專題78PCR技術(shù)的基本操作和應(yīng)用

1、專題78 PCR技術(shù)的基本操作和應(yīng)用窗體頂端【基礎(chǔ)回顧】 考點(diǎn)一、PCR原理 DNA熱變性原理，即： 考點(diǎn)二、PCR反應(yīng)過程 (1)變性：當(dāng)溫度上升到90_以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈。 (2)復(fù)性：溫度下降到55_左右時(shí)，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。 (3)延伸：溫度上升到72 左右時(shí)，溶液中的四種脫氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。 【技能方法】 1細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制與PCR技術(shù)的比較 2PCR的反應(yīng)過程 (1)變性：當(dāng)溫度上升到90 以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈，如下圖： (2)復(fù)性：溫度下降到50 左右，兩種引物通過

2、堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合，如下圖： (3)延伸：溫度上升到72 左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈，如下圖： 3、PCR擴(kuò)增易錯(cuò)點(diǎn) (1)DNA分子復(fù)制的人工控制 解開螺旋：在80100 時(shí)，DNA雙螺旋打開，形成兩條DNA單鏈，稱為變性。 恢復(fù)螺旋：在50 左右時(shí)，兩條DNA單鏈重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)性。 復(fù)制條件：緩沖液、DNA模板、四種脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定DNA聚合酶和兩種引物。 反應(yīng)場(chǎng)所：PCR儀。 (2)PCR技術(shù)中的引物： 含義：引物是一小段單鏈DNA或RNA分子。 作用：為DNA聚合酶提供合成的3端起點(diǎn)。 種類：擴(kuò)增

3、一個(gè)DNA分子需要2種引物。 數(shù)目：引物數(shù)目等于新合成的DNA子鏈數(shù)目。 與DNA母鏈的關(guān)系：兩種引物分別與DNA母鏈的3端通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合。 【基礎(chǔ)達(dá)標(biāo)】 1PCR技術(shù)控制DNA的解聚與結(jié)合是利用DNA的（） A.特異性B.穩(wěn)定性 C.熱變性D.多樣性 【答案】C 【解析】 DNA分子在80100 的溫度范圍內(nèi)變性,雙鏈解開成單鏈,當(dāng)溫度慢慢降低時(shí),又能重新結(jié)合形成雙鏈。故選C。 2引物的作用是（） A.打開DNA雙鏈 B.催化合成DNA子鏈 C.使DNA聚合酶能夠從引物的3端開始復(fù)制 D.提供模板 【答案】C 【解析】 DNA分子的復(fù)制具有方向性，即只能從子鏈的53方向進(jìn)行復(fù)制。當(dāng)引物

4、與DNA母鏈結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3端開始延伸DNA鏈。所謂3、5是指脫氧核糖上C原子的位置。選C。 3下列關(guān)于PCR引物的說法,不正確的是（） A.引物是PCR過程中與模板DNA部分序列互補(bǔ),并能引導(dǎo)模板DNA的互補(bǔ)鏈合成的核苷酸序列 B.引物常根據(jù)需要擴(kuò)增的目標(biāo)DNA的堿基序列用化學(xué)合成的方法獲得 C.DNA聚合酶只能使DNA鏈從引物的3端開始向引物的5端延伸 D.引物的3端必須具有游離的OH 【答案】C 【解析】 A項(xiàng)正確：所述是引物的特點(diǎn)和作用； B項(xiàng)正確：引物是RNA或單鏈DNA片段，它能與母鏈的一段堿基互補(bǔ)配對(duì)，因此可根據(jù)擴(kuò)增目標(biāo)DNA的堿基序列用化學(xué)方法合成； C項(xiàng)錯(cuò)誤

5、：DNA聚合酶使DNA鏈從引物的5端向引物的3端延伸； D項(xiàng)正確：DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核酸片段的3端末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵。 4下列操作過程的敘述中錯(cuò)誤的是（） A.PCR反應(yīng)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓蒸汽滅菌 B.PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份,并在-20儲(chǔ)存 C.PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后,迅速融化 D.在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí),每吸取一種試劑后,移液器上的吸液槍頭都必須更換 【答案】C 【解析】 A項(xiàng)正確：為了防止外源DNA等因素的污染,PCR反應(yīng)中所用的微量離心管、槍頭、緩沖液及蒸餾水等,在使用前要進(jìn)行高壓

6、蒸汽滅菌； B項(xiàng)正確：PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份,并在-20 儲(chǔ)存； C項(xiàng)錯(cuò)誤：在使用前,將PCR所需試劑從冰箱內(nèi)拿出來,放在冰塊上緩慢融化； D項(xiàng)正確：使用一次性吸液槍頭。 5PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA，需要的條件是（） 目的基因引物 四種脫氧核苷酸DNA聚合酶等 mRNA核糖體 A.B. C.D. 【答案】C 【解析】 PCR技術(shù)需要目的基因作為擴(kuò)增的模板，DNA聚合酶催化反應(yīng)的進(jìn)行，而引物是滿足DNA聚合酶起作用的需要，四種脫氧核苷酸是該過程的原料。故選C。 【能力提升】 1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成

7、一個(gè)周期,循環(huán)進(jìn)行,使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，其簡(jiǎn)要過程如圖所示。下列關(guān)于PCR技術(shù)敘述不正確的是（） A.PCR技術(shù)是在實(shí)驗(yàn)室中以少量DNA制備大量DNA的技術(shù) B.反應(yīng)中新合成的DNA不能作為下一輪反應(yīng)的模板 C.PCR技術(shù)中以脫氧核糖核苷酸為原料,以指數(shù)方式擴(kuò)增 D.應(yīng)用PCR技術(shù)與探針雜交技術(shù)可以檢測(cè)基因突變 【答案】B 【解析】 A項(xiàng)正確：PCR技術(shù)是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)； B項(xiàng)錯(cuò)誤：PCR技術(shù)需要模板DNA，且反應(yīng)中新合成的DNA又可以作為下一輪復(fù)制的模板； C項(xiàng)正確：PCR的原理就是DNA的復(fù)制，原料是脫氧核糖核苷酸，PCR技術(shù)使DNA以指數(shù)的方式擴(kuò)增，即約

8、2n； D項(xiàng)正確：應(yīng)用PCR技術(shù)與探針雜交技術(shù)可以檢測(cè)基因突變。 2DNA擴(kuò)增過程中DNA片段經(jīng)若干次擴(kuò)增，其數(shù)目理論值變化應(yīng)與下圖中曲線相符的是（） 【答案】C 【解析】 DNA在擴(kuò)增過程中呈指數(shù)式增長(zhǎng)，即一個(gè)DNA分子連續(xù)擴(kuò)增n次，理論上所產(chǎn)生的DNA分子數(shù)為2n個(gè)。故選C。 3PCR儀實(shí)質(zhì)上是一臺(tái)自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器，它調(diào)控不同溫度的目的是（） 95，使DNA分子變性，失去生物活性 95，使DNA分子變性，解開螺旋 55，使DNA分子開始復(fù)制、延伸 55，使DNA分子恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，恢復(fù)活性 72，使DNA分子開始復(fù)制、延伸 72，使DNA分子恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，恢復(fù)活性 A.B. C.D.

9、【答案】C 【解析】 PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解旋與結(jié)合。PCR儀實(shí)質(zhì)上是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。錯(cuò)誤正確：當(dāng)溫度上升至95時(shí)，DNA分子變性，解開雙螺旋結(jié)構(gòu)；錯(cuò)誤正確：溫度下降到50左右(55)，引物與DNA單鏈結(jié)合，DNA恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，恢復(fù)活性；正確錯(cuò)誤：溫度上升至72，DNA分子開始復(fù)制、延伸，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。故選C。 4PCR技術(shù)又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，現(xiàn)在已成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的一種常規(guī)手段，它可以在體外很短的時(shí)間內(nèi)將DNA大量擴(kuò)增。你認(rèn)為下列符合在體外進(jìn)行PCR反應(yīng)條件的一組是（） 穩(wěn)定的緩沖液環(huán)境DNA模板 合成引物四種脫氧

10、核苷酸 DNA聚合酶DNA解旋酶 限制性核酸內(nèi)切酶溫控設(shè)備 A.B. C.D. 【答案】D 【解析】 在PCR技術(shù)中，需要的條件有模板、引物、脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶，此外還需要適宜的溫度和pH(即穩(wěn)定的緩沖液環(huán)境)，故選D。 5從2001年初到現(xiàn)在，青島某實(shí)驗(yàn)基地已孕育出上百只轉(zhuǎn)基因克隆羊，它們的體內(nèi)分別攜帶包括干擾素、抗凝血酶素、乙肝表面抗原在內(nèi)的多種藥用蛋白基因。這意味著，它們可以通過產(chǎn)奶的方式源源不斷地提供藥用蛋白基因，其應(yīng)用前景非常光明。在其實(shí)驗(yàn)研究過程中，經(jīng)常利用PCR技術(shù)制取大量的有關(guān)藥用蛋白基因來供實(shí)驗(yàn)用。下列有關(guān)PCR技術(shù)的敘述中，不合理的是（） A.PCR擴(kuò)增反應(yīng)中

11、加人引物的作用是結(jié)合在模板DNA上，提供DNA延伸起始位點(diǎn) B.DNA聚合酶的作用是從引物的5'端開始催化DNA鏈的延伸。 C.PCR技術(shù)依據(jù)是DNA的熱變性原理 D.PCR的反應(yīng)過程一般經(jīng)歷三十多個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)都包括變性、復(fù)性、延伸 【答案】B 【解析】 在PCR中引物能結(jié)合在模板DNA上，提供DNA延伸起始位點(diǎn)，故A正確；DNA聚合酶的作用是從3'端開始催化DNA鏈的延伸，故B錯(cuò)；PCR技術(shù)的依據(jù)是DNA的熱變性原理，每次循環(huán)包括變性、復(fù)性和延伸，故CD均正確。 【終極闖關(guān)】 1（2015屆江蘇省四市調(diào)研）利用PCR技術(shù)將某小段DNA分子擴(kuò)增n代，需（雙選）（） A.測(cè)定

12、DNA分子兩端的核苷酸序列，以便設(shè)計(jì)引物對(duì) B.2n1對(duì)引物參與子代DNA分子的合成 C.向反應(yīng)體系中加入解旋酶、DNA聚合酶等 D.保持反應(yīng)體系溫度恒定，確保擴(kuò)增的正常進(jìn)行 【答案】AB 【解析】 利用PCR技術(shù)將某小段DNA分子擴(kuò)增，必需測(cè)定DNA分子兩端的核苷酸序列，以便設(shè)計(jì)引物對(duì)，才能按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成子鏈，A正確；DNA分子擴(kuò)增n代以后，共合成了2n個(gè)DNA分子片段，除起始的兩條模板鏈以外，其它鏈上都含有引物，所以共有2n1對(duì)引物參與子代DNA分子的合成，B正確；PCR過程中利用高溫解旋，不需要向反應(yīng)體系中加入解旋酶，C錯(cuò)誤；PCR包括三個(gè)階段，即高溫解旋、低溫復(fù)性、中溫延伸，

13、所以反應(yīng)體系溫度不恒定，D錯(cuò)誤。 2（2015屆安徽省蚌埠市高三檢測(cè)）下列有關(guān)生物工程與技術(shù)的敘述不正確的是（） APCR技術(shù)可用于目的基因的獲取 B選擇單核居中期向單核靠邊期過渡的花粉進(jìn)行離體培養(yǎng)成功率高 C在以尿素為唯一碳源的培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落一定是尿素分解菌 D“三北防護(hù)林”建設(shè)中，應(yīng)遵循協(xié)調(diào)與平衡原理和物種多樣性原理 【答案】C 【解析】 PCR可以用于外源目的基因的大量擴(kuò)增，故A正確。在花粉選擇進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)應(yīng)選擇單核靠邊期的成功率高，故B正確。在以尿素為唯一碳源的培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落有可能是尿素分解菌也有可能是以氮?dú)鉃橹鞯募?xì)菌，還要加入酚紅指示劑進(jìn)行鑒別，故C錯(cuò)誤。“三北防護(hù)林”建設(shè)

14、中，應(yīng)遵循協(xié)調(diào)與平衡和物種多樣性原理，故D正確。 3（2015屆江蘇省高三下學(xué)期第二次統(tǒng)考）如圖表示細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制和細(xì)胞外PCR擴(kuò)增兩個(gè)過程,兩反應(yīng)過程的條件中相同的是（） A.模板B.原料 C.酶D.能量供應(yīng) 【答案】B 【解析】 選項(xiàng)A模板不同,胞內(nèi)DNA復(fù)制以整個(gè)DNA分子作為模板,PCR擴(kuò)增卻以一段目的DNA作為模板。選項(xiàng)B原料相同,均以4種脫氧核苷酸為原料。選項(xiàng)C酶不相同,胞內(nèi)DNA解旋需要解旋酶,延伸需要DNA聚合酶等;胞外PCR擴(kuò)增通過高溫解旋而不需要解旋酶,延伸只需熱穩(wěn)定的Taq酶。選項(xiàng)D能量供應(yīng)不同,胞內(nèi)DNA復(fù)制過程由ATP提供能量,而PCR擴(kuò)增主要由外界供能。 4（20

15、15屆江蘇省揚(yáng)州市高三月考）在PCR擴(kuò)增DNA的實(shí)驗(yàn)中，預(yù)計(jì)一分子DNA經(jīng)過30次循環(huán)后，應(yīng)該得到230個(gè)DNA分子，但是結(jié)果只有約210個(gè)DNA分子，那么不是出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因是（） ATaq DNA聚合酶的活力不夠，或活性受到抑制 B系統(tǒng)設(shè)計(jì)欠妥 C循環(huán)次數(shù)不夠 D引物不能與親鏈結(jié)合 【答案】D 【解析】 PCR擴(kuò)增沒有得到應(yīng)有的DNA分子數(shù)，有可能是TaqDNA聚合酶活性不夠或活性受抑制，可能形成的DNA少，故A正確。系統(tǒng)設(shè)計(jì)欠妥會(huì)導(dǎo)致達(dá)不到預(yù)期的結(jié)果，故B正確。循環(huán)次數(shù)不夠會(huì)出現(xiàn)子代DNA分子數(shù)少，故C正確。引物與親鏈不能結(jié)合的情況下不會(huì)出現(xiàn)子代，而不是少，故D錯(cuò)誤。 5.（2013江蘇卷22）小鼠雜交瘤細(xì)胞表達(dá)的單克隆抗體用于人體試驗(yàn)時(shí)易引起過敏反應(yīng)，為了克服這個(gè)缺陷，可選擇性擴(kuò)增抗體的可變區(qū)基因 （目的基因）后再重組表達(dá)。下列相關(guān)敘述正確的是（雙選）（） A.設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的基因的引物時(shí)不必考慮表達(dá)載體的序列 B.用PCR 方