蛋白質(zhì)測(cè)定實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、蛋白質(zhì)測(cè)定方法化學(xué)報(bào)告蛋白質(zhì)的檢測(cè)附表蛋白質(zhì)測(cè)定方法的比較方法靈敏度時(shí)間原理干tt物hfi說明凱氏定氮法靈敏度低,適用于費(fèi)時(shí)強(qiáng)將蛋白氮轉(zhuǎn)化為麻，非蛋白氮（可用三用于標(biāo)準(zhǔn)最白質(zhì)含(hgedaN 法)0. 2 7呢氮.in h.用戰(zhàn)吸收后滴定鶴做乙戰(zhàn)沉淀蛋白質(zhì)最的準(zhǔn)確測(cè)定；干誤差再±2%.而分離幾擾少;費(fèi)時(shí)太長(zhǎng).収縮獗法靈敏度低中速,20賽肽犍+堿性硫酸K;Tris 沖用于快速測(cè)定但I(xiàn)Biuiut i±)20mg30mine一紫色絡(luò)合物口液；某些風(fēng)皐阱不太靈敏；不同審白質(zhì)顯色相似。紫外吸收法較為靈敏.50-快速,5 蛋白盛中的酪氨酸各種嚓吟和喻噪;用于層析桂流出液lOOug0m

2、inP柯色氨酸歿電在各種孩晉酸"的檢測(cè)；核酸的吸280an處的光吸收"收可以校正?？捡R斯亮藍(lán)法靈墩度最高.1快速*5 考號(hào)斯亮藍(lán)染料與強(qiáng)堿性緩沖液;吊最好的方法:干擾(Bradford 法)5也15皿叭蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí),其tonX* IOO;SDSs物質(zhì)少;鍥色穩(wěn)定；J由牝5nm變?yōu)轭伾顪\隨蛋白質(zhì)595 nm n不同而變化。酚類、檸檬 酸、硫酸銨、 tris緩沖液、甘 氨酸、糖類、 甘油等均有干 擾作用酚試劑法靈敏度較高 費(fèi)時(shí) 蛋白質(zhì)在堿性溶液中其肽鍵與20250mgCu2+ 螯合，形成蛋白質(zhì)一銅復(fù)合 物，此復(fù)合物使 酚試劑的磷鉬酸 還原，產(chǎn)生藍(lán)色 化合物由上表可大致了解五種

3、檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法，下面 以實(shí)驗(yàn)的形式進(jìn)行詳細(xì)闡述：1 材料與方法1.1 儀器材料(1) 儀器:凱氏定氮儀、紫外分光光度計(jì)、可見光分光光度計(jì)、工作離心機(jī)、布氏漏斗、 抽濾泵。(2) 試劑及原材料 :牛奶、酸奶、豆?jié){、 0.12mol/LpH=4. 7 醋酸- 醋酸鈉緩沖液、乙醇 -乙 醚等體積混合液、濃 H2SO4 、 40%氫氧化鈉、 30%過氧化氫、 2%硼酸溶液、 0. 050molPL 標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液、硫酸鉀 - 硫酸銅接觸劑、混合指示劑、標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液、雙縮 脲試劑、考馬斯亮藍(lán) G- 250 試劑。1.2 實(shí)驗(yàn)方法(1) 凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量將待測(cè)樣品與濃硫酸共熱 ,含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)

4、生氨 (消化) ,氨又與硫酸作用 ,變成硫酸 銨。為了加速消化 ,可以加入 CuSO4 作催化劑和加入 K2SO4 以提高溶液的沸點(diǎn) ,而加入 30%過氧化氫有利于消化溶液的澄清。消化好的樣品在凱氏定氮儀內(nèi)經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分 解放出氨 ,借蒸汽將氨蒸至定量硼酸溶液中 ,然后用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液進(jìn)行滴定 ,記錄 ,計(jì)算出 樣品含氮量。每個(gè)樣品做三次重復(fù)測(cè)定 ,取平均值。(2) 紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)分子中 ,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵,使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì) ,吸收峰在 280nm 處 ,其吸光度 (即光密度值 )與蛋白質(zhì)含量成正比。此外 ,蛋 白質(zhì)溶液在 238nm

5、的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長(zhǎng)下,蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系 ,可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。紫外吸收法簡(jiǎn)便、靈敏、快速 ,不消耗樣品 ,測(cè)定后仍能回收使用。低濃度的鹽 ,例如 , 生化制備中常用的 (NH4)2SO4 等和大多數(shù)緩沖液不干擾測(cè)定 ,特別適用于柱層析洗脫液 的快速連續(xù)檢測(cè) ,因?yàn)榇藭r(shí)只需測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的變化 ,而不需知道其絕對(duì)值。此法的特點(diǎn)是測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差,干擾物質(zhì)較多 ,在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí) ,對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)有一定的誤差,故該法適于用測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶

6、 及核酸等吸收紫外光的物質(zhì) ,會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表 ,再進(jìn)行 計(jì)算的方法加以適當(dāng)?shù)男Ｕ?。但是因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的 ,雖 然經(jīng)過校正 ,測(cè)定的結(jié)果還是存在一定的誤差。此外,進(jìn)行紫外吸收法測(cè)定時(shí) ,由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因 pH 的改變而有變化 ,因此要注意 溶液的 pH 值 ,測(cè)定樣品時(shí)的 pH 要與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的 pH 相一致。取待測(cè)樣品制成蛋白 濃度大約在0. 11. OmgPmL的蛋白質(zhì)溶液，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行比色，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線 得出樣品含氮量。每個(gè)樣品做 3 次重復(fù)測(cè)定 ,取平均值。(3) 雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量雙縮脲(NH3CONHCONH

7、3)是兩個(gè)分子脲經(jīng)180 C左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn) 物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuS04形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè) 酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能夠以一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙 縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測(cè)定蛋白質(zhì)含量。此法的優(yōu)點(diǎn)是測(cè)定較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少；主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)取待測(cè)樣品制成蛋白濃度大約在 110mgPmL的蛋白質(zhì)溶液，加雙縮脲試劑染色30min, 用可見光分光光度計(jì)進(jìn)行比色

8、，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品蛋白質(zhì)含量。每個(gè)樣品做 3次重 復(fù)測(cè)定，取平均值。(4) 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量由于雙縮脲法(Biuret法)存在明顯的缺點(diǎn)和許多限制，因此1976年由Bradford建立的考 馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)，這是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白質(zhì)測(cè) 定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法?！綛radford法的突出優(yōu)點(diǎn)是：a. 靈敏度高。據(jù)估計(jì)，比Lowry法約高4倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá) 1mg。這是因?yàn)榈?白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收

9、值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大得多。b. 測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定 ，只需要5min左右。由于染 料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2min即可完成，其顏色可以在1h內(nèi)保持穩(wěn)定，且在520min之間，顏色的穩(wěn)定性最好，因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí) 間。c. 干擾物質(zhì)少。如干擾 Lowry法的K、N且小獨(dú)離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘 油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測(cè)定法。此法的缺點(diǎn)是a. 由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用丫 -球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋

10、白質(zhì)，以減少這 方面的偏差。b. 仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有去污劑、TritonX- 100、十二烷基 硫酸鈉(SDS)和0. 1N的NaOH。(如同0. 1N的酸干擾Lowry法一樣)。c. 標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定 未知蛋白質(zhì)的濃度?！咳〈郎y(cè)樣品加入考馬斯亮藍(lán)G- 250試劑放置5min后，用可見光分光光度計(jì)比色，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品蛋白質(zhì)含量。每個(gè)樣品做3次重復(fù)測(cè)定，取平均值。2結(jié)果與分析2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1樣品蛋白質(zhì)含量的測(cè)定結(jié)果牛奶酸奶豆?jié){凱氏定氮法3.092.130.81紫外吸收法一2.88雙縮詠法3. 162

11、. 160.91考馬斯亮藍(lán)法3,112. 180.862.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析(1) 凱氏定氮法可測(cè)出全部 3種樣品的蛋白含量，測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確，只是蒸餾與吸收裝置 復(fù)雜，不便于操作，實(shí)驗(yàn)過程所需時(shí)間較長(zhǎng)，操作復(fù)雜。(2) 紫外吸收法無法測(cè)出牛奶、酸奶的蛋白含量，測(cè)出的豆?jié){蛋白含量也與實(shí)際值相差較大，不具實(shí)際使用價(jià)值。此方法實(shí)驗(yàn)過程簡(jiǎn)單，適用于測(cè)試無色樣品，對(duì)于有色樣品需進(jìn)行預(yù)處理，排除顏色干擾后才適用于此方法。(3) 雙縮脲法適用于被測(cè)的3種樣品，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便迅速，但其缺點(diǎn)是靈敏度較低，蛋白質(zhì)量須在120mgPmL時(shí)測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確。因此實(shí)驗(yàn)前要估測(cè)被測(cè)樣品的蛋白含量把樣品稀釋至蛋白濃度為120mgPm

12、L。(4) 考馬斯亮藍(lán)染色法可以測(cè)出被測(cè)的全部 3種樣品，此方法快速、靈敏，但只有作微量蛋 白測(cè)定時(shí)的結(jié)果才準(zhǔn)確，因此在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將樣品稀釋至蛋白濃度為 0. 11mgPmL,而且 實(shí)驗(yàn)必須在1h內(nèi)完成，不然測(cè)試結(jié)果不準(zhǔn)確。(5 )酚試劑法原理：蛋白質(zhì)在堿性溶液中其肽鍵與 Cu2+螯合，形成蛋白質(zhì)一銅復(fù)合 物，此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，在一定條 件下，利用藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)濃度的線性關(guān)系作標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定樣 品中蛋白質(zhì)的濃度。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，樣品中蛋白質(zhì)含 量高于5即可測(cè)得，是測(cè)定蛋白質(zhì)含量應(yīng)用得最廣泛的方法之 一。缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要精確控制操作時(shí)

13、間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直 線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾 lowry 反應(yīng)。而 且對(duì)后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、 tris 緩沖液、 甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（ 0.5%）， 硫酸納（ 1%），硝酸納（ 1%），三氯乙酸（ 0.5%），乙醇（ 5%）， 乙醚（5%），丙酮（ 0.5%）等溶液對(duì)顯色無影響，但這些物質(zhì)濃度 高時(shí)，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉氫氧 化鈉溶液，即可顯色測(cè)定。若樣品酸度較高，顯色后會(huì)色淺，則必 須提高碳酸鈉一氫氧化鈉溶液的濃度 12倍。適用范圍：適用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。此法可檢測(cè)的最低蛋白質(zhì) 量達(dá) 5mg 。通常測(cè)定范圍是 20250mg個(gè)人想法蛋白質(zhì)是我們生活中不可或缺的東西，無論是各種乳制品還是 一些保健產(chǎn)品，蛋白質(zhì)的含量無疑是一個(gè)受人矚目的指標(biāo)。然而，縱觀我們現(xiàn)在使用的這些蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，很明顯 的都有一個(gè)“不適合大規(guī)模檢測(cè)”的特點(diǎn)，這對(duì)于現(xiàn)在的大規(guī)模 生產(chǎn)模式顯然不適用。而且，更為嚴(yán)重的是，所有的檢測(cè)方法 都會(huì)受到許多其它物質(zhì)的干擾作用，之前鬧得沸沸揚(yáng)揚(yáng)的三鹿 奶粉事件就是利用了凱式定氮法中的檢測(cè)漏洞（檢測(cè)時(shí)檢測(cè)的 是氮元素的含量，那么，