結(jié)核分枝桿菌Rv2450c基因的克隆和原核表達(dá)

1、結(jié)核分枝桿菌Rv2450c基因的克隆和原核表達(dá)作者：李立青，蘇明權(quán)，李立文，郝曉柯 【關(guān)鍵詞】 分枝桿菌 Cloning and prokaryotic expression of Mycobacterium tuberculosis Rv2450c gene【Abstract】 AIM: To explore whether the Mycobacterium tuberculosis Rv2450c gene can promote its own resuscitation and growth. METHODS: Mycobacterium tuberculosis was cultu

2、red and genome DNA was extracted. Rv2450c gene was obtained by PCR using specific primers, cloned into BamH and EcoR site of pGEX4T2 expression vector and confirmed by sequencing. After the recombinant expression vector being transformed into E.coli BL21（DE3）, the recombinant bacteria were induced a

3、t 30 for 5 h and the fusion protein GSTRv2450c was analyzed by SDSPAGE. RESULTS: DNA sequencing results showed that the Rv2450c gene amplified was exactly consistent with the sequence reported in GenBank and the SDSPAGE analysis demonstrated that the Rv2450c was expressed in E.coli BL21（DE3）. The pr

4、otein band amounted to 22.9% of total bacteria proteinCONCLUSION: Mycobacterium tuberculosis Rv2450c gene is successfully cloned and expressed in E.coli BL21（DE3）.【Keywords】 Mycobacterium tuberculosis; resuscitationpromoting factor; cloning, molecular; gene expression【摘要】 目的： 研究結(jié)核分枝桿菌Rv2450c基因是否能促進其

5、復(fù)活和生長. 方法： 培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌，提取其基因組，PCR擴增出Rv2450c基因，克隆入pSP73載體，測序分析. 將該目的基因亞克隆入pGEX4T2表達(dá)載體，測序證實正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），30用IPTG誘導(dǎo)5 h然后進行SDSPAGE分析. 結(jié)果： 測序結(jié)果證實獲得了Rv2450c基因，其序列與GenBank中報道完全一致. SDSPAGE分析表明，Rv2450c基因在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)了重組蛋白，表達(dá)的蛋白量約占菌體蛋白的22.9%. 結(jié)論： 成功克隆了結(jié)核分枝桿菌Rv2450c基因，并在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá).【關(guān)鍵詞】 分枝桿菌，結(jié)核；促進復(fù)活因子；

6、克隆，分子；基因表達(dá)0引言目前世界人口的三分之一被結(jié)核分枝桿菌感染，其中大部分為潛伏性感染，當(dāng)機體抵抗力下降時，休眠的結(jié)核分枝桿菌即活化，引發(fā)結(jié)核病. 在這個過程中結(jié)核分枝桿菌分泌的促進復(fù)活因子（resuscitationpromoting factor, RPF）起了重要作用，但其具體機制還不清楚1，2. 結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因序列中Rv0867, Rv1009, Rv1884c, Rv2389c和Rv2450c基因均編碼RPF樣蛋白，它們同源性很高，是Mr約為16 000的分泌蛋白. 我們克隆表達(dá)了Rv2450c基因，為進一步研究其活性奠定了基礎(chǔ). 1材料和方法1.1材料大腸桿菌TOP

7、10，BL21（DE3）為第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院檢驗科保存；原核表達(dá)載體pGEX4T2購自Pharmacia公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自Sigma公司；克隆載體pSP73、膠回收試劑盒購自Promega公司；BamH, EcoR等限制性內(nèi)切酶和Pyrobest DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、IPTG等購自Takara公司.1.2方法1.2.1PCR引物設(shè)計根據(jù)GenBank中結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組核酸序列（登錄號： NC_000962），設(shè)計引物，上游引物為 5GAA AGG ATC CAC GAT GAA GAA CGC CCG TAC3，下游引物為 5TTT GAA TTC TTT T

8、GC GTC TTT TCG CGG TGG TCA G3，在上、下游引物 5端分別引入BamH和EcoR酶切位點和3個保護堿基，以便于酶切和克隆，引物由上海生工生物工程有限公司合成.1.2.2結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA的提取刮取適量H37Rv菌落，TE（pH 8.0）洗滌后重懸，加SDS至終濃度10 g/L，蛋白酶K至終濃度0.1 g/L, 5560水浴過夜，分別用等體積酚氯仿異戊醇（25241）、氯仿：異戊醇（241）各抽提1次，上層水相加2.5倍預(yù)冷的無水乙醇和1/10體積3 mol/L乙酸鈉后置-20冰浴1 h沉淀DNA，用無水乙醇、700 mL/L乙醇先后洗滌沉淀2次，抽干后

9、溶于適量ddH2O中.1.2.3Rv2450c基因擴增及克隆和鑒定以H37Rv基因組DNA為模板用Pyrobest DNA聚合酶進行熱啟動PCR，循環(huán)參數(shù)為94變性60 s，55退火60 s，72延伸60 s，30個循環(huán)后再72延伸10 min. 12 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察分析擴增結(jié)果，切膠、用膠回收試劑盒純化DNA，進行BamH和EcoR雙酶切后，用T4連接酶連接，插入pSP73克隆載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TOP10，挑取生長狀態(tài)良好的菌落接種含100 mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，次日提取質(zhì)粒DNA，用BamH和EcoR進行雙酶切鑒定，將獲得的陽性克隆送上海生工生物工程有限公司進行測

10、序，得到的正確重組質(zhì)粒命名為pSP73Rv2450c.1.2.4Rv2450c基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定將質(zhì)粒pSP73Rv2450c用BamH和EcoR進行雙酶切，所獲得的片斷亞克隆到經(jīng)同樣雙酶切的載體pGEX4T2中，得到的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)氨芐青霉素篩選，陽性克隆送上海生工生物工程有限公司進行測序，正確的重組質(zhì)粒命名為pGEX4T2Rv2450c.1.2.5GSTRv2450c融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將含正確重組質(zhì)粒pGEX4T2Rv2450c的大腸桿菌BL21（DE3）37過夜增菌，次日取適量菌液用含100 mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基進行1100稀釋，

11、37, 220 r/min的條件下培養(yǎng). 以不同的溫度，不同的誘導(dǎo)前菌濃度（A600 nm0.1, 0.3, 0.6, 0.8, 1.0），不同的IPTG終濃度（0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.8, 1.0 mmol/L）和不同的時間（3, 4, 5, 6 h）誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá). 在4, 5000 g條件下離心集菌，將上清、沉淀和菌體分別行120 g/L SDSPAGE. 電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)R250染液染色，在脫色液中脫色2 h后觀察分析結(jié)果.2結(jié)果2.1Rv2450c基因序列的獲得與鑒定經(jīng)熱啟動PCR獲得一條約為562 bp大小的特異性條帶，與預(yù)期目標(biāo)片段大小相等（Fig

12、1）.2.2pGEX4T2Rv2450c的雙酶切鑒定及測序酶切后瓊脂糖凝膠電泳顯示出現(xiàn)了4960 bp的載體片段和約562 bp的目的基因片段，測序后證實其序列與GenBank中所給序列完全相同（Fig 2）.2.3pGEX4T2Rv2450c的誘導(dǎo)表達(dá)將鑒定正確的陽性克隆株在不同條件下進行誘導(dǎo)表達(dá)，120 g/L SDSPAGE分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)Mr約44 000的外源蛋白，與預(yù)期大小一致. 在30, A600 nm值為0.6, IPTG終濃度為0.3 mmol/L、誘導(dǎo)表達(dá)5 h后融合蛋白表達(dá)量較高，占菌體蛋白的22.9%，同時發(fā)現(xiàn)融合蛋白以可溶性蛋白和包涵體兩種形式存在（Fig

13、3）.3討論結(jié)核分枝桿菌的5個RPF基因分散在整個基因組中，對刺激靜息期細(xì)菌生長起重要作用，因此推測對宿主體內(nèi)潛伏的結(jié)核分枝桿菌的復(fù)活起促進作用. 分別敲除結(jié)核分枝桿菌基因組中的某一個RPF基因時，其生長并沒受到明顯影響，說明這一蛋白家族的功能有一定重疊，不是結(jié)核分枝桿菌生長所必需的，但從對數(shù)生長期到停滯期它們的表達(dá)模式不同，在特定的感染期每個RPF基因的功能也不相同1，3. Rv2450c是唯一可被15 min酸沖擊（acid shock）誘導(dǎo)的RPF基因，在它編碼序列的氨基端有一個富含脯氨酸的區(qū)，使它成為免疫學(xué)上重要的分泌型抗原，可強烈刺激機體產(chǎn)生抗體及發(fā)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)4，5，研究意義重

14、大，而國內(nèi)RPF樣蛋白的研究報道極少.我們的研究擴增了結(jié)核分枝桿菌Rv2450c基因全長序列，并將其克隆入原核表達(dá)載體pGEX4T2. 表達(dá)載體pGEX4T2是GST融合表達(dá)載體，它含有強啟動子tac及l(fā)ac操縱基因、SD序列及l(fā)ac阻遏蛋白基因等，是一種較為高效的蛋白表達(dá)載體. 而且在表達(dá)載體pGEX4T2 GST的下游有編碼凝血酶識別位點的序列，高效表達(dá)的外源蛋白可用GSTrap FF親和層析純化，用凝血酶水解回收外源蛋白. 我們用IPTG誘導(dǎo)，在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)融合基因GSTRv2450c，SDSPAGE電泳顯示，在裝有外源基因表達(dá)載體的大腸桿菌中，出現(xiàn)了特異的Mr約44

15、 000的融合蛋白，而GST處的蛋白質(zhì)條帶消失，僅含空載體的大腸桿菌在Mr 26 000處有GST蛋白的表達(dá)，證明了GSTRv2450c融合基因的表達(dá).原核表達(dá)中，重組蛋白常常以包涵體的形式表達(dá)，對包涵體進行變性、復(fù)性處理不僅操作繁瑣，而且重組蛋白的活性也往往受到影響. 我們將誘導(dǎo)表達(dá)后的大腸桿菌超聲裂解后，分別取上清、沉淀和菌體做SDSPAGE電泳，發(fā)現(xiàn)表達(dá)的蛋白以可溶性和包涵體兩種形式存在，凝膠掃描分析確定表達(dá)的目的蛋白量占菌體蛋白的22.9%，因此我們獲得了GSTRv2450c融合蛋白的高效表達(dá)，這與我們選用了最佳的表達(dá)載體和宿主菌及反復(fù)優(yōu)化表達(dá)條件是分不開的，其可溶性蛋白為我們下一步大

16、量純化表達(dá)產(chǎn)物，分析其活性，進而深入研究Rv2450c蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ).【參考文獻】1 Tufariello JM, Jacobs WR Jr, Chan J. Individual Mycobacterium tuberculosis resuscitationpromoting factor homologues are dispensable for growth in vitro and in vivo J. Infect Immun, 2004;72（1）:515-526.2 蘇明權(quán)，李立文，張彩蓮，等. 結(jié)核分枝桿菌Rv1009的生物信息學(xué)分析及克隆、表達(dá)J. 生物技術(shù)通

17、訊，2003；14（6）：557-559.Su MQ, Li LW, Zhang CL, et al. Bioinformatic analysis，clonging and expression of Rv1009 of Mycobacterium tuberculosis J. Lett in Biotechnol, 2003;14（6）:557-559.3 Mukamolova GV, Kaprelyants AS, Young DI, et al. A bacterial cytokine J. Proc Natl Acad Sci, 1998;95:8916-8921.4 Manca C, Lyashchenko K, Colangeli R, et al. MTC28, a novel 28kilodalton prolinerich secreted antigen specific for the Mycobacterium tuberculosis complex