蘇云金芽孢桿菌

1、本文對農(nóng)業(yè)上研究最多、用量最大的兩類微生物殺蟲劑蘇云金芽孢桿菌（Bacillus  thuringiensis, Bt）和昆蟲桿狀病毒（baculovirus）進(jìn)行了綜述，分別論述了它們的殺蟲優(yōu)勢、殺蟲的分子機(jī)理、目前的研究狀況，并對它們的基因工程技術(shù)改良路線以及在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，提出了一些建議。由病蟲害引起的農(nóng)作物的減產(chǎn)減收已成為制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)進(jìn)一步發(fā)展的限制因素，全球每年農(nóng)作物因蟲害造成的損失約占總產(chǎn)量的13，而目前對農(nóng)作物害蟲的防治主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥。完全依賴化學(xué)殺蟲劑存在許多弊端，其中最主要的問題是，一種化學(xué)物質(zhì)的廣泛使用會使害蟲的后代產(chǎn)生選擇性進(jìn)化優(yōu)勢，從而對該化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生抗性

2、。例如，世界各地的家蠅品系對殺滅它們的每種殺蟲劑都產(chǎn)生了抗性。第二個(gè)問題是，有的殺蟲劑影響非靶目標(biāo)品種，產(chǎn)生災(zāi)難性后果，某些益蟲被無意中消滅，導(dǎo)致其次要害蟲急劇增長。第三問題是在于環(huán)境的耐受性和許多殺蟲劑的毒性，不僅造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染，而且給人類的健康帶來巨大的威脅。上述不利因素促使人們急欲尋求控制害蟲的替代方案。在對農(nóng)業(yè)害蟲進(jìn)行的長期防治實(shí)踐中，人們逐漸認(rèn)識到必須采取綜合治理的措施，才能有效的控制害蟲的危害?；蚬こ碳夹g(shù)的發(fā)展，為防治農(nóng)林害蟲提供了一種有效、減污的新技術(shù)手段，微生物農(nóng)藥也因此在世界范圍內(nèi)受到廣泛重視。微生物農(nóng)藥是指非化學(xué)合成、具有殺蟲防病作用的微生物制劑，如微生物殺蟲劑、殺

3、菌劑、農(nóng)用抗生素，等等。這一類微生物包括殺蟲防病的細(xì)菌、真菌和病毒。殺蟲微生物是指其代謝產(chǎn)物或微生物本身對宿主昆蟲有致死效應(yīng)或致病的微生物類群，通常也稱為昆蟲病原微生物。目前已知的殺蟲防病微生物主要有芽孢桿菌科、假單胞菌科、腸桿菌科、鏈球菌科和桿狀病毒科等類群。盡管不同殺蟲微生物引起昆蟲致病的癥狀不盡相同，但殺蟲微生物對害蟲的作用方式主要是通過產(chǎn)生特異性的殺蟲毒素來破壞害蟲的代謝平衡，或者是通過營養(yǎng)體在蟲體內(nèi)的繁殖復(fù)制而引起昆蟲死亡和發(fā)生流行病。除了這一獨(dú)特的殺蟲機(jī)制外，微生物殺蟲劑還具有以下一些特點(diǎn)：對人畜安全無毒，不污染環(huán)境；殺蟲作用具有一定特異性和選擇性，不會使天敵和非目標(biāo)昆蟲致死；易于

4、和其他生物學(xué)手段結(jié)合進(jìn)行害蟲綜合治理，維持生態(tài)平衡；由于殺蟲活性蛋白的多樣性，昆蟲產(chǎn)生抗性較緩慢或不易產(chǎn)生抗性；可以通過發(fā)酵法生產(chǎn)，具有較低的生產(chǎn)成本；可以通過基因工程技術(shù)途徑篩選或構(gòu)建優(yōu)良性能的菌株來滿足生產(chǎn)與應(yīng)用所需等。所以微生物殺蟲劑自問世以來發(fā)展很快，據(jù)報(bào)道，全世界已商品化的微生物農(nóng)藥約30種，微生物殺蟲劑占其中的90。蘇云金芽孢桿菌  殺蟲微生物中研究最多，用量最大的是蘇云金芽孢桿菌。蘇云金芽孢桿菌從上世紀(jì)20年代起就用于害蟲的防治，它的生物學(xué)特性決定了它的微生物殺蟲劑功能。蘇云金芽孢桿菌菌株在生長代謝過程中會形成芽胞，在芽胞形成過程中產(chǎn)生一個(gè)芽胞及一個(gè)或多個(gè)較大

5、的蛋白質(zhì)性質(zhì)的晶體內(nèi)含體。這種蛋白質(zhì)性質(zhì)的晶體被敏感昆蟲攝食后會導(dǎo)致昆蟲死亡，蛋白質(zhì)晶體含有不具活性的原毒素分子內(nèi)毒素，當(dāng)昆蟲幼蟲吞食了這種內(nèi)毒素，晶體就會被幼蟲的堿性腸液溶解，隨后被腸道蛋白酶降解，形成有活性的蛋白質(zhì)毒素，最終導(dǎo)致昆蟲死亡。蘇云金芽孢桿菌菌株在營養(yǎng)體生長旺盛期，某些菌株還會產(chǎn)生一些其它的外毒素，如外毒素、外毒素、外毒素，等等。除上述毒素外，近年來從該菌株或代謝產(chǎn)物中分離純化了多種輔助蛋白，如P19、P20、P21蛋白以及多種營養(yǎng)期殺蟲蛋白。同時(shí)，蘇云金芽孢桿菌制劑具有一些獨(dú)特的優(yōu)良特征。包括經(jīng)幾年儲存仍保持穩(wěn)定、晶體可耐受太陽光的紫外線照射。最重要的特征是，在全球近30年的使

6、用過程中，蘇云金芽孢桿菌制劑被證實(shí)是安全的。目前，蘇云金芽孢桿菌制劑廣泛用于糧食、經(jīng)濟(jì)作物與蔬菜、林業(yè)以及一些衛(wèi)生害蟲的防治。它的另一突出優(yōu)點(diǎn)是選擇性強(qiáng)，對人畜、天敵、植物都非常安全。但也有些不足，如殺蟲作用不持久，田間防治效果僅能維持3、4天；殺蟲譜偏窄，僅對部分鱗翅目害蟲有效；常年使用害蟲可能產(chǎn)生抗藥性。隨著對其作用的分子機(jī)理的大量研究以及近年來基因工程技術(shù)的發(fā)展，通過遺傳學(xué)方法對蘇云金芽孢桿菌進(jìn)行改良，獲得了有價(jià)值的蘇云金芽孢桿菌新菌株。選擇性質(zhì)粒改造許多蘇云金芽孢桿菌菌株的菌體內(nèi)含復(fù)合質(zhì)粒，大多數(shù)這樣的質(zhì)粒可以攜帶一個(gè)或多個(gè)cry基因（蘇云金芽孢桿菌的主要?dú)⑾x晶體蛋白基因），任何cry

7、基因的表達(dá)水平都受其它c(diǎn)ry基因表達(dá)的影響。有時(shí)，一個(gè)cry基因編碼對特定靶害蟲具有高活力的原毒素，而另一個(gè)cry基因編碼對該害蟲具有低活力的原毒素，在這種情況下，可以通過除去編碼低活力原毒素蛋白基因來實(shí)現(xiàn)。以蘇云金芽孢桿菌庫斯塔克亞種菌株HD-1為例，該菌株含有一個(gè)攜帶編碼對鱗翅目專一的135kDa晶體蛋白基因的67kb質(zhì)粒，以及攜帶一個(gè)編碼其他晶體蛋白基因的174kb質(zhì)粒。小心的進(jìn)行熱激誘導(dǎo)或反復(fù)接種培養(yǎng)，會導(dǎo)致質(zhì)粒在細(xì)胞分裂期間發(fā)生分離，產(chǎn)生缺失部分或全部質(zhì)粒的變異種。失去174kb質(zhì)粒的HD-1突變株，會高表達(dá)保留下來的67kb質(zhì)粒編碼的135kDa晶體蛋白原毒素。通過接合構(gòu)建新菌株蘇

8、云金芽孢桿菌菌株的特定質(zhì)?？梢宰孕修D(zhuǎn)移，這些質(zhì)?？梢酝ㄟ^接合來構(gòu)建新菌株。例如，科羅拉多馬鈴薯甲蟲（鞘翅目）是北美最具破壞性的馬鈴薯害蟲，歐洲玉米螟和土豆塊莖蠕蟲，對馬鈴薯也有很大的破壞作用。從自然界中分離的蘇云金芽孢桿菌菌株，沒有一個(gè)菌株對所有這些昆蟲都具毒性。然而，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移雜交，現(xiàn)在已經(jīng)構(gòu)建出對三種害蟲都有效的新菌株，田間試驗(yàn)表明該菌株作為廣譜的馬鈴薯殺蟲劑很有前途。cry基因向其它生物體轉(zhuǎn)移利用基因工程技術(shù)，任何生物體都可以獲得并表達(dá)cry基因以及進(jìn)行相關(guān)的修飾。目前，cry基因已經(jīng)被轉(zhuǎn)移到不同的細(xì)菌和植物中并高效表達(dá)，另外，將cry基因轉(zhuǎn)移到在水生環(huán)境中茂盛生長的藍(lán)細(xì)菌中，可以使蚊

9、子聚集的環(huán)境保持高水平的毒素。這種類型的基因轉(zhuǎn)移對作物保護(hù)和致病昆蟲的抑制提供了新思路。對蘇云金芽孢桿菌進(jìn)行遺傳改良，達(dá)到擴(kuò)大殺蟲譜和提高殺蟲毒力的目的，并在此基礎(chǔ)上分別構(gòu)建了對棉鈴蟲、小菜蛾、甜菜夜蛾、斜紋夜蛾等害蟲高效的工程菌，已進(jìn)入田間試驗(yàn)階段。另外還有一些芽孢桿菌也可以用作農(nóng)業(yè)殺蟲劑，如球形芽孢桿菌、金龜子芽孢桿菌，等等。昆蟲桿狀病毒  昆蟲桿狀病毒也是一類重要的、較早應(yīng)用的昆蟲病原微生物。昆蟲感染病毒很常見，桿狀病毒科的宿主范圍限定在一小部分節(jié)肢動物昆蟲、一些甲殼類和螨類，然而，敏感昆蟲包括許多害蟲。桿狀病毒占所有已知感染昆蟲病毒的60以上，它們對脊椎動物和植物不

10、具致病性。目前至少已有600多種昆蟲（主要是鱗翅目昆蟲）和其它無脊椎動物中發(fā)現(xiàn)桿狀病毒感染，并常常在引起昆蟲流行病，也是調(diào)節(jié)昆蟲種群密度的重要病原因子。桿狀病毒的重要特征之一就是在其生活史的某一階段，產(chǎn)生包含體，病毒粒子包埋于包含體的蛋白基質(zhì)中。敏感幼蟲吞食了污染病毒包含體的食物會導(dǎo)致昆蟲感染，病毒包含體在宿主消化道堿液中崩解，釋放出病毒顆粒，病毒顆粒進(jìn)入宿主的腸上皮細(xì)胞。宿主死亡和分解后，包含體可以較長時(shí)間保護(hù)病毒使之不失去感染力，當(dāng)包含體被其它幼蟲吞食后，疾病可在昆蟲群體中傳播。作為微生物殺蟲劑，桿狀病毒具有優(yōu)異的性能。桿狀病毒的宿主范圍很窄，他們對其他非目標(biāo)昆蟲的影響很小。效果良好，在蟲

11、害發(fā)生前期使用防效達(dá)99%以上。桿狀病毒產(chǎn)生的包含體具有侵染性病毒顆粒，對環(huán)境的生物穩(wěn)定性起重要作用，使得利用傳統(tǒng)技術(shù)去制造和應(yīng)用病毒更容易。作為昆蟲專一性的病原微生物，對人畜、天敵、環(huán)境安全，是生產(chǎn)有機(jī)食品必不可少的生物農(nóng)藥，其市場前景看好。從1985年國家投資在湖北蔣湖農(nóng)場建立我國第一個(gè)棉鈴蟲病毒殺蟲劑工廠以來，已有多種病毒殺蟲劑研制成功，并進(jìn)人批量生產(chǎn)，在發(fā)展“無公害”蔬菜生產(chǎn)中發(fā)揮了重要的作用。當(dāng)然，此類微生物農(nóng)藥也有缺點(diǎn)。病毒殺蟲劑比化學(xué)殺蟲劑更昂貴；許多桿狀病毒具有高度的宿主特異性，因此它們只能進(jìn)行選擇性害蟲的控制，而多數(shù)植物卻同時(shí)受多種不同鱗翅目害蟲攻擊；桿狀病毒殺蟲的速度慢，宿

12、主吞食病毒46天后才死亡，其間的大多數(shù)時(shí)間幼蟲仍繼續(xù)破壞作物；另外，若將桿狀病毒用傳統(tǒng)的噴霧技術(shù)噴到植物葉子上，在紫外線照射下很快就會失去活性。上述這些因素制約了桿狀病毒作為害蟲殺蟲劑的更廣泛應(yīng)用。因此需要通過基因工程技術(shù)對它們進(jìn)行改良。生產(chǎn)人們希望的廣宿主范圍的品系是完全可能的，一種來自苜蓿擬尺蠖的苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒，已知的宿主范圍包括鱗翅目11科中的43種，決定桿狀病毒的宿主范圍和毒性的因素還在研究之中。桿狀病毒基因工程的技術(shù)路線是，去除某些不影響病毒復(fù)制和感染的基因，在其強(qiáng)啟動子后面插入能增強(qiáng)殺蟲毒力的外源基因，如利尿激素基因、Bt殺蟲蛋白基因、蝎神經(jīng)毒素基因等。工程病毒對害蟲致

13、病時(shí)間可縮短2540，進(jìn)食量可減少3050，防治效果明顯改善。近年研究較多的基因還有在侵染早期表達(dá)的蛻皮類固醇UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因egt和在侵染后期表達(dá)的蛻皮轉(zhuǎn)錄因子基因CHR3。egt的缺失或基因CHR3的大量表達(dá)可使害蟲迅速蛻皮和停止取食而死亡。還有學(xué)者提出讓桿狀病毒建立對紫外線誘導(dǎo)的損傷更為有效的DNA修復(fù)系統(tǒng)，來降低病毒對紫外線的敏感程度，增強(qiáng)殺蟲能力。昆蟲病原真菌對害蟲也具有廣泛的寄生性和致病性，但因其遺傳背景復(fù)雜、殺蟲分子機(jī)理和遺傳改良的研究較昆蟲病原細(xì)菌和病毒相對滯后。值得一提的是，這方面的研究已有顯著進(jìn)展，如St Leger等已從綠僵菌（Metarhizium  anisopliae）中分離出一種類似枯草桿菌素的蛋白酶，在工程菌中高表達(dá)后使煙草天蛾的食量減少了