11微生物的分類及其分類方法

1、第三章 微生物的分類及其分類方法本章的核心內(nèi)容是微生物的分類單元、微生物的命名法則；目前國內(nèi)外最權(quán)威的原核微生物分類系統(tǒng)；用于分離菌株分類鑒定的方法和技術(shù)；微生物菌種的保藏。微生物的分類單元有界、門、綱、目、科、屬、種；微生物的命名依林奈氏雙名法法則進(jìn)行； 伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)， 伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)是當(dāng)今進(jìn)行細(xì)菌鑒定的最權(quán)威的手冊(cè)；微生物分離菌株的分類鑒定有經(jīng)典分類鑒定法、數(shù)值分類鑒定法、化學(xué)分類鑒定法、 遺傳學(xué)分類鑒定法，DNA中 GCm ol%分析、DNA-DNA雜交、DNA-rRNA雜交、16Sr RNA(16SrDNA)寡核苷酸的序列分析，微生物系統(tǒng)發(fā)育地位分析等不同層次的技術(shù)方法。

2、微生物菌種的保藏對(duì)于研究和發(fā)酵生產(chǎn)都具有不可忽視的意義。保藏方法可依不同條件選擇不同方法。第一節(jié) 微生物的分類單元和命名分類是人類認(rèn)識(shí)微生物，進(jìn)而利用和改造微生物的一種手段，微生物工作者只有在掌握了分類學(xué)知識(shí)的基礎(chǔ)上，才能對(duì)紛繁的微生物類群有一清晰的輪廊，了解其親緣關(guān)系與演化關(guān)系，為人類開發(fā)利用微生物資源提供依據(jù)。微生物分類學(xué)(microbial taxonomy) 是一門按微生物的親緣關(guān)系把它們安排成條理清楚的各種分類單元或分類群(taxon) 的科學(xué)，它的具體任務(wù)有三，即分類(classification) 、 命名 (nomenclature) 和鑒定 (identification)

3、。 分類指的是根據(jù)相似性或親緣關(guān)系，將一個(gè)有機(jī)體放在一個(gè)單元中。命名是按照國際命名法規(guī)給有機(jī)體一個(gè)科學(xué)名稱。鑒定則是確定一個(gè)新的分離物是否歸屬于已經(jīng)命名的分類單元的過程。因此，概括來說，微生物分類學(xué)是對(duì)各個(gè)微生物進(jìn)行鑒定，按分類學(xué)準(zhǔn)則排列成分類系統(tǒng)，并對(duì)已確定的分類單元進(jìn)行科學(xué)命名的科學(xué)。一、微生物的分類單元微生物的主要分類單位，依次為界(kingdom) 、門( phylum 或 division )、綱(class) 、目 (order) 、科 (fami1y) 、屬 (genus) 、種 (species) 。其中種是最基本的分類單位。具有完全或極多相同特點(diǎn)的有機(jī)體構(gòu)成同種。性質(zhì)相似、相

4、互有關(guān)的各種組成屬。相近似的屆合并為科。近似的科合并為目。近似的目歸納為綱。綜合各綱成為門。由此構(gòu)成一個(gè)完整的分類系統(tǒng)。以下以檸檬浮霉?fàn)罹鸀槔右哉f明。另外， 每個(gè)分類單位都有亞級(jí)，即在兩個(gè)主要分類單位之間，可添加“亞門”、 “亞綱”、“亞目、”“亞科”等次要分類單位。在種以下還可以分為亞種、變種、型、菌株等。屬是科與種之間的分類單元，通常包含具有某些共同特征和關(guān)系密切的種。Goodfellow和 O'Donnell(1993) 提出 DNA 的G+C mol% 差異10 12 及 16S rDNA 的序列同源性 95 的種可歸為同一屬。種 (species) 關(guān)于微生物“種”的概念，

5、各個(gè)分類學(xué)家的看法不一，例如伯杰氏(Bergey) 給種的定義是： “凡是與典型培養(yǎng)菌密切相同的其他培養(yǎng)菌統(tǒng)一起來， 區(qū)分成為細(xì)菌的一個(gè)種?！币虼?，它是以某個(gè)“標(biāo)準(zhǔn)菌株”為代表的十分類似的菌株的總體。種是以群體形式存在的。種有著不同的定義，在微生物學(xué)中較常見有生物學(xué)種( biological species ，BS )，進(jìn)化種(evolutionary species ， ES) 和系統(tǒng)發(fā)育種(phylogenetic species ，PS )等不同的物種概念。1986 年斯坦?fàn)?Stanier) 給種下了定義：“一個(gè)種是由一群具有高度表型相似性的個(gè)體組成，并與其他具有相似特征的類群存在明顯

6、的差異?！钡@個(gè)定義仍無量化標(biāo)準(zhǔn)。 1987 年，國際細(xì)菌分類委員會(huì)頒布，DNA 同源性70 ，而且其T m 5 的菌群為一個(gè)種，并且其表型特征應(yīng)與這個(gè)定義相一致。1994 年 Embley 和 Stackebrandt 認(rèn)為當(dāng) 16SrDNA 的序列同源性97 時(shí)可認(rèn)為是一個(gè)種。亞種 (subspecies) 在種內(nèi)，有些菌株如果在遺傳特性上關(guān)系密切，而且在表型上存在較小的某些差異，一個(gè)種可分為兩個(gè)或兩個(gè)以上小的分類單位，稱為亞種。它們是細(xì)菌分類中具有正式分類地位的最低等級(jí)。根據(jù)T m 值在 DNA 雜交中的頻率分布，有些證據(jù)表明，亞種的概念在系統(tǒng)發(fā)育上是有效的，而且能與亞種以下的變種概念相

7、區(qū)別。后者僅是依據(jù)所選擇的“實(shí)用”屬性而決定，并不被 DNA 組成所證明。亞種以下的分類等級(jí)通常表示能用某些特殊的特征加以區(qū)別的菌株類群。例如，在細(xì)菌分類中，以生物變型(biovar) 表示特殊的生化或生理特征，血清變型(serovar 結(jié)構(gòu)的不同，致病變型(pathovar) 表示某些寄主的專一致病性，噬菌變型(phagovar) 表示對(duì)噬菌體的特異性反應(yīng)，形態(tài)變型(morphovar) 表示特殊的形態(tài)特征。菌株或品系(strain) 這是微生物學(xué)中常碰到的一個(gè)名詞，它主要是指同種微生物不同來源的純培養(yǎng)物。從自然界分離純化所得到的純培養(yǎng)的后代，經(jīng)過鑒定屬于某個(gè)種，但由于來自不同的地區(qū)、土壤和

8、其他生活環(huán)境，它們總會(huì)出現(xiàn)一些細(xì)微的差異。這些單個(gè)分離物的純培養(yǎng)的后代稱為菌株。菌株常以數(shù)目、字母、人名或地名表示。那些得到分離純化而未經(jīng)鑒定的純培養(yǎng)的后代則稱為分離物。微生物學(xué)中還常常用到“群”這個(gè)詞，這只是為了科研或鑒定工作方便，首先按其形態(tài)或結(jié)合少量的生理生化、生態(tài)學(xué)特征，將近似的種和介于種間的菌株歸納為若干個(gè)類群。如為了篩選抗生素工作的方便，中國科學(xué)院微生物研究所根據(jù)形態(tài)和培養(yǎng)特征，把放線菌中的鏈霉菌屬歸納為12 個(gè)類群。微生物分類各級(jí)單元所用的后綴如表3-1 。表 3 1 微生物分類各級(jí)單元拉丁學(xué)名后綴二、微生物的命名微生物的命名和其他生物一樣，都按國際命名法命名，即采用林奈氏 立的

9、“雙名法”。每一種微生物的學(xué)名都依屬與種而命名，由兩個(gè)拉丁字或希臘字或者拉丁 化了的其他文字組成。屬名在前，規(guī)定用拉丁字名詞表示，字首字母要大寫，由微生物的構(gòu)(Linnaeus) 所創(chuàng)造、形狀，或由著名的科學(xué)家名字而來，用以描述微生物的主要特征。種名在后，用拉丁字形容詞表示，字首字母小寫，為微生物的色素、形狀、來源、病名或著名的科學(xué)家姓名等，用以描述微生物的次要特征。此外，由于自然界的生物種類太多了，大家都在命名，為了更明確，避免誤解，故在正式的拉丁名稱后面附著命名者的姓。例如。金黃色葡萄球菌的學(xué)名為：Staphylococcus aureus Rosenbach 1884屬名：葡萄球菌種名：

10、金黃色命名人的姓命名年份又如： Peptostreptococcus foetidus （ Veillon ） Smith屬名：消化鏈球菌種名：惡臭原命名者改名者惡臭消化鏈球菌是由Veillon 首先發(fā)現(xiàn)和定名的，后Smith 重新定為現(xiàn)名。由此可以看出，種名后括弧內(nèi)的姓，是表示這個(gè)種首先由Veillon 定的名，在括弧后再附加改定此菌學(xué)名人的姓。如果發(fā)表新種，則在學(xué)名之后加n sp（ 即 novo species 的縮寫，意為新種 ） 。 有時(shí)只泛指某一屬的微生物，而不是指定某一個(gè)具體的種，或沒有種名，只有屬名時(shí)，可在屬名后加sp. 或 spp.（species 的縮寫，sp. 表示單數(shù)，s

11、pp. 表示復(fù)數(shù)） ，如Micrococcus sp. ，表示微球菌屬的一個(gè)種，Micrococcus spp. 表示微球菌屬的一些種。變種的學(xué)名，是在種名后加變種名稱，并在變種名稱之前加var 如枯草芽孢桿菌黑色變種應(yīng)寫成 Bacillus subtilis var. niger 。 屬以上的名稱必須是陰性復(fù)數(shù)形容詞，與 prokaryotae 相一致。三、微生物系統(tǒng)發(fā)育分析由于現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，正在形成一套與傳統(tǒng)的分類鑒定方法完全不同的分類鑒定技術(shù)與方法，從基因水平上分析各微生物種之間的親緣關(guān)系，即系統(tǒng)發(fā)育地位。眾所周知，原核生物細(xì)胞中的16S rDNA 和真核生物細(xì)胞中的18

12、S rDNA 的堿基序列都是十分保守的，不受微生物所處環(huán)境條件的變化、營養(yǎng)物質(zhì)的豐缺的影響而有所變化，都可以看作為生物進(jìn)化的時(shí)間標(biāo)尺，記錄著生物進(jìn)化的真實(shí)痕跡。因此， 分析原核生物細(xì)胞中的16S rDNA和真核生物細(xì)胞中的18S rDNA 的堿基序列，比較所分析的微生物與其他微生物種之間16SrDNA 和 18S rDNA 序列的同源性，可以真實(shí)地揭示它們親緣關(guān)系的距離和系統(tǒng)發(fā)育地位。在現(xiàn)實(shí)研究中，除了選擇16S rDNA 和 18S rDNA 作序列分析進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育比較外，還可利用間隔序列(ITS) 、 某些發(fā)育較為古老而序列又較穩(wěn)定的特異性酶的基因作序列分析，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。如在環(huán)境微生

13、物研究中，對(duì)于谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST )的基因序列分析所獲得的系統(tǒng)發(fā)育鑒定結(jié)果與用其他方法所獲得的結(jié)果具有十分吻合的一致性。隨著研究技術(shù)和理論的日趨成熟，現(xiàn)在有人提出了分子系統(tǒng)學(xué)(molecular systematics) 這一理論概念。系統(tǒng)學(xué)(systematics )是研究生物多樣性及其分類和演化關(guān)系的科學(xué)。分子系統(tǒng)學(xué)是檢測(cè)、描述并揭示生物在分子水平上的多樣性及其演化規(guī)律的科學(xué)。研究內(nèi)容包括了群體遺傳結(jié)構(gòu)、 分類學(xué)、 系統(tǒng)發(fā)育和分子進(jìn)化等領(lǐng)域。群體遺傳結(jié)構(gòu)(population genetic structure)是指一個(gè)種內(nèi)總的遺傳變異程度及其在群體間的分布模式，是一個(gè)種最基礎(chǔ)的遺傳信

14、息。分類學(xué) (taxonomy) 是研究物種的界定和序級(jí)確定。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(phylogeneticrelationship) 和分子進(jìn)化(molecular evolution) 是兩個(gè)密切相關(guān)的過程。在利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在分子和基因水平上獲得大量的分類單元尤其是種的遺傳信息后，來推斷和重建微生物類群的演化歷史和演化關(guān)系，即建立系統(tǒng)發(fā)育樹，如第一章中圖1-1 表示細(xì)菌、古菌和真核生物的無根系統(tǒng)發(fā)育樹。根據(jù)分離菌株的16S rDNA 或 18S rDNA 序列與相關(guān)微生物種之間的同源性，將分離獲得的菌株放置于系統(tǒng)發(fā)育樹的確當(dāng)分支位置，以顯示其在系統(tǒng) 發(fā)育中的地位和與其他種間的親緣關(guān)系。原核

15、微生物中的細(xì)菌和古菌的系統(tǒng)發(fā)育樹分別如圖 3-1 和 3-2 所示。圖 3-1 細(xì)菌域的系統(tǒng)發(fā)育樹(引自 Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, Tenth edition, 2003)圖 3-2 古菌域的系統(tǒng)發(fā)育樹第二節(jié) 原核微生物分類系統(tǒng)一、原核微生物伯杰氏分類系統(tǒng)細(xì)菌、放線菌等原核微生物的分類系統(tǒng)很多，目前較有代表性和最有影響的分類系統(tǒng)是美國的伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)（Bergey , s Manual of Determinative Bacteriology，以下簡稱“手冊(cè)”） ?！笆謨?cè)”自 1923 年第一版以采，相繼于1925

16、 ， 1930 ，1934 ，1939 ， 1948 和 1957 年出版了第二版至第七版，幾乎每一版均吸取了許多分類學(xué)家的經(jīng)驗(yàn)，其內(nèi)容經(jīng)過不斷地?cái)U(kuò)充和修改。“手冊(cè)”第七版包括從綱到種、亞種的全面分類大綱和相應(yīng)的檢索表以及各分類單位的描述，將細(xì)菌列于植物界原生植物門的第二綱裂殖菌綱。 “手冊(cè)”第七版的分類方法基本上處于經(jīng)典分類法階段，即以形態(tài)特征為主結(jié)合生理生化特性為分類依據(jù)。第八版（1974 年 ） 沒有從綱到種的分類系統(tǒng)，而著重于屬、種的描述和比較，它也沒有分類大綱，而是根據(jù)形態(tài)、營養(yǎng)型等分成19 個(gè)部分，把細(xì)菌、放線菌、粘細(xì)菌、螺旋體、枝原體和立克次氏體等2 000 多種微生物歸于原核生

17、物界細(xì)菌門。手冊(cè)第八版的分類方法也有了改進(jìn)，除采用經(jīng)典分類法外，還增加了細(xì)胞化學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等方面的新鑒定方法，對(duì)某些屬、種應(yīng)用了數(shù)值分類法。1994 年，伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)第九版出版。該手冊(cè)根據(jù)表型特征把細(xì)菌分為四個(gè)類別， 35 群?！笆謨?cè) '' 第九版與過去的版本相比較，具有以下特點(diǎn)：該書的目的只是為了鑒別那些已被描述和培養(yǎng)的細(xì)菌，并不把系統(tǒng)分類和鑒定信息結(jié)合起來； 其內(nèi)容的編排嚴(yán)格按照表型特征，所選擇的排列是實(shí)用的，為了有利于細(xì)菌的鑒定，并不試圖提供一個(gè)自然分類系統(tǒng)；手冊(cè)抽取了伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)四卷的表型信息，并包括了盡可能多的新的分類單元，其有效發(fā)表的截止日

18、期是1991 年 1 月。表 3-2 細(xì)菌的高級(jí)分類單位在 1984 1989 年間， “手冊(cè)”的出版者出版了 伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)（Bergey ,s Manual of Systematic Bacteriology ，簡稱“系統(tǒng)分類學(xué)手冊(cè)”） 。該手冊(cè)與伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)有很大不同，首先是在各級(jí)分類單元中廣泛采用細(xì)胞化學(xué)分析、數(shù)值分類方法和核酸技術(shù)，尤其是16S rRNA 寡核苷酸序列分析技術(shù)，以闡明細(xì)菌的親緣關(guān)系，并對(duì)第八版手冊(cè)的分類作了必要的調(diào)整。例如，“系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)”根據(jù)細(xì)胞化學(xué)、比較細(xì)胞學(xué)和 16S rRNA 寡核苷酸序列分析的研究結(jié)果，將原核生物界分為四個(gè)門。由于這個(gè)手冊(cè)的

19、內(nèi)容包括了較多的細(xì)菌系統(tǒng)分類資料，定名伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)，反映了細(xì)菌分類從人為的分類體系向自然的分類體系所發(fā)生的變化。為使發(fā)表的材料及時(shí)反映新進(jìn)展，并考慮使用者的方便，該手冊(cè)分四卷出版。第一卷（1984 年 ） 內(nèi)容為一般、醫(yī)學(xué)或工業(yè)的革蘭氏陰性細(xì)菌。第二卷（1986 年 ） 為放線菌以外的革蘭氏陽性細(xì)菌。第三卷（1989 年 ） 為古細(xì)菌和其他的革蘭氏陰性細(xì)菌。第四卷（1989 年 ） 為放線菌。2000 年， Bergey , s Manualof Systematic Bacteriology 第二版編輯完成并分成5 卷陸續(xù)出版。在此第二版中，細(xì)菌域分為 16 門， 26 組， 27

20、綱， 62 目， 163 科， 814 屬，收集了4 727 個(gè)種。古菌域分為 2 門， 5 組， 8 綱， 11 目， 17 科， 63 屬，收集了208 個(gè)種。供收集進(jìn)原核微生物 4 935 個(gè)種。二、關(guān)于變形細(xì)菌（ Proteobacteria ） 綱運(yùn)用DNA/RNA 雜交、16S rRNA 編目法和16S rRNA 序列分析方法對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育研究的結(jié)果相當(dāng)一致。在研究過程中，發(fā)現(xiàn)“紫細(xì)菌和相關(guān)細(xì)菌”，盡管在表型和基因型方面很不一樣即相當(dāng)異源，但在系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖譜上具有連續(xù)現(xiàn)象，相互之間的進(jìn)化關(guān)系很為密切。1988 年， Stackebrandt 等將這類革蘭氏陰性細(xì)菌命名為

21、“變形細(xì)菌”（ Proteobacteria ） ，其下又分為a- 亞綱、 b- 亞綱， g- 亞綱、 d- 亞綱和 e - 亞綱，見圖 3-3 。 a- 亞綱包括一大群形態(tài)、生理和營養(yǎng)類型（光能自養(yǎng)型、化能無機(jī)營養(yǎng)型和化能有機(jī)營養(yǎng)型）等表型特征十分不同的細(xì)菌，如土壤桿菌（Agrobacterium ）、根瘤菌( Rhizobium ) 、紅假單胞菌( Rhodopseudomonas) 、發(fā)酵單胞菌( Zymomonas) 、副球菌等 ( Paracoccus ) 、立克次氏體(Rickettsia )等。 b- 亞綱由 Woese 于 1984 年提出，包括的菌群有色桿菌屬( Chromo

22、bacterium ) ，水螺菌屬( Aquaspirillum ) ，紫色桿菌 ( Janthinobacterium ) ，德克斯氏菌( Derxia ) ，叢毛單胞菌( Comamonas) ，嗜木桿菌(Xylophilus )等。 g- 亞綱由 Weose1985 年提出，包括了腸桿菌科(Enterobacteriaceae) ，氣單胞菌科(Aeromonadaceae) ，弧菌科(Vibrionaceae) ，巴斯德菌科 (Pasteurellaceae) ， 假單胞菌( Pseudomonas) ， 海洋螺菌( Oceanospirillum ) ，黃單胞菌( Xanthomona

23、s) ，溶桿菌( Lysobacter ) 等。 d- 亞綱由分解代謝的硫酸鹽還原細(xì)菌、元素硫還原細(xì)菌，蛭弧菌( Bdellovibrio ) 和黏細(xì)菌目(Myxococcales) 的 6 個(gè)代表。 e - 亞綱僅有彎曲桿菌( Campylobacter ) 和螺桿菌( Heliobacter )2 屬。圖 3-3 細(xì)菌中的變形菌綱類細(xì)菌第三節(jié) 微生物的分類鑒定方法一、微生物鑒定的依據(jù)獲得純化的微生物分離菌株后，首先判定是原核微生物還是真核微生物，這實(shí)際上在分離過程中所使用的方法和選擇性培養(yǎng)基已經(jīng)決定了分離菌株的大類的歸屬，從平板菌落的特征和液體培養(yǎng)的性狀都可加以判定。然后，如是原核微生物，

24、便可根據(jù)表14-3 所示的經(jīng)典分類鑒定指標(biāo)進(jìn)行鑒定，如條件允許，可做碳源利用的BIOLOG-GN分析和16S rDNA 序列分析。多項(xiàng)結(jié)果結(jié)合起來確定分離菌株的屬和種。微生物經(jīng)典分類鑒定方法的指標(biāo)依據(jù)經(jīng) 典 分 類個(gè)體：細(xì)胞形態(tài)、大小、排列方式，染色反應(yīng)，有無運(yùn)動(dòng)，各種特殊構(gòu)造 特征等 形態(tài)特征：菌落形態(tài)，在固體、半固體或液體培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)等 營養(yǎng)要求：碳源、氮源、礦質(zhì)元素、生長因子等法生理生化特征：代謝產(chǎn)物種類、產(chǎn)量、顯色反應(yīng)等酶：產(chǎn)酶種類和反應(yīng)特征等 生態(tài)學(xué)特性：生長溫度，對(duì)氧的需要，酸堿度要求，宿主種類，生態(tài)分布 等 血清學(xué)反應(yīng) 噬菌體的敏感性 其他二、微生物鑒定的技術(shù)與方法根據(jù)目前

25、微生物分類學(xué)中使用的技術(shù)和方法，可把它們分成四個(gè)不同的水平：細(xì)胞形態(tài)和行為水平，細(xì)胞組分水平，蛋白質(zhì)水平，基因組水平；在微生物分類學(xué)發(fā)展的早期，主要的分類鑒定指標(biāo)是以在細(xì)胞形態(tài)和習(xí)性為主，可稱為經(jīng)典的分類鑒定法。其他三種實(shí)驗(yàn)技術(shù)主要是60 年代以后采用的，稱為化學(xué)分類和遺傳學(xué)分類法，這些方法再加上數(shù)值分類鑒定法，可稱為現(xiàn)代的分類鑒定方法。(一)、經(jīng)典分類鑒定法經(jīng)典分類法是一百多年來進(jìn)行微生物分類的傳統(tǒng)方法。其特點(diǎn)是人為地選擇幾種形態(tài)生理生化特征進(jìn)行分類，并在分類中將表型特征分為主、次。一般在科以上分類單位以形態(tài)特征、科以下分類單位以形態(tài)結(jié)合生理生化特征加以區(qū)分。最后，采用雙歧法整理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，排

26、列一個(gè)個(gè)的分類單元，形成雙歧檢索表(圖3-4 )。A. 能在 60 o C 以上生長B. 細(xì)胞大，寬度1.31.8mm 1. 熱微菌屬( Thermomicrobium )88. 細(xì)胞小，寬度0.40.8mmC. 能以葡萄糖為碳源生長D. 能在 pH4.5 生長 2. 熱酸菌屬( Acidothermus )DD. 不能在 pH4.5 生長 3. 棲熱菌屬( Thermus )CC. 不能以葡萄糖為唯一碳源4. 棲熱嗜油菌屬( 棲熱嗜獅菌屬Thermoleophilum )AA. 不能在 60 o C 以上生長圖 3-4 雙歧法檢索表例樣應(yīng)用BIOLOG-GN儀檢測(cè)分離菌株對(duì)眾多碳源的利用情況

27、判斷分離菌株的分類地位，近年來也時(shí)有應(yīng)用。在 BIOLOG-GN儀上有 96 個(gè)小孔， 其中 95 孔內(nèi)分裝有95 種不同碳源的緩沖液， 1 孔為無碳源的緩沖液對(duì)照，各孔接入適宜菌濃度和液量的分離菌株培養(yǎng)物，定溫培養(yǎng)，每日定時(shí)讀取BIOLOG-GN儀計(jì)算機(jī)上各碳源利用情況，一般為時(shí)1 周，BIOLOG-GN儀可顯示出該鑒定菌株的最可能歸屬。(二)、數(shù)值分類法又稱阿德遜氏分類法() 。它的特點(diǎn)是根據(jù)較多的特征進(jìn)行分類，一般為50 60 個(gè)，多者可達(dá)100 個(gè)以上，在分類上，每一個(gè)特性的地位都是均等重要。通常是以形態(tài)、生理生化特征，對(duì)環(huán)境的反應(yīng)和忍受性以及生態(tài)特性為依據(jù)。最后，將所測(cè)菌株兩兩進(jìn)行比

28、較，并借用電子計(jì)算機(jī)計(jì)算出菌株間的總相似值，列出相似值矩陣（ 圖 3-5） 。為便于觀察，應(yīng)將矩陣重新安排，使相似度高的菌株列在一起，然后將矩陣圖轉(zhuǎn)換成樹狀譜（dendrogram）（ 圖3-6） ，再結(jié)合主觀上的判斷（ 如劃分類似程度大于85 者為同種，大于65 者為同屬等 ） ，排列出個(gè)個(gè)分類群。圖 3-5 顯示 6 個(gè)細(xì)菌菌株的遺傳相似矩陣圖圖 3-6 根據(jù)相似矩陣圖轉(zhuǎn)換的相似關(guān)系樹狀譜數(shù)值分類法的優(yōu)越性在于它是以分析大量分類特征為基礎(chǔ)，對(duì)于類群的劃分比較客觀和穩(wěn)定；而且促進(jìn)對(duì)細(xì)菌類群的全面考查和觀察，為細(xì)菌的分類鑒定積累大量資料。但在使用數(shù)值分類法對(duì)細(xì)菌菌株分群歸類定種或定屬時(shí)，還應(yīng)做

29、有關(guān)菌株的DNA 堿基的 G + Cmol%和DNA雜交，以進(jìn)一步加以確證。（ 三）、化學(xué)分類法微生物分類中，根據(jù)微生物細(xì)胞的特征性化學(xué)組分對(duì)微生物進(jìn)行分類的方法稱化學(xué)分類法 （chemotaxonomy） 。在近二十多年中，采用化學(xué)和物理技術(shù)采研究細(xì)菌細(xì)胞的化學(xué)組成，已獲得很有價(jià)值的分類和鑒定資料，各種化學(xué)組分在原核微生物分類中的意義見表3-4 。表 3-4 細(xì)菌的化學(xué)組分分析及其在分類水平上的應(yīng)用細(xì)胞成份分析內(nèi)容在分類水平上的作用細(xì)胞壁肽聚糖結(jié)構(gòu)種和屬多糖胞壁酸膜脂肪酸種和屬極性類脂霉菌酸類異戊二烯苯醌蛋白質(zhì)氨基酸序列分析屬和屬以上單位血清學(xué)比較電泳圖酶譜代謝產(chǎn)物脂肪酸種和屬全細(xì)胞成分分析

30、熱解氣液色譜分析種和亞種熱解 質(zhì)譜分析隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞化學(xué)組分分析用于微生物分類日趨顯示出重要性。細(xì)胞壁的氨基酸種類和數(shù)量現(xiàn)己被接受為細(xì)菌屬的水平的重要分類學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。在放線菌分類中，細(xì)胞壁成分和細(xì)胞特征性糖的分析作為分屬的依據(jù)，已被廣泛應(yīng)用。脂質(zhì)是區(qū)別細(xì)菌還是古菌的標(biāo)準(zhǔn)之一，細(xì)菌具有?；?脂鍵 ） ，而古菌具有醚鍵脂，因此醚鍵脂的存在可用以區(qū)分古菌。霉菌酸的分析測(cè)定己成為諾卡氏菌形放線菌分類鑒定中的常規(guī)方法之一。鞘氨醇單胞菌和鞘氨醇桿菌等細(xì)胞膜都含有鞘氨醇，因此鞘氨醇的有無可作為此類細(xì)菌的一個(gè)重要標(biāo)志。此外某些細(xì)菌原生質(zhì)膜中的異戊間二烯醌，細(xì)胞色素，以及紅外光譜等分析對(duì)于細(xì)菌、放線

31、菌中某些科、屬、種的鑒定也都十分有價(jià)值。（四）、遺傳學(xué)分類法分子遺傳學(xué)分類法是以微生物的遺傳型（ 基因型 ） 特征為依據(jù)，判斷微生物問的親緣關(guān)系，排列出一個(gè)個(gè)的分類群。目前較常使用的方法有：1 、 DNA 中 G+C mol% 分析每一個(gè)微生物種的DNA 中 GC mol% 的數(shù)值是恒定的，不會(huì)隨著環(huán)境條件、培養(yǎng)條件等的變化而變化，而且在同一個(gè)屬不同種之間，DNA 中 GCmol%的數(shù)值不會(huì)差異太大，可以某個(gè)數(shù)值為中心成簇分布，顯示同屬微生物種的GC mol% 范圍。 DNA 中 GC mol% 分析主要用于區(qū)分細(xì)菌的屬和種，因?yàn)榧?xì)菌DNA 中 GC 含量的變化范圍一般在25 75 ； 而放線

32、菌 DNA 中的 GC 比例范圍非常窄（37 51%） 。一般認(rèn)為任何兩種微生物在GC 含量上的差別超過了10 ，這兩種微生物就肯定不是同一個(gè)種。因此可利用G+C mol 來鑒別各種微生物種屬間的親緣關(guān)系及其遠(yuǎn)近程度。值得注意的是，親緣關(guān)系相近的菌，其 G+C mol 含量相同或者近似，但G+C mol 相同或近似的細(xì)菌，其親緣關(guān)系并不一定相似，這是因?yàn)檫@一數(shù)據(jù)還不能反映出堿基對(duì)的排列序列，而且如放線菌的DNA 的 GC mol% 在 37 51之間， 企圖在這么小的范圍內(nèi)區(qū)分放線菌的幾十個(gè)屬顯然是不現(xiàn)實(shí)的。要比較兩種細(xì)菌的DNA堿基對(duì)排列序列是否相同，以及相同的程度如何，就需做核酸雜交試驗(yàn)。

33、2 、 DNA-DNA雜交DNA 雜交法的基本原理是用DNA 解鏈的可逆性和堿基配對(duì)的專一性，將不同來源的DNA在體外加熱解鏈，并在合適的條件下，使互補(bǔ)的堿基重新配對(duì)結(jié)合成雙鏈DNA ，然后根據(jù)能生成雙鏈的情況，檢測(cè)雜合百分?jǐn)?shù)。如果兩條單鏈DNA 的堿基順序全部相同，則它們能生成完整的雙鏈，即雜合率為100% 。如果兩條單鏈DNA 的堿基序列只有部分相同，則它們能生成的“雙鏈”僅含有局部單鏈，其雜合率小于 100% 。由此；雜合率越高，表示兩個(gè)DNA 之間堿基序列的相似性越高，它們之間的親緣關(guān)系也就越近。如兩株大腸埃希氏菌的DNA 雜合率可高達(dá)100 ， 而大腸埃希氏菌與沙門氏菌的DNA 雜合

34、率較低，約有 70 。 G+Cmol 的測(cè)定和DNA 雜交實(shí)驗(yàn)為細(xì)菌種和屬的分類研究開辟了新的途徑，解決了以表觀特征為依據(jù)所無法解決的一些疑難問題，但對(duì)于許多屬以上分類單元間的親緣關(guān)系及細(xì)菌的進(jìn)化問題仍 不能解決。3 、 DNA rRNA 雜交目前研究RNA 堿基序列的方法有兩種。一是DNA 與 rRNA 雜交，二是16S rRNA 寡核苷酸的序列分析。DNA 與 rRNA 雜交的基本原理、實(shí)驗(yàn)方法同DNA 雜交一樣，不同的是是DNA雜交中同位素標(biāo)記的部分是DNA ， 而 DNA 與 rRNA 雜交中同位素標(biāo)記的部分是rRNA 。 DNA 雜交結(jié)果用同源性百分?jǐn)?shù)表示，而DNA 與 rRNA 雜

35、交結(jié)果用Tm(e) 和 RNA 結(jié)合數(shù)表示。 Tm(e) 值是 DNA 與 rRNA 雜交物解鏈一半時(shí)所需要的溫度。RNA 結(jié)合數(shù)是100 mgDNA所結(jié)合的rRNA 的 m g 數(shù)。根據(jù)這個(gè)參數(shù)可以作出RNA 相似性圖。在rRNA 相似性圖上，關(guān)系較近的菌就集中到一起。關(guān)系較遠(yuǎn)的菌在圖上占據(jù)不同的位置。用rRNA 同性試驗(yàn)和 16SrRNA 寡核苷酸編目的相似性比較rRNA 順反子的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可得到屬以上細(xì)菌分類單元的較一致的系統(tǒng)發(fā)育概念，并導(dǎo)致了古細(xì)菌的建立。4 、16S rRNA(16S rDNA) 寡核苷酸的序列分析首先， 16S rRNA 普遍存在于原核生物(真核生物中其同源分子是18S rRNA ) 中。 rRNA參與生物蛋白質(zhì)的合成過程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物進(jìn)化的漫長歷程中保持不變，可看作為生物演變的時(shí)間鐘。其