件1 .緩沖液：一般商品酶都帶有10倍的緩沖液，有 Mg2+、ATP作為輔助因子，提供能量，同時(shí)也有些保護(hù)與穩(wěn)定酶活性的物質(zhì)，如DTT（二硫蘇糖醇）以防止酶的活性基因氧化失活。BSA（、牛血?#蛋白）維持一定的蛋白量，以防止因蛋白濃度太低的酶變性失活。2 .溫度： 連接反應(yīng)溫度在37時(shí)有利于連接酶的活性，但是在這個(gè)溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的，EcoR I酶所產(chǎn)生的末端，僅僅通過(guò)四個(gè)堿基對(duì)相結(jié)合，這不足以抵抗該溫度下的分子熱運(yùn)動(dòng)。因此在實(shí)際操作時(shí)，DNA 分子粘性末端的連接反應(yīng)，其溫度是折中采取催化反應(yīng)

25、與末端粘合的溫度，為1216 C。3 .時(shí)間：1216c 1216小時(shí)（過(guò)夜）;或78c 23天。三 . 實(shí)驗(yàn)材料1.pBR322 EcoR I -CIP處理 DNA 片段。2.5.4Kb含有Str的EcoR I回收 DNA片段。3.T4DNA連接酶 四 . 實(shí)驗(yàn)儀器、器皿及試劑儀器、器皿(見(jiàn)附錄)試齊IJ: 10 X T4DNA連接酶緩沖液660mmol/L Tris -HCl(pH7.5)50 mmol/L MgCl250 mmol/L DDT50 mmol/L ATP 五 . 實(shí)驗(yàn)步驟一管做 pBR322未經(jīng)CIP處理的自連，另一管做Eppendorf 管中。1 . 取 3 只 Eppe

26、ndorf 管，一管做重組連接，一管做 pBR322經(jīng)CIP處理的自連。2 .用微量進(jìn)樣器按下表分別取樣各溶液于DNA酶切反應(yīng)物10 X T4連接緩沖液ddH2OT4DNA連接酶總體積pBR322 EcoRI -CIP5 d l（100ng）5.4Kb EcoR I 片段5 科 l（約 400ng）2l7科l1小20“pBR322 EcoR! -CIP3 科 l(60ng)2l14“1小20“pBR322 EcoRI3 科 l(60ng)2l14“1小20“加樣順序?yàn)閐dH2O, 10XT4緩沖3夜,DNA片段，最后加T4DNA連接酶(放于冰浴中)連接酶 取好后應(yīng)立即放回-20保存。3 .蓋緊

27、蓋子用手指彈勻Eppendorf 管，于臺(tái)式離心機(jī)上轉(zhuǎn)2 秒鐘，以集中樣品。4 .將 3管連接樣品放入溫度12恒溫水浴鍋中，過(guò)夜。5 .第二天上午各管取約 25ng的DNA連接液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察連接反應(yīng)效果，電泳時(shí)要加入pBR322 EcoR I酶切片段作電泳對(duì)照。重組質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化及篩選1、 材料外源DNA片段：自行制備的帶限制性末端的 DNA溶液，濃度已知；載體DNA: pBS質(zhì)粒 (Ampr ,lacZ),自行提取純化，濃度已知；宿主菌：E. coli DH5 a，或JM系列等具有a -互補(bǔ)能力的 菌株。2、 設(shè)備恒溫?fù)u床，臺(tái)式高速離心機(jī)，恒溫水浴鍋，瓊脂糖凝膠電泳裝置，電熱恒

28、溫培養(yǎng)箱，電泳儀無(wú)菌，工作臺(tái)，微量移液槍?zhuān)琫ppendorf 管。3、 試劑1、連接反應(yīng)緩沖液(10X): 0.5mol/L Tris Cl(pH7.6), 100mol/L MgCl2 , 100mol/L 二硫 蘇糖醇(DTT)(過(guò)濾滅菌)，500 g/ml牛血清清蛋白(組分V.Sigma產(chǎn)品)(可用可不用)， 10mol/L ATP (過(guò)濾滅菌)。2、T4 DNA 連接酶(T4 DNA ligase);購(gòu)買(mǎi)成品。3、 X-gal 儲(chǔ)液 (20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal 配制成 20mg/ml 的儲(chǔ)液 , 包以鋁箔或黑紙以防止受光照被破壞, 儲(chǔ)存于-20。4、IPTG儲(chǔ)?

29、(200mg/ml):在800“蒸儲(chǔ)水中溶解 200mg IPTG后，用蒸儲(chǔ)水定容至 1ml, 用0.22m濾膜過(guò)濾除菌，分裝于 eppendorf管并儲(chǔ)于-20 C。5、麥康凱選擇性培養(yǎng)基 (Maconkey Agar):取52g麥康凱瓊脂加蒸儲(chǔ)水 1000ml,微火煮沸至完全浴解，高壓滅菌，待冷至60左右加入Amp 儲(chǔ)存液使終濃度為50mg/ml ，然后搖勻后涂板。6、含X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基：在事先制備好的含50科g/ml Amp的LB平板表面加40ml X-gal儲(chǔ)液和4科lIPTG儲(chǔ)?硬，用無(wú)菌玻棒將溶液涂勻，置于37c下放置3-4小時(shí)，使培養(yǎng)基 表面的液體完全被吸收。7、

30、感受態(tài)細(xì)胞制備試劑: 見(jiàn)第三章。8、煮沸法快速分離質(zhì)粒試劑: 見(jiàn)第一章。9、質(zhì)粒酶及電泳試劑: 見(jiàn)第二章。第三節(jié) 操作步驟一、 連接反應(yīng)1、取新的經(jīng)滅菌處理的0.5ml eppendorf 管 , 編號(hào)。2、將0.1g載體DNA轉(zhuǎn)移到無(wú)菌離心管中，加等摩爾量（可稍多）的外源DNA片段。3、加蒸儲(chǔ)水至體積為8 d l,于45c保溫5分鐘，以使重新退火的粘端解鏈。將混和物冷卻至0。4、加入10X T4 DNA ligase buffer 1 “, T4 DNA ligase 0.5”，混勻后用微量離心機(jī)將液體全部甩到管底,于 16保溫8-24小時(shí)。同時(shí)做二組對(duì)照反應(yīng)，其中對(duì)照組一只有質(zhì)粒載體無(wú)外源

31、DNA； 對(duì)照組二只有外源DNA片段沒(méi)有質(zhì)粒載體。二、E. coli DH5 a感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化每組連接反應(yīng)混和物各取2科l轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞。具體方法見(jiàn)第三章。3、 重組質(zhì)粒的篩選1、每組連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化原液取100 d l用無(wú)菌玻棒均勻涂布于篩選培養(yǎng)基上，37 C下培養(yǎng)半小時(shí)以上,直至液體被完全吸收。2、 倒置平板于37繼續(xù)培養(yǎng)12-16 小時(shí)，待出現(xiàn)明顯而又未相互重疊的單菌落時(shí)拿出平板。3、放于4數(shù)小時(shí)，使顯色完全（此步麥康凱培養(yǎng)基不做）。不帶有pBS質(zhì)粒DNA的細(xì)胞，由于無(wú)Amp抗性,不能在含有Amp的篩選培養(yǎng)基上成活。 帶有pBS載體的轉(zhuǎn)化子由于具有3-半乳糖甘酶活性，在麥康凱篩選培養(yǎng)基上呈現(xiàn)為紅色菌落。在X-gal和ITPG培養(yǎng)基上為藍(lán)色菌落。帶有重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子由于喪失了 3-半乳糖昔酶活性,在麥康凱選擇T培養(yǎng)基和x