骨質疏松癥動物模型的研究進展

1、陜西理工學院科研實踐論文 科研實踐論文 骨質疏松癥動物模型構建的研究進展 系 （院）：生物科學與工程學院 專業(yè)年級：食品質量與安全專業(yè)1102班學生姓名：王曉樂 學 號：1112034033 指導老師：鄭紅星 完成時間：2013年5月21日 骨質疏松癥動物模型構建的研究進展作者：王曉樂 所在單位：（陜理工生物科學與工程學院食品質量與安全專業(yè)1102班，陜西 漢中 723000） 指導老師：鄭紅星摘要 近年常用于骨質疏松的模型動物有大鼠、小鼠、兔、犬、羊、豬等。以大鼠最為常用。用于制模的方法有年齡相關的骨丟失，去勢模型,藥物類模型，廢用性骨質疏松模型，營養(yǎng)類模型等。其中以去勢模型，特別是去卵巢動

2、物模型最常用。骨質疏松動物模型的建立有手術切除卵巢、藥物誘導、飲食限制和制動術等幾種方法。也有將卵巢切除與其他方法結合應用以加快失骨的報道。關鍵字 骨質疏松；動物模型；研究進展引言 骨質疏松癥是可能由于多種原因導致的骨密度和骨質量下降，骨微結構破壞，造成骨脆性增加，從而容易發(fā)生骨折的全身性骨病。用于骨質疏松癥模型動物模型首先應該考慮的是模型應與人類骨質疏松的臨床癥狀及組織行為相似，但某些動物模型在各個方面完全與人類骨質疏松癥的臨床表現(xiàn)一致是很困難的，因此動物模型側重與表現(xiàn)其某一階段、某些癥狀或一些病理生理變化，作為觀察特定階段和指征的病理模型。美國骨質疏松藥物研究指南（美國FDA）認為目前沒有

3、一種動物模型能模擬人類骨質疏松的所有特征。已有報道用小鼠，大鼠、兔、羊、猴等復制骨質疏松模型。1實驗動物1.1 大鼠 嚙齒類動物如大鼠是迄今為止在OP研究中使用最廣泛的實驗動物，并且美國食品與藥品管理局（FDA）也要求治療OP的藥物實驗研究采用去卵巢大鼠和另一種非嚙齒類動物模型（如狗、豬、羊、靈長目）進行實驗。大鼠用于OP研究的優(yōu)點是：（1）分布廣，繁殖快，花費低，體積小，易于飼養(yǎng)和管理。（2）有明顯的生長期和成年期，容易觀察年齡對骨組織的影響。（3）骨骼系統(tǒng)解剖與人類有眾多相似之處。（4）成年大鼠多個部位的松質骨骨量可在一段較長時期內保持穩(wěn)定，這是研究松質骨重建的合適條件。（5）與人類相似的

4、松質骨分布和重建功能及板層骨的骨小梁重構能力。（6）大鼠去卵巢后，血清雌二醇明顯下降，骨代謝活躍，骨轉換增強，骨吸收大于骨形成，起初有一個快速的以松質骨丟失為主的階段，松質骨骨量減少，骨強度下降，較好地模擬了正常人絕經(jīng)后高轉換型OP。（7）去卵巢大鼠對雌激素，他莫苷芬、二磷酸鹽、甲狀旁腺素和降鈣素等藥物的反應亦與人類有相似之處。故去卵巢大鼠模型已被公認為研究絕經(jīng)早期骨丟失的一種良好的模型。但其缺乏也不容忽視：大鼠終身維持活躍的骨構塑：骨骺閉合遲：皮質骨內骨重建罕見，缺乏Haversian系統(tǒng)：大鼠去卵巢后不發(fā)生脆性骨折。此外，大鼠體積小，不允許反復進行骨組織活檢及大量采血液標本。1.2 小鼠

5、采用小鼠進行骨代謝遺傳因素的研究，了解特殊骨骼類型與遺傳基因的聯(lián)系；或是導入目的基因或敲出目的基因，觀察其表型特征和病理變化，是目前OP研究領域中最感興趣的課題之一。鑒于SAM/P6、57B1/6J、和C3H/HeJ等小鼠的峰值骨量（PBM）的差異，應用分子生物學技術，對特定基因位點進行完整的基因學研究，識別一個活多個OIP相關基因，為大動物和人類的研究提供有益的經(jīng)驗。最近日本研究人員選用一種基因突變小鼠既twy小鼠進行OP研究，發(fā)現(xiàn)這種小鼠體內存在不平行鈣化現(xiàn)象，頸椎有有高度骨化現(xiàn)象，而腰椎發(fā)生高轉化率的OP1.2。1.3 狗 皮質骨與松質骨的比例、Haversian單位和松質骨重建均與人類

6、相似；存在年齡相關性OP和廢用性OP；去睪丸狗有類似人類骨吸收大于骨形成的改變。但狗為肉食動物，食物中不恰當?shù)拟}磷化例以及小腸對鈣的吸收低，易產生繼發(fā)性甲狀膀腺功能亢進癥。另外，骨量丟失咱切除卵巢和子宮的狗只是一個暫時現(xiàn)象。1.4 小型豬 體積小，占空間小，易于實驗操作管理；有板層骨結構，皮質骨重建和松質骨對視與沉積的發(fā)生率與人類相似；盡管通過切除卵巢、子宮和用氟化物誘導的OP與人類OP存在骨量和骨強度的差別，但在表現(xiàn)形式上與人類相似；另外，它還可存在骨量減少相關的自發(fā)性骨折。不足之處是費用高，分布稀少，飲食要求嚴格，尤其害死鈣的攝取，容易影響到骨密度（BMD）因為子宮的血管容易破裂；卵巢、子

7、宮切除手術較為困難；通人類相比有較高的骨量及更致密的小梁骨網(wǎng)狀結構。1.5 綿羊 從多方面因素看，綿羊是一種極具潛力的OP模型動物：性情溫順，易于飼養(yǎng)、管理；有自發(fā)性的排卵和與女性相似的激素分泌規(guī)律；氟化物在骨的沉寂和骨細胞的毒性反應方面與人類相似；今年的研究發(fā)現(xiàn)，低齡綿羊（小于34歲）的皮質骨是叢狀骨，二高齡綿羊（79）可見到Haversian系統(tǒng)的重建3。但作為OP模型也有其不足之處：綿羊為草食動物，維生素代謝和礦物質需要量以及磷代謝與人類相差較大，綿羊尿中磷排泄較人低，消化道是綿羊磷排泄的主要渠道；因綿羊為反芻類，如果進行口服藥物吸收實驗，需建立胃痿管；沒有自然絕經(jīng)；通常動情期只出現(xiàn)在秋

8、冬兩季，且BMD、生化指標、骨組織形態(tài)學指標有季節(jié)性和日節(jié)律性波動；缺乏自發(fā)性骨折。1.6 兔 繁殖率高，容易飼養(yǎng)，抗空氣感染力強；骨轉化快，當性腺發(fā)育接近6個月左右時，其骨骼既發(fā)育成熟，成年兔有Haversian重建活性，可用作合成代謝促進藥物對松質骨及Haversian系統(tǒng)重建作用的研究4，以及用于研究睪酮及雌激素對生長發(fā)育過程中BMD的影響，或作為糖皮質激素誘導OP動物模型。但因兔的松質骨含量少，給骨計量學檢測帶來一定困難。1.7 靈長目 與其他動物相比，靈長類動物用作OP動物模型具有突出優(yōu)勢；身體保持直立位，有與人極為相似的骨生物力學特性；具有Haversian和松質骨重建活性；存在增

9、齡性和制動性骨丟失；有與人類女性相似的動情周期和絕經(jīng)，卵巢功能停止后骨的反應亦與人類相似；由于靈長類動物與人類在進化樹種的位置最近，對建立基因顯性特征研究方面同樣很有幫助。但由于費用昂貴，飼養(yǎng)管理條件要求高，操作危險，試驗周期長；不可避免地攜帶傳播動物源性傳染?。蛔鳛榻^經(jīng)后OP模型，雌性靈長類的年齡必須足夠大等極大地限制了它們的應用。2選擇骨質疏松動物模型應注意的因素2.1骨生長期和成年期 理想的骨質疏松動物模型應有明確的生長期和成長期。在骨質疏松研究中生長期的骨積累和成年期的骨峰值是重要的概念。在骨生長期，以骨塑建（bone modeling）為主，骨發(fā)育的代表是長軸骨的生長，骨塑形能力強，

10、骨代謝活性高。，除了遺傳因素，生長期的營養(yǎng)、運動、機械負荷和日照時間等決定峰值骨量。成年期的骨發(fā)育是以骨重建為主。，松質骨的骨重建活性高于皮質骨。骨代謝處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)。測定峰值骨量和成年后的骨量丟失是骨質疏松研究中的重要的手段。進行實驗時，明確實驗動物處于生長期，還是成年期。如實驗目的是研究成年人疾病的過程，應用成年期的動物。若觀察危險因素對骨骼系統(tǒng)生長的影響，應選用生長期的動物。2.2骨塑建與骨重建骨塑建（bone modeling）是骨生長期骨的形狀和結構的生長變化，還在成年期期調整骨的構筑和骨量分布而適應外力環(huán)境的改變。骨重建（bone remodeling）是指骨組織中的基本單位新

11、骨取代舊骨的骨吸收與骨重建過程，并無骨形狀的改變。骨質疏松動物模型應可觀察到松質骨和皮質骨明確的組織形態(tài)學變化。2.3雌激素與絕經(jīng)大多數(shù)婦女經(jīng)歷27年的自然絕經(jīng)期，手術女性因手術而絕經(jīng)。體內雌激素水平下降導致多得快速失骨可持續(xù)58年，逐漸進入一個緩慢失骨期。這些變化主要發(fā)生在松質骨和皮質骨內表面5。雌激素替代療法可減少骨量的丟失，骨折發(fā)生率降低。骨質疏松模型選擇的動物如有周期性的月經(jīng)或動情期，有自然絕經(jīng)現(xiàn)象和對雌激素替代療法有良好的反應，可能是用于骨質疏松研究的最佳模型。比如，大鼠去勢模型是研究絕經(jīng)后骨質疏松的經(jīng)典動物模型。2.4其它動物骨骼的形態(tài)、骨密度和骨生理與人類不盡相同，而且骨質疏松癥

12、的變化往往經(jīng)歷數(shù)年或數(shù)十年，但動物模型在數(shù)周或數(shù)月復制出相像的變化，二者是否有差距，有待進一步研究，因此在實驗結果判定和外推時需慎重。3復制骨質疏松癥的方法骨質疏松動物模型的建立有手術切除卵巢、藥物誘導、飲食限制和制動術等幾種方法。也有將卵巢切除與其他方法結合應用以加快失骨的報道。3.1切除卵巢去勢法以大鼠為例，大鼠有明顯的生長期和成年期，雌性大鼠發(fā)情期規(guī)律，每四天出現(xiàn)一次持續(xù)18小時的雌二醇峰值時間。當卵巢切除以后，如上所述，出現(xiàn)骨轉化率增加，松質骨出現(xiàn)顯著的骨丟失，骨小梁變細，單位體積骨小梁骨量降低，骨強度下降；經(jīng)歷約4月的快速骨丟失期，隨后為一段較長的緩慢的丟失階段5。肥胖對骨丟失有一定

13、保護的作用；腸道的鈣吸收減少；這種特征較好地復制了女性正常絕經(jīng)時骨量丟失的情況。予雌激素替代治療時無骨轉化增加和失骨。抑制人骨轉化的藥物如雙磷酸鹽類和降鈣素也可有阻止大鼠的高轉化率和骨丟失。這與絕經(jīng)后婦女對相同治療的應用效果一致。該模型已被反復證實，切除大鼠卵巢，血中雌激素水平顯著降低，并出現(xiàn)骨質疏松病理變化，該法已成為制造絕經(jīng)后骨質疏松癥動物模型的有效方法6。雌激素減少后的骨量的減少和骨形成關系如何尚未闡明。骨骼成熟后，在一生中仍不斷進行更新與改造，這就是骨重建。骨重建過程是舊骨的吸收，新骨的形成的復雜過程。主要有兩種細胞在發(fā)生作用：一種是通過分解代謝促使骨質吸收的破骨細胞，一種是通過合成代

14、謝促進骨形成的成骨細胞7。正常的骨再建過程有賴于這兩種細胞作用的平衡。在骨表面同時存在著破骨細胞和各個分化階段的成骨細胞，無論在組織學上，還是在功能上都做為一個生理單位發(fā)生作用，這一系列的細胞群被稱為基本的多細胞單位(basic multicelluar unit,BMU)。任何一種可以改變破骨細胞活性和成骨細胞分泌能力的因素均可對骨的再建產生深刻的影響。雌激素通過多個環(huán)節(jié)維持骨吸收和骨形成的平衡。（1）雌激素增加降鈣素的分泌,抑制甲狀旁腺激素的活性,從而抑制骨鈣溶解、促進鈣在腸內的吸收、幫助活性維生素D(1,25-二羥維生素D)在腎臟的合成、促進骨的重建。(2)而且許多研究發(fā)現(xiàn)骨細胞內存在雌

15、激素受體。實驗表明, 在成骨細胞上存在雌激素受體。雌激素具有刺激骨形成作用,破骨細胞是雌激素的靶細胞8。(3)雌激素通過影響局部的細胞因子如IGF-I、TGF-、IL-1、TNF、IL-6等而調節(jié)成骨細胞與破骨細胞的功能狀態(tài)，進而影響骨代謝9。3.2藥物誘導常用誘導骨質疏松動物模型有維甲酸和糖皮質激素。維甲酸是維生素A的衍生物，臨床上作為治療白血病的藥物，對骨代謝有明顯的影響，大鼠維甲酸70mg/kg灌胃兩周，即出現(xiàn)骨密度降低，骨小梁吸收，斷裂，稀疏；骨髓腔增大。骨礦含量降低,骨板結構破壞及骨骼負重功能損害;骨生成減少而骨吸收增加等。利用這一特性，可成功復制出骨質疏松動物模型。在造型過程中，動

16、物會出現(xiàn)厭食，體重減輕，倦怠等表現(xiàn)，且易感染。此模型的組織形態(tài)學改變，及對雌激素治療的反應與人類有較好相似性10。是大鼠急性骨質疏松的復制方法。維甲酸誘導大鼠骨質疏松主要是激活破骨細胞的分化、增殖，促進骨吸收作用，而造成骨吸收大于骨形成的負平衡狀態(tài)，造成骨丟失。同時文獻報道，維甲酸可造成卵巢重量明顯減輕，子宮萎縮，維甲酸有損傷卵巢功能的作用，雌激素水平下降11，體內雌激素減少是導致骨質疏松的主要原因?？屡d氏綜合癥或接受皮質類固醇激素治療的病人，約半數(shù)發(fā)生骨質疏松，借此，予動物大劑量長期使用皮質類固醇激素可誘導骨質疏松模型，常用強的松或強的松龍，皆可觀察到顯著的骨丟失。糖皮質激素直接抑制成骨細胞

17、的功能，減少前成骨細胞向功能性成骨細胞轉化，降低前成骨細胞的骨膠原的合成，使骨基質形成減少，破骨細胞間接由于偶聯(lián)因素及PTH增加的刺激而骨吸收加速12。血鈣水平下降，是皮質類固醇抑制小腸鈣吸收的結果。又進而刺激PTH分泌，血清降鈣素濃度輕度下降，也是骨吸收活躍的原因。皮質類固醇可抑制腎小管對鈣磷的重吸收13。此模型在一定程度上模擬骨形成減少的變化。但不夠理想，原因在于動物真正的骨生成減少較為少見。并且與原發(fā)性骨質疏松的發(fā)病機理與病程不一致，因此不適合用于觀察藥物對骨吸收抑制作用的研究模型。3.3飲食限制決定和影響骨量的因素可概括為遺傳因素和環(huán)境因素。其中環(huán)境因素有營養(yǎng)、體力活動和生活習慣等。營

18、養(yǎng)對骨量的維持有必不可少的作用，特別是其中的蛋白質及鈣質。但只是環(huán)境因素之一，對骨量的影響較小。因其是可控因素，加之骨量的微細變化可致骨折風險大大增加，所以合理的營養(yǎng)在原發(fā)性骨質疏松的防治上有一定作用。骨質疏松的飲食危險因素包括鈣攝入減少，蛋白質、維生素D不足，膳食中的鈉、有機磷含量過高等14。鈣是人體含量較多的元素之一，99的鈣存在骨骼和牙齒中，對維持骨骼的結構與功能，以及保持血鈣有重要的作用。其余1%的體鈣分布于各種細胞和細胞間液中，具有多種生理功能。當鈣攝入不足、鈣吸收功能低下或高鈣排出使機體缺鈣時，可繼發(fā)引起甲狀旁腺激素(PTH)分泌增多，使骨吸收亢進，長期缺鈣將導致骨量丟失，發(fā)生骨質

19、疏松癥。另外有報道骨量與遺傳、機械負荷、骨峰量值和營養(yǎng)內分泌狀況等有關。從胎兒時期保持充足的鈣攝入量，可以提高骨峰量值。骨峰量值增高，骨儲備多，對中老年的骨量丟失緩沖能力強，使骨量減少保持在閾值以上，從而延緩減輕骨質疏松的發(fā)生15。大鼠在幼時鈣攝入不足，其骨峰量值下降，而低骨峰量值使增齡后骨質疏松發(fā)生的風險大大增加16。其次，有流行病調查報道，人群中蛋白質攝入量與骨密度顯著負相關。高蛋白攝入使尿中代謝固定酸含量增加，腎近曲小管鈣重吸收減少，尿鈣增加，同時激發(fā)胰島素與胰島素生長因子對骨細胞調節(jié)作用17。蛋白質攝入大多與磷結合，同時增加磷的吸收。后者能減少尿鈣排泄，抵消高蛋白攝入引起的尿鈣增加，但

20、磷使鈣從糞便中排泄量上升，所以過多的蛋白攝入的凈效應是增加負鈣平衡18。另外，無論男性或女性，隨著增齡其日照時間減少，維生素D合成不足，體內鈣吸收不足。如發(fā)生在高齡人群，常加速骨量的丟失。研究表明，高磷攝入導致高磷血癥、低鈣血癥、骨丟失和軟組織鈣化等，主要與繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進有關19。以上單因素營養(yǎng)因素控制造成大鼠骨質疏松動物模型，往往易受其他因素的影響，而且建立模型所需時間長，一般需40周以上。因此需以低鈣飼料為主，輔以其他危險因素或藥物等聯(lián)合造成大鼠骨質疏松模型。3.4制動法廢用性骨質疏松或骨丟失模型，是人工方法使動物部分肢體處于不負重狀態(tài)而建立的活體模型。由于動物肢體的骨量和骨代謝與

21、復制、肌肉活動、神經(jīng)血管對肌肉骨骼的營養(yǎng)等因素密切相關。復制的方法很多，常用的是機械固定法、懸吊法、腱切除法和離斷坐骨神經(jīng)等。其中機械固定法和懸吊法優(yōu)點在于在同一動物上即可研究失重時的骨丟失，又可以觀察承重肢超重時骨代謝變化，去除固定后還能觀察骨質疏松的恢復，且易于操作。4總結 從青少年期就加強運動、保證足夠的鈣質攝入，同時防止和積極治療各種疾病，尤其是慢性消耗性疾病與營養(yǎng)不良、吸收不良等，防止各種性腺功能障礙性疾病和生長發(fā)育性疾病；避免長期使用影響骨代謝的藥物等，可以盡量獲得理想的峰值骨量，減少今后發(fā)生骨質疏松的風險。成人期鈣劑是預防骨質疏松的基本措施，不能單獨作為骨質疏松治療藥物僅作為基本

22、的輔助藥物。成年后的預防主要包括兩個方面。一是盡量延緩骨量丟失的速率和程度，對絕經(jīng)后婦女來說，公認的措施是及早補充雌激素或雌、孕激素合劑。二是預防骨質疏松患者發(fā)生骨折，避免骨折的危險因素可明顯降低骨折發(fā)生率。隨著新技術的不斷涌現(xiàn)和對骨質疏松的認識的深入，骨質疏松動物模型也不斷地改進，有必要對各種骨質疏松動物模型的特點和機理進行深入的研究。在評價新藥的防治效果時，應注意選用適宜的動物和造模方法，藥物作用機理與造模方法在病因學上的一致性。只有使用標準的、與人類骨質疏松相關性強的動物模型，才能得到可靠地研究數(shù)據(jù)，準確評價實驗的結果。參考文獻1 Okawa A Ikegamura I ，et af M

23、apping of a gene responsible for twy,a mouse model of assification of the posterior longitudinal of the spine Mamm Genome.1998.9:155-1562Ohtsuki T, Funya S Yamsda T,et al .Gene expression of noncollagenous bone matrix proteins in the limb joints and intervertebral disks of the twy mouse,Calcif Tisau

24、e Int,1998.63;167-1723Chavassieux P,Pastoureau P Chapuy M C, et al .Clucocorticoid-induced in-duced inhibition of osteoblastie bone formation in ewe:A biochemical and histomornetrie study.Osteoporos Int,1999.3:97-1024Waters R V ,Gamradt S C,Asmis P,et al .Systemic corticosteroids inhibit bone healin

25、g in a rabbit ulnar osteotomy model Acta Orthop Scand,2000.7:316-3215Wronski TJ, Walsh CC, Ignaszewski LA. Histologic evidence for osteopenia and inceaseed bone turnoverin ovariectomized rats.Bone,1986,7:119-1246丁桂之，周勇.骨質疏松癥研究中動物模型的選擇與應用J.中國骨質疏松雜志，1997，3（8）：84877ManoH,YuasaT,KamedaTiyazawaK,et al.Mammalian mature osteoclastes estrogen target cells.Biochem Biophys Re