藻藍(lán)蛋白對(duì)2型糖尿病大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)iNOS表達(dá)影響

1、藻藍(lán)蛋白對(duì)2型糖尿病大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)iNOS表達(dá)影響 作者：沈衛(wèi) 馬璇 劉琳 張蕊 劉吉東【摘要】 目的 研究藻藍(lán)蛋白對(duì)2型糖尿病大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)的影響,探討可能的作用機(jī)制。方法 健康雄性Wistar大鼠32只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選擇8只為正常組(A組)，其余24只應(yīng)用高脂a高糖飼料喂養(yǎng)4周，聯(lián)合30 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射方法建立2型糖尿病大鼠模型，造模成功后，將其隨機(jī)分為模型組(B組)、藻藍(lán)蛋白治療組(C組)及二甲雙胍治療組(D組)，各8只，C、D組分別用藻藍(lán)蛋白及二甲雙胍灌胃治療10 d，生化方法測(cè)定各組大鼠空腹血糖，組織病理學(xué)技術(shù)觀

2、察各組大鼠心肌細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，免疫組化技術(shù)檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)iNOS的表達(dá)。結(jié)果 造模成功后，B、C、D組空腹血糖與A組相比明顯升高(F=17.54,q=7.738.72,P<0.01);治療后C、D組大鼠空腹血糖較B組明顯降低，差異有顯著性(F=21.79,q=4.16、7.03,P<0.01); C、D組大鼠心肌細(xì)胞的病理形態(tài)及結(jié)構(gòu)較B組有較大改善;C、D組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)iNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與B組相比明顯減少(F=180.30,q=18.88、24.40，P<0.01)，而C組與D組大鼠心肌細(xì)胞iNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較差異無(wú)顯著性(P&gt

3、;0.05)。結(jié)論 藻藍(lán)蛋白可降低糖尿病大鼠空腹血糖水平，改善心肌細(xì)胞損傷，并抑制糖尿病大鼠心肌細(xì)胞iNOS表達(dá)，其作用可能通過(guò)抗氧化機(jī)制，保護(hù)糖尿病狀態(tài)下的心肌細(xì)胞。 【關(guān)鍵詞】 藻藍(lán)蛋白;糖尿病,2型;一氧化氮合酶;肌細(xì)胞,心臟;大鼠,WistarABSTRACT Objective To investigate the effect of phycocyanin on the cellular structure and the expression of inducible nitic oxide synthase (iNOS) in myocardial cells in rats

4、with type 2 diabetes mellitus. Methods Thirtytwo healthy male Wistar rats were adaptively fed for one week and eight of them were then randomly selected to serve as normal control group (A), the rest were fed with highfat and highglucose forage for four weeks by combination of intraperitoneal inject

5、ion of (30 mg/kg) streptozotocin (STZ) to create a model of type 2 diabetes in rats. Upon completion of the models, the 24 rats were evenly randomized to diabetesmodel group (B), phycocyanin group (C) and metformin group (D). Intragastric phycocyanin was offered to group C, and metformin to group D,

6、 respectively, for 10 days. The fasting blood glucose (FBG) was determined by biochemical assay, the morphosis of cardiac myocytes observed by histopathological technique, and the expression of iNOS within cardiac myocytes detected immunohistochemically. Results After creation of the model, FBG of g

7、roups B, C and D was significantly higher than that of group A (F=17.54;q=7.73,8.54, 8.72;P<0.01); Posttherapeutically, the FBG of groups C and D was obviously lower than that of group B (F=21.79;q=4.16,7.03;P<0.01); Morphologically, the cardiac myocytes of rats in groups C and D much

8、improved than those in group B. Compared with group B, the expression of iNOS in groups C and D was weaker (F=180.30;q=18.88,24.40;P<0.01), but the difference of that between the groups C and D was not significant. Conclusion Phycocyanin can lower the FBG, improve the pathologic damage of car

9、diac myocytes, and inhibit the expression of iNOS in diabetic rats, the action in which might be through antioxidation to protect cardiac myocytes under the status of diabetes.KEY WORDS phycocyanin; diabetes mellitus, type 2; nitric oxide synthase; myocytes, cardiac; rats, Wistar機(jī)體在正常情況下，一氧化氮(NO)作為一

10、種細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在調(diào)節(jié)神經(jīng)、心血管、肺和免疫系統(tǒng)的生理功能中發(fā)揮作用。而在致炎因子刺激下，細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)迅速表達(dá)并產(chǎn)生大量的NO，引起DNA損傷及線粒體呼吸抑制等。此外，多重聯(lián)級(jí)信號(hào)被活化，形成炎癥聯(lián)級(jí)瀑布反應(yīng)，促進(jìn)炎癥發(fā)展。NO最先是在對(duì)血管內(nèi)皮的研究中發(fā)現(xiàn)的，心血管是NO作用的靶器官，越來(lái)越多研究表明，心血管疾病包括動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血、充血性心力衰竭等，都與iNOS表達(dá)過(guò)量NO緊密相關(guān),而糖尿病伴隨的高糖血癥、高脂血癥、高胰島素血癥可使氧自由基增多、機(jī)體氧化能力增強(qiáng)，直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞1。藻藍(lán)蛋白作為深海藻類的提取物，安全無(wú)毒，其獨(dú)特的藥用作用目

11、前已引起國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注，尤其是其在抗腫瘤等方面的研究已有一定程度的突破，但是其對(duì)糖尿病個(gè)體的影響迄今鮮有研究。新近研究結(jié)果表明，藻藍(lán)蛋白具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗輻射及提高機(jī)體免疫力等作用2。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)觀察藻藍(lán)蛋白對(duì)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)iNOS表達(dá)的影響，探討其對(duì)2型糖尿病大鼠心肌的保護(hù)作用。1 材料與方法1.1 動(dòng)物來(lái)源健康雄性Wistar大鼠32只，鼠齡1個(gè)月，體質(zhì)量130150 g，由青島市藥檢所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(SCXK(魯)20030010)。實(shí)驗(yàn)前置于實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境1周，自由飲食，室溫(23±2)，自然光照，相對(duì)濕度50%70%。隨機(jī)分為正常對(duì)照組(A組)8只、模型

12、組24只。A組大鼠喂以普通飼料，其余以高糖高脂飼料飼養(yǎng)34。1.2 材料與試劑藻藍(lán)蛋白粉劑(藻藍(lán)蛋白由中國(guó)科學(xué)院海洋研究所提供)暗室分裝后-20 保存，用前加蒸餾水稀釋至濃度為100 g/L的混懸液。兔抗鼠iNOS親和純化抗體、即用型SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒均由武漢博士德生物公司提供。1.3 動(dòng)物模型的建立模型組大鼠飼養(yǎng)4周后禁食12 h，以30 mg/kg劑量一次性腹腔注射100 g/L鏈脲佐菌素(STZ)檸檬酸緩沖液(以pH 4.2的0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液配制)，A組大鼠同步注射等量檸檬酸緩沖液。模型組注射1周后剪尾取血，測(cè)空腹血糖(FBG)，以血糖值7.0 mmol/L為

13、糖尿病模型建立成功。將24只造模成功大鼠隨機(jī)分為B、C、D組，每組8只。1.4 干預(yù)措施糖尿病大鼠模型造模成功后(實(shí)驗(yàn)第9周)開(kāi)始進(jìn)行干預(yù)治療。C組按500 mg/kg體質(zhì)量灌胃給予100 g/L藻藍(lán)蛋白混懸液,每天1次，連續(xù)10 d;D組同步給予二甲雙胍(400 mg/kg)，以蒸餾水稀釋至80 g/L濃度連續(xù)灌胃10 d;A組和B組同步給予等體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃10 d。1.5 FBG的測(cè)定在第1、8及第10周末于大鼠禁食12 h后，次日早鼠尾靜脈取血，用血糖儀(強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司，穩(wěn)豪型)測(cè)定FBG的水平。1.6 組織病理學(xué)觀察治療結(jié)束后，引頸處死大鼠，迅速取出心臟，用4 生理鹽水

14、沖洗干凈，40 g/L甲醛固定24 h，蒸餾水浸泡4 h。常規(guī)梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，LEICA 2135石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，厚度5 m，裱于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，使用蘇木精伊紅(HE)染色法染色后觀察。1.7 免疫組化染色取上述切片常規(guī)脫蠟，水化組織切片, 體積分?jǐn)?shù)0.03的過(guò)氧化氫溶液室溫下作用10 min;蒸餾水洗1 min，共3次;切片置于0.01 mol/L的枸櫞酸緩沖液中，微波加熱至沸騰，斷電15 min，再次加熱沸騰后自然冷卻;加0.02 mol/L的PBS洗1 min，共3次;加50 g/L的BSA抗原室溫下封閉20 min;滴加一抗(1100)稀釋，37

15、孵育1 h;0.02 mol/L的PBS 洗2 min，共3次;滴加生物素化二抗，37 孵育20 min;0.02 mol/L的PBS洗2 min，共3次;滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素，37 孵育20 min;0.02 mol/L的PBS洗5 min，共4次;DAB顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間;蘇木紫復(fù)染10 s，自來(lái)水沖洗;脫水、透明、中性樹(shù)脂封片，光鏡下觀察，特異性染色為片狀棕黃色粗顆粒。部分切片不加一抗以0.1 mol/L的PBS替代染色，做陰性對(duì)照。光學(xué)顯微鏡(400倍)下，每張切片隨機(jī)選取4個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)100個(gè)心肌細(xì)胞中iNOS的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以各組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行比較。

16、1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以SPSS 11.5及PPMS 1.55統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理。2 結(jié) 果2.1 一般情況觀察第8周B、C、D組大鼠體質(zhì)量較A組明顯降低(F=28.41,q=9.9111.02,P<0.01)。而第10周C組大鼠體質(zhì)量較B組顯著增加(F=49.16,q=2.91,P<0.05)，D、B組大鼠體質(zhì)量比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。2.2 各組FBG比較第8周B、C、D組大鼠空腹血糖與A組比較明顯升高(F=17.54,q=7.73、8.54、8.72,P<0.01)。第10周C、D組大鼠空腹血糖與B組比較差異有顯

17、著性(F=21.79,q=4.16、7.03,P<0.01)，C、D組大鼠空腹血糖差異無(wú)顯著性(P>0.05)。見(jiàn)表2。表1 各組大鼠體質(zhì)量的變化表2 各組大鼠空腹血糖比較2.3 病理形態(tài)學(xué)觀察A組大鼠心肌纖維走行正常，心肌細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，居細(xì)胞中央，間質(zhì)及微血管結(jié)構(gòu)正常。B組大鼠心肌纖維縱橫紋模糊，心肌纖維肥大、斷裂、溶解，有顆粒及脂肪變性。C、D組大鼠心肌纖維縱橫紋清晰，排列整齊，心肌纖維間質(zhì)可見(jiàn)少量的纖維細(xì)胞增生，心肌纖維輕度肥大。2.4 心肌細(xì)胞中iNOS的表達(dá)A、B、C、D組心肌組織中iNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為3.50±2.38、31.00&

18、#177;2.45、14.75±2.50及10.00±1.63， B組大鼠心肌內(nèi)iNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于A組(F=180.30,q=31.96，P<0.01)，C、D組大鼠心肌內(nèi)iNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯低于B組(q=18.88、24.40，P<0.01)，但高于A組(q=14.12、8.16，P<0.01)。3 討 論研究表明，STZ誘發(fā)的糖尿病大鼠心肌組織中的NO及NOS隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和病變的發(fā)展逐步升高，心肌組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變也逐步加重6，提示NOS的異常激活與NO的過(guò)度增高參與了糖尿病心肌病變的形成。糖尿病狀態(tài)下存在心肌肥

19、厚或高灌注狀態(tài)，心肌局部NO合成增加可能參與了糖尿病心肌肥厚或高灌注的發(fā)病機(jī)制。另有研究顯示，從心肌間密集血管的內(nèi)皮所釋放的NO對(duì)心肌細(xì)胞有明顯的負(fù)性肌力作用7。因此，推論糖尿病心肌病可能與心臟組織中NOS活性上調(diào)、NO合成增加有關(guān)。BING8提出，心肌細(xì)胞凋亡是心肌由慢性壓力負(fù)荷走向衰竭的一種必然結(jié)果，而NO是糖尿病心肌病變重要的致病及致細(xì)胞凋亡因子。因此，減少NO的過(guò)量產(chǎn)生，從根本上抑制細(xì)胞凋亡，可以控制心肌細(xì)胞衰竭，緩解體內(nèi)氧化、過(guò)氧化和脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，改善糖尿病心肌功能。本研究病理結(jié)果顯示，糖尿病大鼠心肌纖維肥大、斷裂、溶解，心肌細(xì)胞局灶性顆粒變性、空泡樣變，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌毛細(xì)血管官

20、腔狹窄，管壁增厚。而C、D組大鼠心肌病變較輕，心肌毛細(xì)血管管壁稍增厚，心肌細(xì)胞改善明顯，表明C、D組大鼠的糖尿病心肌病變有所緩解。免疫組化結(jié)果顯示，正常大鼠心肌細(xì)胞iNOS表達(dá)微弱，B組大鼠心肌內(nèi)iNOS表達(dá)的陽(yáng)性率明顯升高，其結(jié)果與其他相關(guān)研究結(jié)論一致，而C組iNOS表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比B組明顯降低，佐證了NO所致的損傷作用參與糖尿病性心肌病變的形成。結(jié)合二甲雙胍已證實(shí)的抗氧化作用，說(shuō)明藻藍(lán)蛋白有抑制iNOS表達(dá)，起到抗氧化進(jìn)而延緩糖尿病心肌病變的作用;同時(shí)C、D組血糖值與B組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示藻藍(lán)蛋白可能具有降低血糖，抑制iNOS產(chǎn)生進(jìn)而保護(hù)心肌的作用?？傊?，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藻藍(lán)蛋白可降

21、低糖尿病大鼠FBG，改善心肌細(xì)胞的病理?yè)p傷，并抑制糖尿病大鼠心肌細(xì)胞中iNOS表達(dá)，其作用可能通過(guò)抗氧化機(jī)制，保護(hù)糖尿病狀態(tài)下的心肌細(xì)胞，該研究為藻藍(lán)蛋白治療糖尿病及其并發(fā)癥提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。【參考文獻(xiàn)】 1高偉,陳作元,王修衛(wèi),等. RAS阻斷劑對(duì)糖尿病大鼠早期動(dòng)脈粥樣硬化形成影響J. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2009,45(4):355358.2BANISADR F, TEISSIERE F, CURIE I, et al. Antiinfection prophylaxis after sexual assault. Experience of the raymond poincarecarches hospitalJ. Presse Med, 2001,30(6):253258.3郭嘯華,劉志紅,李恒,等.