方法學(xué)驗(yàn)證指導(dǎo)原則

1、準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度系指采用該方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度,一般用回收率 表示.準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)測(cè)定.1 .化學(xué)藥含量測(cè)定方法的準(zhǔn)確度原料藥采用對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定,或用本法所得結(jié)果與準(zhǔn)確度的另一個(gè)方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比 較.制劑可在處方量空白輔料中,參加量被測(cè)物對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定.如不能得到制劑輔料的全部 組分,可向待測(cè)制劑中加人量的被測(cè)物對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定,或用所建立方法的測(cè)定結(jié)果與準(zhǔn)確度的另一種方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比擬.準(zhǔn)確度也可由所測(cè)定的精密度、線性和專屬性推算出來.2 .化學(xué)藥雜質(zhì)定量測(cè)定的準(zhǔn)確度可向原料藥或制劑處方量空白輔料中加人量雜質(zhì)進(jìn)行測(cè)定.如不能得到雜質(zhì)或降解產(chǎn)物對(duì) 照品,可用所建立方

2、法測(cè)定的結(jié)果與另一成熟的方法 進(jìn)行比擬,如藥典標(biāo)準(zhǔn)方法或經(jīng)過驗(yàn)證的方 法.在不能測(cè)得雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的校正因子或不能測(cè)得對(duì)主成分的相對(duì)校正因子的情況下,可用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算雜質(zhì)含量. 應(yīng)明確說明單個(gè)雜質(zhì)和雜質(zhì)總量相當(dāng)于主成分的重 量比或面積比 .3 .中藥化學(xué)成分測(cè)定方法的準(zhǔn)確度可用對(duì)照品進(jìn)行加樣回收率測(cè)定,即向被測(cè)成分含量的供試品中再精密加人一定量的被測(cè) 成分對(duì)照品,依法測(cè)定.用實(shí)測(cè)值與供試品中含有量之差,除以參加對(duì)照品量計(jì)算回收率.在加樣回收試驗(yàn)中須注意對(duì)照品的加人量與供試品中被測(cè)成分含有量之和必須在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之內(nèi)； 參加對(duì)照品的量要適當(dāng),過小那么引起較大的相對(duì)誤差,

3、過大那么干擾成分相對(duì)減少,真實(shí)性差 .回收率： = C - A /S X 100%式中：A為供試品所含被測(cè)成分量；B為參加對(duì)照品量； C為實(shí)測(cè)值.4 .校正因子的準(zhǔn)確度對(duì)色譜方法而言,絕對(duì)或定量 校正因子是指單位面積的色譜峰代表的待測(cè)物質(zhì)的量.待 測(cè)定物質(zhì)與所選定的參照物質(zhì)的絕對(duì)校正因子之比,即為相對(duì)校正因子.相對(duì)校正因子計(jì)算法常應(yīng)用于化學(xué)藥有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定、中藥材及其復(fù)方制劑中多指標(biāo)成分的測(cè)定.校正因子的表示方法很多, 本指導(dǎo)原那么中的校正因子是指氣相色譜法和高效液相色譜法中的相對(duì)重量校正因子.相對(duì)校正因子可采用替代物對(duì)照品和被替代物待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)曲線斜比值進(jìn)行比擬獲得；采用紫 外吸收檢測(cè) 器時(shí),

4、可將替代物對(duì)照品和被替代物待測(cè)物在規(guī)定波長(zhǎng)和溶劑條件下的吸收系數(shù)比值進(jìn)行 比擬,計(jì)算獲得.5 .數(shù)據(jù)要求在規(guī)定范圍內(nèi),取同一濃度相當(dāng)于 100%濃度水平的供試品,用至少測(cè)定 6份樣品的結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)；或設(shè)計(jì)3種不同濃度,每種濃度分別制備3份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定,用9份樣品的測(cè)定 結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià).對(duì)于化學(xué)藥品,一般中間濃度參加量與所取供試品中待測(cè)定成分量之比限制在1 : 1左右,建議高中、低濃度對(duì)照品參加量與所取供試品中待測(cè)定成分量之比限制在1.2 : 1, 1 : 1 , 0.8 :1左右,應(yīng)報(bào)告參加量的回收率 ,或測(cè)定結(jié)果平均值與真實(shí)值之差及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差或 置信區(qū)間置信度一般為95% 0對(duì)于中藥

5、,一般中間濃度加人量與所取供試品中待測(cè)定成分量之 比限制在1 : 1左右,建議高、中、低濃度對(duì)照品加人量與所取供試品中待測(cè)定成分量之比 限制在1 .5: 1, 1 : 1, 0.5 : 1左右,應(yīng)報(bào)告供試品取樣量、供試品中含有量、對(duì)照品參加量、測(cè)定 結(jié)果和回收率 計(jì)算值,以及回收率 的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD% 或置信區(qū)間.對(duì)于校 正因子,應(yīng)報(bào)告測(cè)定方法、測(cè)定結(jié)果和RSD% o在基質(zhì)復(fù)雜、組分含量低于 0.01%及多成分等 分析中,回收率限度可適當(dāng)放寬.二、精密度精密度系指在規(guī)定的條件下,同一份均勻供試品,經(jīng)屢次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度. 精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示.在相同條

6、件下,由同一個(gè)分析人員測(cè)定所得 結(jié)果的精密度稱為重復(fù)性；在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室,不同時(shí)間由不同分析人員用不同設(shè)備測(cè)定結(jié)果之間的 精密度,稱為中間精密度；在不同實(shí)驗(yàn)室由不同分析人員測(cè)定結(jié)果之間的精密度,稱為重現(xiàn)性.含量測(cè)定和雜質(zhì)的定量測(cè)定應(yīng)考察方法的精密度.1 .重復(fù)性在規(guī)定范圍內(nèi),取同一濃度相當(dāng)于 100%濃度水平的供試品,用至少測(cè)定 6份的結(jié)果進(jìn)行評(píng) 價(jià)；或設(shè)計(jì)3種不同濃度,每種濃度分別制備3份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定,用9份樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn) 行評(píng)價(jià).采用9份測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí),對(duì)于化學(xué)藥,一般中間濃度參加量與所取供試品中待測(cè)定 成分量之比限制在1 : 1左右,建議高、中、低濃度對(duì)照品參加量與所 取供試品

7、中待測(cè)定成分量之 比限制在1.2 : 1, 1 : 1, 0.8 : 1左右,對(duì)于中藥,一般中間濃度參加量與所取供試品中待測(cè)定成分量之比限制在1 :1左右,建議高、中、低濃度對(duì)照品參加量與所取供試品中待測(cè)定成分量之比控 制在 1.5 : 1, 1 : 1, 0.5 : 1 左右.2 .中間精密度考察隨機(jī)變動(dòng)因素如不同日期、不同分析人員、不同儀器對(duì)精密度的影響,應(yīng)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行中 間精密度試驗(yàn).3 .重現(xiàn)性國(guó)家藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用的分析方法,應(yīng)進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn),如通過不同實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)獲得重現(xiàn)性結(jié) 果.協(xié)同檢驗(yàn)的目的、過 程和重現(xiàn)性結(jié)果均應(yīng)記載在起草說明中.應(yīng)注意重現(xiàn)性試驗(yàn)用樣品質(zhì)量 的一致性及貯存運(yùn)輸中的

8、環(huán)境對(duì)該一致性的影響,以免影響重現(xiàn)性結(jié)果.4 .數(shù)據(jù)要求均應(yīng)報(bào)告偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差或置信區(qū)間.在基質(zhì)復(fù)雜、含量低于0.01%及多成分等分析中,精密度接受范圍可適當(dāng)放寬.三、 專屬性專屬性系指在其他成分如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等存在下,采用的析方法能正確測(cè)定被測(cè)物 的水平.鑒別反響、雜質(zhì)檢查和含量測(cè)定方法,均應(yīng)考察其專屬性.如方法專屬性不強(qiáng),應(yīng)采用多 種不同原理的方法予以補(bǔ)充.1 .鑒別反響應(yīng)能區(qū)分可能共存的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)相似化合物. 不含被測(cè)成分的供試品,以及結(jié)構(gòu)相似或組分中 的有關(guān)化合物,應(yīng)均呈陰性反響.2 .含量測(cè)定和雜質(zhì)測(cè)定采用色譜法和其他別離方法,應(yīng)附代表性圖譜,以說明方法的專屬性

9、,并應(yīng)標(biāo)明各成分在圖中 的位置,色譜法中的別離度應(yīng)符合要求.在雜質(zhì)對(duì)照品可獲得的情況下,對(duì)于含量測(cè)定,試樣中可參加雜質(zhì)或輔料,考察測(cè)定結(jié)果是否 受干擾,并可與未加雜質(zhì)或輔料的試樣比擬測(cè)定結(jié)果. 對(duì)于雜質(zhì)檢查,也可向試樣中參加一定量的 雜質(zhì),考察各成分包括雜質(zhì)之間能否得到別離.在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下,可將含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣進(jìn)行測(cè)定,與另一個(gè)經(jīng) 驗(yàn)證了的方法或藥典方法 比擬結(jié)果.也可用強(qiáng)光照射、高溫、高濕、酸 堿水解或氧化等方法進(jìn) 行加速破壞,以研究可能存在的降解產(chǎn)物和降解途徑對(duì)含量測(cè)定和雜質(zhì)測(cè)定的影響.含量測(cè)定方法應(yīng)比對(duì)兩種方法的結(jié)果,雜質(zhì)檢查應(yīng)比對(duì)檢出的雜質(zhì)個(gè)數(shù),必要時(shí)可采用光

10、二極管陣列檢測(cè)和質(zhì)譜 檢測(cè),進(jìn)行峰純度檢查.四、檢測(cè)限檢測(cè)限系指試樣中被測(cè)物能被檢測(cè)出的最低量. 藥品的鑒別試驗(yàn)和雜質(zhì)檢查方法,均應(yīng)通過測(cè) 試確定方法的檢測(cè)限.檢測(cè)限僅作為限度試驗(yàn)指標(biāo)和定性鑒別的依據(jù), 沒有定量意義.常用的方法 如下.1 .直觀法用濃度的被測(cè)物,試驗(yàn)出能被可靠地檢測(cè)出的最低濃度或量.2 .信噪比法用于能顯示基線噪聲的分析方法,即把巳知低濃度試樣測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行 比擬,計(jì)算出能被可靠地 檢測(cè)出的被測(cè)物質(zhì)最低濃度或量.一般以信噪比為3 :1或2 : 1時(shí)相應(yīng)濃度或注人儀器的量確定檢測(cè)限.3 .數(shù)據(jù)要求上述計(jì)算方法獲得的檢測(cè)限數(shù)據(jù)須用含量相近的樣品進(jìn)行驗(yàn)證.應(yīng)附測(cè)

11、定圖譜,說明試驗(yàn)過程和檢測(cè)限結(jié)果.五、 定量限定量限系指試樣中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量,其測(cè)定結(jié)果應(yīng)符合準(zhǔn)確度和精密度要求.對(duì) 微量或痕量藥物分析、定 量測(cè)定藥物雜質(zhì)和降解產(chǎn)物時(shí),應(yīng)確定方法的定量限.常用的方法如下. 1.直觀法用濃度的被測(cè)物,試驗(yàn)出能被可靠地定量測(cè)定的最低濃度或量.4 .信噪比法用于能顯示基線噪聲的分析方法,即把低濃度試樣測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行 比擬,計(jì)算出能被可靠地 定量的被測(cè)物質(zhì)的最低濃度或量.一般以信噪比為10 :1時(shí)相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定定量限.5 .數(shù)據(jù)要求上述計(jì)算方法獲得的定量限數(shù)據(jù)須用含量相近的樣品進(jìn)行驗(yàn)證.應(yīng)附測(cè)定圖譜,說明測(cè)試過程和定量限結(jié)

12、果,包括準(zhǔn)確度和精密度驗(yàn)證數(shù)據(jù).六、線性線性系指在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi),測(cè)定響應(yīng)值與試樣中被測(cè)物濃度呈比例關(guān)系的程度.應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)測(cè)定線性關(guān)系.可用同一對(duì)照品貯備液經(jīng)精密稀釋,或分別精密稱取對(duì)照品, 制備一系列對(duì)照品溶液 的方法進(jìn)行測(cè)定,至少制備5份不同濃度的對(duì)照品溶液.以測(cè)得的響應(yīng)信 號(hào)對(duì)被測(cè)物的濃度作圖,觀察是否呈線性,再用最小二乘法進(jìn)行線性回歸.必要時(shí),響應(yīng)信號(hào)可經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換,再進(jìn)行線性回歸計(jì)算.或者可采用描述濃度響應(yīng)關(guān)系的非線性模型.數(shù)據(jù)要求：應(yīng)列出回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性圖或其他數(shù)學(xué)模型.七、范圍范圍系指分析方法能到達(dá)一定精密度、準(zhǔn)確度和線性要求時(shí)的上下限濃度或量的區(qū)間.范圍應(yīng)根據(jù)分析方法

13、的具體應(yīng)用及其線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果和要求確定.原料藥和制劑含 量測(cè)定,范圍一般為測(cè)定濃度的 80%? 120% ;制劑含量均勻度檢查,范圍一般為測(cè)定濃度的 70% ? 130%,特殊劑型,如氣霧劑和噴霧劑,范圍可 適當(dāng)放寬；溶出度或釋放度中的溶出量測(cè)定,范 圍一般為限度的*0%,如規(guī)定了限度范圍,那么應(yīng)為下限的-20%至上限的+20% ;雜質(zhì)測(cè)定,范圍應(yīng) 根據(jù)初步實(shí)際測(cè)定數(shù)據(jù),擬訂為規(guī)定限度的 組0%.如果含量測(cè)定與雜質(zhì)檢查同時(shí)進(jìn)行,用峰面積 歸一化法進(jìn)行計(jì)算,那么線性范圍應(yīng)為雜質(zhì)規(guī)定限度的 -20%至含量限度或上限的+20%.在中藥分析中,范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用和線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果及要求確定.對(duì)于有毒的、具特殊成效或藥理作用的成分,其驗(yàn)證范圍應(yīng)大于被限定含量的區(qū)間校正因子測(cè)定時(shí),范圍一般應(yīng)根據(jù)其應(yīng)用對(duì)象的測(cè)定范圍確定.八、耐用性耐用性系指在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí), 測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度,為所建立的方法用于日 常檢驗(yàn)提供依據(jù).開始研究分析方法時(shí), 就應(yīng)考慮其耐用性.如果測(cè)定條件要求苛刻,那么應(yīng)在方法 中寫明,并注明可以接受變動(dòng)的范