腸桿菌檢驗(yàn)程序

1、腸桿菌科【器材】一、 SS 平板培養(yǎng)基：選擇性培養(yǎng)基，有促進(jìn)目的菌生長(zhǎng)的物質(zhì)和鑒別用指示劑.1、煌綠、膽鹽、硫代硫酸鈉、枸櫞酸鈉等能抑制2、大腸分解乳糖產(chǎn)酸：中性紅（6.8 紅 8.0G+ 菌及大多數(shù)大腸生長(zhǎng)，膽鹽促進(jìn)傷寒生長(zhǎng)。黃）變紅，與膽鹽結(jié)合合成膽酸，因而形成中心混濁的深紅色菌落，病原菌不分解乳糖，故菌落呈透明微黃色。3、枸櫞酸鐵能指示硫化氫產(chǎn)生，硫化鐵呈黑色4、硫代硫酸鈉有緩和膽鹽對(duì)志賀、沙門菌的毒害作用，并中和煌綠、中性紅染料的毒性，使大腸紅色鮮明二、 KIA 斜面培養(yǎng)基： 用酚紅作指示劑（ 6.8 黃 8.4 紅）。上層為固體瓊脂斜面，含乳糖。下層為半固體瓊脂，含葡萄糖，含硫酸亞鐵

2、。1、細(xì)菌如能發(fā)酵乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則斜面及底層均呈黃色，且有氣泡。非致病菌（如大腸埃希菌）一般既可利用乳糖也可利用葡萄糖，但肺克也是如此。2、如細(xì)菌只發(fā)酵葡萄糖不發(fā)酵乳糖，因 葡 :乳為 1:10，斜面所產(chǎn)生的少量的酸可因接觸空氣而氧化揮發(fā)，從而使斜面部分保持原來(lái)的紅色；底層則是在相對(duì)缺氧的狀態(tài)下，所生成的酸不被氧化揮發(fā)而保持黃色。致病菌一般不能利用乳糖，可用于區(qū)別致病/非致病菌。3、如細(xì)菌分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生硫化氫，則與硫酸亞鐵反應(yīng)生成硫化亞鐵（黑色沉淀物），使培養(yǎng)基變黑。左：不發(fā)酵乳糖，強(qiáng)產(chǎn)硫化氫。中：不發(fā)酵乳糖，不產(chǎn)硫化氫。右：發(fā)酵乳糖，不產(chǎn)硫化氫4、接種方法：先穿刺到底，再在斜面劃線。

3、【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】一、氧化酶試驗(yàn)原理：見奈瑟菌屬部分操作：取氧化酶紙片，刮去KIA或普通平板或普通平板上的較大菌落，觀察紙片顏色的變化，呈藍(lán)紫色為陽(yáng)性， 不變?yōu)殛幮?（如試劑為鹽酸二甲基對(duì)苯二胺，陽(yáng)性者則為紅色） 。腸桿菌科多為陽(yáng)性（但變形桿菌為陰性） 。注意事項(xiàng)：因SS 培養(yǎng)基中的化學(xué)成分和生化反應(yīng)復(fù)雜，其菌落可使濾紙變?yōu)樽霞t色，故對(duì)腸道桿菌進(jìn)行觸酶和氧化酶試驗(yàn)時(shí)，宜從普通平板或KIA 斜面上取菌，以保證試驗(yàn)結(jié)果正確。二、動(dòng)力試驗(yàn)：原理：有動(dòng)力的細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中沿穿刺線擴(kuò)散生長(zhǎng)。培養(yǎng)基：半固體培養(yǎng)基方法：分別穿刺接種大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，37 孵育 16-18h結(jié)果：穿刺線擴(kuò)散，培養(yǎng)基透明

4、度減低為動(dòng)力陽(yáng)性；穿刺線清晰，培養(yǎng)基透明為動(dòng)力陰性。本試驗(yàn)，大腸為（ +），肺桿為（ -）三、吲哚試驗(yàn)： （靛基質(zhì)試驗(yàn)）原理：有些細(xì)菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，與對(duì)二甲基氨基苯甲醛形成紅色化合物。培養(yǎng)基：蛋白胨水方法：將大腸埃希菌和傷寒沙門菌分別接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，37 孵育 16-18h結(jié)果：取出后，滴加吲哚試劑2d，混勻，可見培養(yǎng)物上層呈玫瑰紅色為+，不變色為 -。本試驗(yàn)，大腸為（ +），傷寒為（ -）四、尿素酶試驗(yàn)：原理：產(chǎn)生尿素酶的細(xì)菌能分解尿素，形成氨，使培養(yǎng)基呈堿性，酚紅指示劑變成紅色。培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基方法：將大腸埃希菌和變形桿菌分別接種于尿素培養(yǎng)基中，3

5、7孵育 16-18h結(jié)果：培養(yǎng)基變紅色者為陽(yáng)性。變黃為陰性。本試驗(yàn)，大腸為（-），變形為（ +）五、甲基紅試驗(yàn)：原理：某些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸可進(jìn)一步分解為甲酸、乙酸等，故培養(yǎng)物pH 在 4.5以下，加入甲基紅指示劑后呈紅色。有些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)，如醇、酮等，培養(yǎng)基 pH 在 6.2 以上，加入甲基紅指示劑呈黃色。培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水方法：分別接種大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌結(jié)果：加入甲基紅指示劑2d，混勻，紅色為陽(yáng)性，黃色為陰性。本試驗(yàn)，大腸為（+），肺桿為（ -）六、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)：原理：某些細(xì)菌（如變形桿菌屬），可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫氨

6、生成苯丙酮酸，加入三氯化鐵試劑與苯丙酮酸螯合后形成綠色化合物。培養(yǎng)基：苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基方法：分別接種大腸埃希菌和變形桿菌，37孵育 16-18h結(jié)果：滴加 100 g/L 三氯化鐵試劑，出現(xiàn)綠色為+，不變?yōu)?-。本試驗(yàn)，變形為（ +），大腸為（ -）七、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)：原理：當(dāng)細(xì)菌可以利用銨鹽作為唯一的氮源，同時(shí)利用檸檬酸鈉作為唯一碳源時(shí)，可在檸檬鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并分解檸檬酸鹽為碳酸鹽，使培養(yǎng)基變堿，指示劑溴麝香草酚藍(lán)由綠色變?yōu)樯钏{(lán)色，為檸檬酸鹽利用試驗(yàn)陽(yáng)性。若不能利用則不能生長(zhǎng)，培養(yǎng)基不變色，為陰性。培養(yǎng)基：西蒙檸檬酸鹽培養(yǎng)基方法：分別接種大腸埃希菌和變形桿菌， 37 孵育 16-18h

7、 結(jié)果：大腸 -（綠色），變形 +（藍(lán)色）八、總結(jié)：結(jié)果判斷與觀察KIA ：觀察上部和下部的顏色變化，變黃為產(chǎn)酸，變紅為產(chǎn)堿，有氣泡為產(chǎn)氣，有黑色為產(chǎn)硫化氫。動(dòng)力（ M ）：半固體上沿穿刺線生長(zhǎng)，周圍清澈，為陰性，周圍混濁者為陽(yáng)性。吲哚（ I）：在蛋白胨水中滴加靛基質(zhì)試劑2-3 滴，立刻變紅者為陽(yáng)性，不變?yōu)殛幮?。尿素酶試?yàn)（ U ）：變?yōu)樯罘奂t者為陽(yáng)性，不變或變黃者為陰性。甲基紅試驗(yàn)（ Mr ）：在葡胨水中滴加甲基紅試劑2-3 滴，變紅為陽(yáng)性，變黃為陰性。枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（C）：細(xì)菌在上生長(zhǎng)，顏色變?yōu)樗{(lán)色為陽(yáng)性，細(xì)菌不長(zhǎng)或培養(yǎng)基顏色不變?yōu)殛幮?。苯丙氨酸酶試?yàn)：在斜面上滴加試劑滴，變成暗綠色為陽(yáng)

8、性，不變?yōu)殛幮?。KIAMIU苯菌種甲基紅枸櫞酸丙斜面底層產(chǎn)氣硫化氫動(dòng)力吲哚脲酶（Mr ）鹽（ C）氨酸大腸埃希菌AA+-+-+-福氏志賀菌KA-/+-+/-+/-宋內(nèi)氏志賀菌KA-/+-+-+/-傷寒沙門氏菌KA-+/-+-+/-甲型副傷寒菌KA+-/+-+-乙型副傷寒菌KA+-+-肺炎克雷伯菌AA+-+-+-變形桿菌KA+/-+【其他試驗(yàn)】一、大腸埃希菌1、形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察：革蘭陰性、中等大小、兩端鈍圓、多呈單個(gè)散在分布的桿菌。鞭毛染色為周毛菌2、菌落觀察：在普通瓊脂平板上呈圓形、灰白色、濕潤(rùn)、光滑型菌落；在血瓊脂平板上呈圓形、灰白色、濕潤(rùn)、光滑型菌落，某些菌株有溶血；在菌落，多數(shù)為光滑型菌落。

9、二、志賀菌屬SS 瓊脂平板上呈紅色、圓形、凸起、邊緣整齊的1、形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察：為格蘭陰性桿菌，散在分布，多無(wú)鞭毛2、菌落觀察：在SS 和 MAC 平板上形成無(wú)色透明、中等大小的菌落，除宋內(nèi)氏志賀菌外，菌落均為光滑型。3、血清學(xué)試驗(yàn)：凡生化反應(yīng)符合志賀菌屬者均需做血清學(xué)鑒定。方法：取一環(huán)志賀菌四種多價(jià)血清與載玻片一端，再取少許待測(cè)菌與之混合，同時(shí)在玻片另一端取待測(cè)菌與之混合，同時(shí)在另一端取待測(cè)菌與生理鹽水混合對(duì)照。結(jié)果判定：對(duì)照呈均勻渾濁，待檢菌與志賀菌四種多價(jià)血清混合后，數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見的顆粒狀凝集物即為陽(yáng)性。繼之用 A/B/C/D 群最常見的單價(jià)血清凝集定種。報(bào)告：分離培養(yǎng)未見可疑菌落或經(jīng)

10、鑒定不符合志賀菌屬鑒定依據(jù)者可報(bào)告“未分離到志賀菌屬細(xì)菌”。經(jīng)分離鑒定后符合鑒定依據(jù)者，可報(bào)告“分離出 XX 志賀菌”，若進(jìn)一步做多種生化反應(yīng)及因子血清分型后，可報(bào)告“分離出 XX 志賀菌 X 型”。二、傷寒沙門菌屬1、形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察：沙門菌屬為革蘭陰性細(xì)長(zhǎng)桿菌，鞭毛染色可見周鞭毛。2、菌落觀察：在 SS 和 MAC 平板上形成無(wú)色、半透明、光滑濕潤(rùn)、凸起的小菌落，產(chǎn)硫化氫的菌種可在 SS 平板上形成中心帶黑褐色的小菌落。3、血清學(xué)試驗(yàn)：若生化反應(yīng)及形態(tài)學(xué)檢查疑為沙門菌，可選用沙門菌的多價(jià)診斷血清進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn) .方法：首先選用AF 組多價(jià)“ O”診斷血清做玻片凝集試驗(yàn)。在試驗(yàn)時(shí)以生理鹽水作對(duì)

11、照。本試驗(yàn)在 510 min 內(nèi)不出現(xiàn)凝集者可確定為陰性。但若生化反應(yīng)比較典型，應(yīng)考慮選用Vi 凝集試驗(yàn)，若凝集，則用無(wú)菌生理鹽水將菌洗下，制成濃厚的懸液，100加熱30min ，再與AF 組多價(jià)“ O”診斷血清做玻片凝集試驗(yàn)。若與AF 組多價(jià)“ O”血清發(fā)生凝集，應(yīng)再與沙門菌單價(jià)因子血清分別做玻片凝集試驗(yàn)，以確定該菌株屬于哪一組。一般先選用本地區(qū)檢出率最高的菌型的相應(yīng)血清做玻片凝集。若已確定哪一沙門菌種后，再分別先用H 因子血清檢查第I 相抗原，然后檢查第II相抗原，最后確定該菌種屬于哪一型沙門菌。群ABCDE菌體抗原 (O)24793鞭毛抗原（ H ）abcde菌種甲型副傷寒乙型副傷寒丙型

12、副傷寒傷寒沙門菌鴨沙門菌（ PA）（ PB）（ PC）報(bào)告：分離培養(yǎng)未見可疑菌落或經(jīng)鑒定不符合沙門菌屬細(xì)菌者，可報(bào)告“未分離出沙門菌”。生化反應(yīng)符合沙門菌，玻片凝集試驗(yàn)陽(yáng)性者，可初步報(bào)告為“分離到 XX 沙門菌”或“ X 群沙門菌”。三、肺炎克雷伯菌1、形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察：為無(wú)芽孢格蘭陰性桿菌，呈卵圓形或球桿狀，常呈雙排列，無(wú)鞭毛。2、菌落觀察：在血瓊脂平板上形成圓形、凸起、灰白色、不溶血、光亮的大菌落，相鄰菌落易于融合，黏液狀，若用接種針蘸取呈長(zhǎng)絲狀拽起。在 MAC 平板上呈乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸的菌落，即紅色、較大、渾濁、凸起的粘液型菌落，較大腸埃希菌大。與大腸埃希菌鑒別IMViC大腸埃希菌+-肺炎克雷伯菌-+四、變形桿菌1、形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察：為革蘭陰性桿菌，兩端鈍圓，有明顯多形性，在一定條件下可形成球桿狀或絲狀；無(wú)芽孢和莢膜，鞭毛染色為周鞭毛。2、菌落觀察：在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上呈波紋狀遷徙生長(zhǎng)現(xiàn)象；在SS 瓊脂平板上