Ｓｕｒｖｉｖｉｎ和Ｃａｓｐａｓｅ－３在胃間質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義

1、和在胃間質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義 【摘要】 目的 研究Survivin和Caspase-3在胃間質(zhì)瘤中表達(dá)情況及臨床意義。方法 用免疫組化法檢測(cè)57例胃間質(zhì)瘤和相應(yīng)的56例光鏡下陰性切緣組織及10例正常胃組織的Survivin和Caspase-3的表達(dá)情況，并進(jìn)行相關(guān)的研究。結(jié)果 胃間質(zhì)瘤中Survivin表達(dá)呈核型和核漿型，陽性率為754，胃間質(zhì)瘤的光鏡下陰性切緣組織為36，正常胃組織無表達(dá); 胃間質(zhì)瘤中Caspase-3表達(dá)呈漿型，陽性率為333，胃間質(zhì)瘤的光鏡下陰性切緣組織為821，正常胃組織為 800。結(jié)論 Survivin在胃間質(zhì)瘤中表達(dá)明顯高于正常組織，與核分裂象和危險(xiǎn)度正相關(guān)，可望作為

2、一預(yù)后因素； Caspase-3在胃間質(zhì)瘤中的表達(dá)明顯低于正常組織； Survivin可能通過抑制Caspase-3的表達(dá)，從而抑制胃間質(zhì)瘤的凋亡，這可能在胃間質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起了作用。 【關(guān)鍵詞】 Survivin；Caspase-3；胃間質(zhì)瘤 【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the expression of Survivin and Caspase-3 in Gastric Stromal Tumors(GST) and its significance. Methods Immunohisto

3、chemical technique was used to detect the expression of Survivin and Caspase-3 in 57 cases of Gastric Stromal Tumors, 56 cases of adjacent normal gastric tissues of Gastric Stromal Tumors and 10 cases of normal gastric tissues. Their relationship and significance were investigated. Results The posit

4、ive rates of Survivin and Caspase-3 in Gastric Stromal Tumors were 754 and 333 respectively; whereas in adjacent normal gastric tissues of Gastric Stromal Tumors, the rates were 3.6 and 821%respectively; and in normal gastric tissues the rates were 0 and 80.0% respectively. Conclusions The positive

5、expression rates of Survivin in Gastric Stromal Tumors was higher than normal tissues ; the positive expression rate of Caspase-3 in Gastric Stromal Tumors was lower than normal tissues; the abnormal expression ofSurvivin and Caspase-3 in Gastric Stromal Tumors and their relationship suggested that

6、Survivin could decrease the apoptosis of Gastric Stromal Tumors by depress the expression of Caspase-3,which may play an important role in the onset and development of Gastric Stromal Tumors. 【Key words】 Survivin；Caspase-3；Gastric Stromal Tumors 胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumor,GIST）是當(dāng)今腫瘤界研究的熱點(diǎn)

7、之一。c-kit基因突變?cè)贕IST的發(fā)生發(fā)展中的重要作用已得到公認(rèn)，但是否有其他機(jī)制起作用尚值得研究。所有的GIST都是有惡變潛能的腫瘤，但所有的GIST都對(duì)常規(guī)化療無效，其中的原因也值得探討。 1 材料和方法 11 材料 111 石蠟標(biāo)本 收集廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2002年1月至2006年10月手術(shù)切除的胃間質(zhì)瘤57例(C組)及相應(yīng)的光鏡下陰性切緣組織56例(B組)（1例無正常切緣）的病理蠟塊，另取同期因消化性潰瘍行胃大部切除的正常胃組織10例(A組)的病理蠟塊。胃間質(zhì)瘤病例術(shù)前均未行放療或化療，按NIH分類法1，極低危險(xiǎn)度3例，低危險(xiǎn)度14例，中危險(xiǎn)度19例，高危險(xiǎn)度21例。 112 Sur

8、vivin染色試劑 兔抗人Survivin多克隆抗體工作液（編號(hào) ZA-0458）。PV-9000二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒，試劑盒內(nèi)容：試劑1：3%H2O2去離子水；試劑2：Polymer Helper(即用型)；試劑3：Polyperoxidase-anti-mouse/rabbit IgG（即用型）。均購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。 113 Caspase-3染色試劑 鼠抗人Caspase-3多克隆抗體工作液（編號(hào)PR2285）。即用型SABC免疫組化染色試劑盒：試劑盒內(nèi)容：試劑1：5%BSA封閉液，用于組織切片的封閉。試劑2：二抗，親和純化抗體，標(biāo)記長臂生物素，山羊抗小鼠IgG。試劑

9、3：SABC：鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物。購自武漢博士德生物工程有限公司。 12 方法 取存檔的石蠟塊，連續(xù) 4 m厚度切片。采用二步法檢測(cè)Survivin，SABC法檢測(cè)Caspase-3,均按說明書操作。Survivin的染色用已知陽性染色的胃癌組織切片作陽性對(duì)照，結(jié)果陽性；以 PBS 代替一抗作陰性對(duì)照，結(jié)果陰性。Caspase-3染色用已知的陽性染色扁桃體組織切片作陽性對(duì)照，結(jié)果陽性；PBS 代替一抗作陰性對(duì)照，結(jié)果陰性。 13 結(jié)果判斷 胃間質(zhì)瘤中Survivin呈核型或核漿型，陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)是：胞漿或胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒；Caspase-3呈漿型，陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)是：胞漿出現(xiàn)棕黃

10、色顆粒。對(duì)每張切片隨機(jī)選取并計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野的陽性細(xì)胞百分比：陽性細(xì)胞10為陰性，10為陽性，并且1125為弱陽性（），2650為中等陽性（），50%為強(qiáng)陽性（）。 14 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以SPSS130進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn),率的比較用行×列表的2檢驗(yàn)或確切概率法。 2 結(jié)果 21 Survivin在胃間質(zhì)瘤中的表達(dá)情況 57例胃間質(zhì)瘤中43例陽性，陰性標(biāo)本中，也均有不同程度的陽性表達(dá)，只是陽性細(xì)胞百分比不到10，56例光鏡下陰性切緣組織中，2例陽性，10例正常胃組織中，均為陰性。比較Survivin在胃間質(zhì)瘤、胃間質(zhì)瘤陰性切緣組織和正常胃

11、組織的表達(dá)情況結(jié)果見表1。比較Survivin在不同年齡、性別、腫瘤大小、有無腫瘤囊內(nèi)出血壞死、核分裂象和危險(xiǎn)度的胃間質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，見表2。 22 Caspase-3在胃間質(zhì)瘤中的表達(dá)情況 57例胃間質(zhì)瘤中，19例Caspase-3陽性，56例胃間質(zhì)瘤的光鏡下陰性切緣組織中，46例陽性，10例正常胃組織中，8例陽性。比較在胃間質(zhì)瘤、胃間質(zhì)瘤的陰性切緣組織和正常胃組織的表達(dá)情況結(jié)果見表3。比較Caspase-3在不同年齡、性別、腫瘤大小、有無腫瘤囊內(nèi)出血壞死、核分裂象和危險(xiǎn)度的胃間質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，見表4。 23 Survivin 和Caspase-3在胃間質(zhì)瘤中的表達(dá)關(guān)系 用SPSS130

12、對(duì)Survivin 和Caspase-3的陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行Spearman秩相關(guān)分析，得r-0523，P=0000，示Survivin 和Caspase-3的陽性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。 3 討論 31 Survivin在胃間質(zhì)瘤中的表達(dá)特點(diǎn)及意義 細(xì)胞凋亡是機(jī)體重要的生理過程,對(duì)維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有至關(guān)重要的意義,細(xì)胞凋亡嚴(yán)重失衡對(duì)機(jī)體具有破壞性影響。近年來新發(fā)現(xiàn)的一類細(xì)胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)廣泛存在于許多物種中,其特殊的分子結(jié)構(gòu)及抑制細(xì)胞凋亡的功能,與腫瘤的發(fā)病密切相關(guān)。 IAP是一組高度保守的含有23個(gè)半胱氨酸/組氨酸的桿狀病毒IA

13、P重復(fù)序列(baculoviral IAP repeats, BIRs)的家族，能夠調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物以及果蠅的細(xì)胞凋亡。含有BIR1功能區(qū)的蛋白通過抑制有絲分裂紡錘體的延伸而阻斷細(xì)胞中有絲分裂中期進(jìn)入有絲分裂后期2。含有BIR2功能區(qū)的蛋白則具有與Caspase結(jié)合并抑制其活性的作用3。 Survivin是新近被克隆出的IAP分子,因其既具有與IAP其他分子的同源序列,同時(shí)又表現(xiàn)出獨(dú)特的生物學(xué)特性,正成為腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。 已有研究顯示,絕大多數(shù)惡性腫瘤組織存在Survivin表達(dá)，不同惡性腫瘤組織Survivin表達(dá)陽性率不同,有報(bào)道認(rèn)為胃癌為482%, 結(jié)直腸癌為635%,間皮瘤

14、為100%4-6。 本研究顯示，Survivin在胃間質(zhì)瘤有較高的陽性表達(dá)率（754），與胃間質(zhì)瘤的光鏡下陰性切緣組織（357%）和正常胃組織（無表達(dá)）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與文獻(xiàn)報(bào)道的在其他腫瘤中的情況基本相符，但其陽性率比胃癌高，是否提示胃間質(zhì)瘤比胃癌的惡性程度更高，有待進(jìn)一步研究；但從另一方面驗(yàn)證所有胃間質(zhì)瘤都是有惡變潛能的理論。值得注意的是，本研究胃間質(zhì)瘤的陰性切緣組織有2例陽性，而不論文獻(xiàn)還是本實(shí)驗(yàn)都證實(shí)正常組織Survivin是陰性的，似乎可從兩方面解釋：光鏡下的陰性切緣組織不一定是真正的胃間質(zhì)瘤陰性，如果是這樣，那就提示在行胃間質(zhì)瘤手術(shù)時(shí)，不要只滿足于腫瘤的切除，即在不損害重要器

15、官功能的前提下，是否應(yīng)適當(dāng)?shù)財(cái)U(kuò)大切除范圍；另一個(gè)解釋就是胃間質(zhì)瘤的發(fā)病是一個(gè)漸進(jìn)的過程，該組織處于胃間質(zhì)瘤前的病變階段，也在向胃間質(zhì)瘤發(fā)展，這也同樣提示在臨床上應(yīng)適當(dāng)?shù)財(cái)U(kuò)大切除范圍。 進(jìn)一步比較Survivin的陽性表達(dá)與不同性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤有無壞死等臨床病理因素的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)差別并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在危險(xiǎn)度方面，單從陽性表達(dá)方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005），但將極低、低、中、高危險(xiǎn)度分別記為1、2、3、4分，與Survivin的陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行Spearman秩相關(guān)分析，得r0276，P=0038005，說明Survivin的陽性細(xì)胞百分比與胃間質(zhì)瘤的危險(xiǎn)度呈正相關(guān)。在核分裂象

16、方面，也得到與危險(xiǎn)度類似的結(jié)果，從陰陽性表達(dá)方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005），但將核分裂象數(shù)據(jù)與Survivin的陽性細(xì)胞百分比作Spearman秩相關(guān)分析，得r0366，P=0005005，說明Survivin的陽性細(xì)胞百分比與胃間質(zhì)瘤的核分裂象成正相關(guān)。陽性細(xì)胞百分比是原始數(shù)據(jù)，更加可靠，所以應(yīng)認(rèn)為Survivin的陽性表達(dá)與胃間質(zhì)瘤的危險(xiǎn)度和核分裂象均有正相關(guān)。表明Survivin可作為判斷腫瘤生物學(xué)特性和預(yù)后的一個(gè)參考指標(biāo)。這也說明在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理時(shí)，盡量要用原始數(shù)據(jù)，而不要作太多的轉(zhuǎn)換。 關(guān)于Survivin的細(xì)胞定位，文獻(xiàn)報(bào)道差別較大。有研究認(rèn)為7-8對(duì)Survivin的前體m

17、RNA選擇性剪切可產(chǎn)生兩個(gè)不同的變異體。一個(gè)是系列中缺少外顯子3的Survivin-EX3,可表達(dá)137個(gè)氨基酸的Survivin蛋白，仍保留抗凋亡特性；另一個(gè)保留內(nèi)含子2作為外顯子的Survivin-2B, 表達(dá)165個(gè)氨基酸的Survivin蛋白，抗凋亡功能明顯下降。兩者氨基酸系列和數(shù)量的改變可導(dǎo)致相應(yīng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，包括BIR結(jié)構(gòu)的改變，從而具有不同的生物學(xué)效應(yīng)。Survivin-2B主要定位于胞質(zhì)，而Survivin-EX3主要定位于細(xì)胞核。這些都提示Survivin的變異體在不同的亞細(xì)胞定位及不同的細(xì)胞周期發(fā)揮不同的作用。本試驗(yàn)中，Survivin在胃間質(zhì)瘤的表達(dá)35例核型，22例

18、呈核漿性，無漿型；而Survivin在胃癌和大腸癌陽性表達(dá)多為漿型。 Kennedy SM等9在研究Survivin在乳腺癌中的表達(dá)情況時(shí)認(rèn)為，核型表達(dá)有較好的預(yù)后，Survivin在胃癌和大腸癌陽性表達(dá)多為漿型，是否提示胃間質(zhì)瘤的預(yù)后較胃腸道癌腫好，有待進(jìn)一步研究。 Survivin正成為腫瘤靶向分子治療的一個(gè)研究熱點(diǎn)，雖然伊馬替尼作為胃間質(zhì)瘤的靶向治療藥物被廣泛應(yīng)用并療效確切，但伊馬替尼只能控制而不能根治胃間質(zhì)瘤,仍有近一半的病例無法達(dá)到部分緩解的治療效果10-11，即使有效的病例也開始發(fā)現(xiàn)繼發(fā)耐藥現(xiàn)象。Survivin可否作為胃間質(zhì)瘤靶向治療的一個(gè)選擇點(diǎn)，也值得進(jìn)一步研究。 32 Caspase-3在胃間質(zhì)瘤中的表達(dá)特點(diǎn)及意義 Caspase家族屬于半胱氨酸基天冬氨酸基特異性蛋白酶。正常情況下，胞質(zhì)內(nèi)Caspase-3以無活性的酶原形式存在，只有當(dāng)細(xì)胞凋亡時(shí)才被激活為有活性的Caspase-3。Caspase-3處于細(xì)胞凋亡的下游，經(jīng)典的細(xì)胞凋亡途徑有兩條，分別是細(xì)胞外途徑(細(xì)胞表面死亡受體途徑)和細(xì)胞內(nèi)途徑(線粒體引發(fā)途徑)，但最終都要通過Caspase-3的激活起作用。 本研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-3在胃間質(zhì)瘤中陽性表達(dá)率（