光氣吸入對(duì)大鼠肺組織基因表達(dá)譜的影響

1、光氣吸入對(duì)大鼠肺組織基因表達(dá)譜的影響【摘要】 目的： 研究光氣吸入染毒前后大鼠肺組織基因表達(dá)的差異，探討光氣肺損傷作用相關(guān)的基因譜. 方法： 提取正常對(duì)照組和光氣染毒組肺組織的總RNA，并以此為模板制備熒光標(biāo)記的cRNA靶物，經(jīng)雜交、洗滌后，通過(guò)掃描熒光強(qiáng)度和計(jì)算機(jī)軟件分析，尋找染毒前后上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)基因. 結(jié)果： 在大鼠20500個(gè)靶基因中，初步篩選出801條差異表達(dá)基因，表達(dá)上調(diào)的有557條，下調(diào)的有254條. 根據(jù)基因的生物學(xué)功能，差異表達(dá)基因被分為9類(lèi)：G1自由基電子傳遞相關(guān)；G2 應(yīng)激炎癥相關(guān)；G3 物質(zhì)代謝相關(guān)；G4 細(xì)胞增殖分化凋亡相關(guān)；G5 基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)；G6 受體和

2、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)；G7 蛋白質(zhì)修飾分解相關(guān)；G8 細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)相關(guān)；G9 離子通道與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)等. 結(jié)論：光氣可以引起肺組織基因的多發(fā)性改變，其差異表達(dá)基因的功能分類(lèi)為進(jìn)一步探討光氣中毒發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制和有效救治提供新的線索和思路. 【關(guān)鍵詞】 光氣；肺/損傷；寡核苷酸序列分析；基因表達(dá)光氣（phosgene,COCl2）又稱(chēng)碳酰氯，屬于高毒類(lèi)窒息性毒劑，是合成化工產(chǎn)品的重要原料，廣泛用于涂料、農(nóng)藥、塑料和紡織品等生產(chǎn)領(lǐng)域，由于揮發(fā)溫度低（8.2）、分散度高、反應(yīng)快速，而被認(rèn)為是具有高度潛在危險(xiǎn)的恐怖武器1-2. 光氣的主要毒性作用是對(duì)呼吸系統(tǒng)的損害，引發(fā)肺水腫3，但其中毒機(jī)制截至目前尚未完全闡

3、明，臨床治療亦無(wú)特效措施4-5. 我們利用基因芯片技術(shù)，探討光氣染毒后大鼠肺組織基因表達(dá)譜的改變以及差異表達(dá)基因與肺損傷的關(guān)系，旨在從新的角度對(duì)光氣中毒機(jī)制進(jìn)行闡述.1材料和方法1.1材料SD大鼠10只，雌雄各半，體質(zhì)量145 g 170 g,（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；TRIzol Reagent （美國(guó)Invitrogen公司）；cRNA擴(kuò)增與標(biāo)記試劑盒（Lifegen公司）；RNA純化試劑盒（荷蘭Qiagen公司）；芯片雜交試劑盒（美國(guó)Agilent公司）；雜交箱（美國(guó)UVP公司，HL2000型）；芯片掃描儀（美國(guó)Axon公司，4000B型）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司，G800型）

4、.1.2方法1.2.1樣本準(zhǔn)備將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和染毒組，每組5只. 正常組未在光氣中暴露，染毒組給予光氣染毒（38 mg/L， 1 min）. 4 h后分別將兩組動(dòng)物按20 mg/Kg 用10 g/L戊巴比妥鈉麻醉，充分暴露胸腔，左心房開(kāi)放后經(jīng)右心室沿肺動(dòng)脈注入無(wú)RNA酶的水對(duì)肺組織進(jìn)行灌洗以盡量排盡血液，最后在肺的同一部位剪取肺組織，經(jīng)TRIzol處理，迅速置于液氮中保存.1.2.2總RNA提取和cRNA擴(kuò)增標(biāo)記用RIzol試劑一步法抽提細(xì)胞總RNA，并用甲醛凝膠電泳，檢測(cè)總RNA樣本的質(zhì)量；用紫外分光光度計(jì)，分別在260 nm，280 nm處檢測(cè)cRNA的產(chǎn)量和純度. 用cRNA擴(kuò)增與

5、標(biāo)記試劑盒對(duì)靶物進(jìn)行Cy3或Cy5熒光標(biāo)記，用RNA純化試劑盒對(duì)標(biāo)記靶物進(jìn)行純化，分別在550 nm，650 nm處檢測(cè)Cy3和Cy5的熒光強(qiáng)度，以評(píng)估熒光標(biāo)記效率.1.2.3芯片雜交實(shí)驗(yàn)芯片探針長(zhǎng)度60 mer，共包括22575個(gè)樣點(diǎn)，其中覆蓋大鼠基因20 500個(gè)，positive control探針913個(gè)，negative control探針162個(gè)，空白探針1000個(gè). 按照芯片雜交試劑盒提供的操作標(biāo)準(zhǔn)，將芯片和cRNA熒光標(biāo)記靶物進(jìn)行雜交. 經(jīng)洗滌后，室溫500 r/min離心10 min，甩干芯片表面液體，取出后立即進(jìn)行掃描.1.2.4熒光掃描和數(shù)據(jù)處理將清洗甩干的芯片置于Axo

6、n 4000B型掃描儀中，用Genepix3.0軟件進(jìn)行圖像掃描，得到芯片雜交圖譜，讀取每個(gè)樣點(diǎn)的原始熒光信號(hào)數(shù)據(jù)，并對(duì)讀取的數(shù)據(jù)用Spotfire 8.0軟件進(jìn)行分析，經(jīng)歸一化處理后，制作基因差異表達(dá)分析散點(diǎn)圖. 導(dǎo)出上調(diào)基因和下調(diào)基因列表. 判斷基因差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)R2時(shí)表示基因上調(diào)；R0.5時(shí)表示基因下調(diào)；當(dāng)0.5 1.2.5基因功能分類(lèi)對(duì)符合基因差異上調(diào)或下調(diào)表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)的單個(gè)基因，通過(guò)連接基因庫(kù)權(quán)威網(wǎng)站：和，進(jìn)行基因功能比對(duì)和分類(lèi)，制作光氣染毒后肺組織的差異表達(dá)基因圖譜.2結(jié)果2.1總RNA提取質(zhì)量RNA甲醛凝膠電泳顯示，28 s，18 s兩條帶清晰完整，證實(shí)提取的RNA無(wú)降解（圖1）

7、. 經(jīng)紫外分光光度計(jì)分析，A260 nm/A280 nm值均為2.0，說(shuō)明制備的RNA純度較高，符合實(shí)驗(yàn)要求.2.2cRNA標(biāo)記效率以效率大于8 mol/g視為標(biāo)記有效，計(jì)算得熒光標(biāo)記效率分別為9.81 mol/g和9.04 mol/g，符合參加雜交反應(yīng)的條件.2.3芯片雜交結(jié)果2.3.1差異表達(dá)基因經(jīng)對(duì)雙色熒光標(biāo)記雜交掃描圖譜和基因表達(dá)分析散點(diǎn)圖進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，在大鼠20 500個(gè)靶基因中，染毒組相對(duì)于對(duì)照組上調(diào)的基因有557條，其中已知基因433條，未知基因124條；下調(diào)的基因有254條，其中已知基因205條，未知基因49條. 部分顯著變化的基因（表1）. 表1光氣染毒后肺組織的部分

8、差異表達(dá)基因（略）2.3.2基因功能分類(lèi)經(jīng)基因生物學(xué)功能分析，將差異表達(dá)基因分為9類(lèi)，其功能已知基因分類(lèi)結(jié)果顯示，光氣染毒后細(xì)胞的能量生成下降，包括：參與糖有氧代謝的基因表達(dá)下調(diào)，如NM033235，編碼蘋(píng)果酸脫氫酶1；而參與糖異生和糖無(wú)氧酵解的基因表達(dá)上調(diào)，如BI277389，編碼磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1. 與能量水平密切相關(guān)的部分功能基因也表達(dá)異常，如NM053578基因下調(diào)，編碼ATP酶H+轉(zhuǎn)運(yùn)溶酶體9kDaV0亞基e，參與ATP合成偶聯(lián)的質(zhì)子運(yùn)輸；NM022235基因上調(diào)，編碼鉀電壓閥門(mén)通道Isk相關(guān)家族成員3，參與K離子轉(zhuǎn)運(yùn)等（表2）. 表2差異表達(dá)基因的分類(lèi)及數(shù)目（略）3討論近年來(lái)，

9、光氣作為重要的化工原料，在生產(chǎn)、運(yùn)輸、使用等過(guò)程中，對(duì)人員和環(huán)境造成了嚴(yán)重危害6. 光氣吸入中毒最顯著的臨床表現(xiàn)是肺水腫的形成，也是中毒人員致死的主要原因. 我們利用基因芯片技術(shù)，對(duì)光氣染毒前后的基因表達(dá)譜進(jìn)行了分析. 從差異基因數(shù)量來(lái)看，差異表達(dá)在兩倍以上的基因達(dá)801條，占靶基因總數(shù)的3.9%，說(shuō)明光氣可以引起肺組織基因的多發(fā)性改變，證實(shí)了光氣致肺水腫的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多基因調(diào)控的過(guò)程7，提示在正常肺組織細(xì)胞中可能存在著相當(dāng)數(shù)量的基因容易受到有毒化學(xué)物的作用而發(fā)生改變，其基因表達(dá)是一個(gè)復(fù)雜而又不穩(wěn)定的生物學(xué)過(guò)程，有人稱(chēng)之為“不穩(wěn)定型基因組”8. 表1所列出的部分變化顯著的功能基因可能是光氣

10、毒性作用的敏感基因或靶標(biāo)基因.從差異基因功能來(lái)看，很大一部分差異表達(dá)基因與細(xì)胞的基本生理功能有關(guān)，說(shuō)明此類(lèi)基因參與的生物過(guò)程比較復(fù)雜. 測(cè)定結(jié)果和統(tǒng)計(jì)分析也表明，與自由基、電子傳遞相關(guān)的基因，雖然其差異表達(dá)基因的數(shù)量較少，但秦緒軍等9的報(bào)道，自由基損傷在光氣中毒過(guò)程中起著重要作用. 我們的結(jié)果顯示，上調(diào)的BF556648編碼金屬硫蛋白1和金屬硫蛋白2，通過(guò)與金屬離子結(jié)合，參與電子傳遞，發(fā)揮抗氧化劑作用10；下調(diào)的NM012611編碼誘生型一氧化氮合成酶，參與NO生物合成，NO作為體內(nèi)十分活躍的自由基分子，與分子氧、超氧陰離子及一些金屬離子發(fā)生反應(yīng)，可引起廣泛的自由基損傷11. 此結(jié)果從基因水平

11、表明自由基確實(shí)在光氣中毒過(guò)程中扮演著重要角色，當(dāng)光氣引發(fā)自由基產(chǎn)生時(shí)，機(jī)體通過(guò)自身代償，在一定程度上減輕了自由基的損傷作用. 同時(shí)也提示我們，利用復(fù)合抗氧化劑進(jìn)行光氣吸入后的早期治療，可能會(huì)有效地提高救治效果.經(jīng)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行系統(tǒng)分析，我們認(rèn)為光氣中毒可能存在如下機(jī)制：光氣吸入肺組織以后，在發(fā)生即時(shí)性理化損傷作用的同時(shí)也引起了肺組織“不穩(wěn)定基因”的差異表達(dá)，其中與自由基、電子傳遞相關(guān)的基因，首先引起生物電化學(xué)平衡的紊亂，可能是引起肺組織延時(shí)性損傷的起始動(dòng)因；受之影響，與物質(zhì)代謝、細(xì)胞分裂、基因表達(dá)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因相繼也發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞基本生理功能障礙，其中能量代謝水平的異常，可能

12、是引起細(xì)胞其它功能障礙的最根本原因；最后，當(dāng)損傷積累到一定程度，細(xì)胞失去代償能力，細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)受損，離子通道及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)失調(diào)，可能是各類(lèi)細(xì)胞損傷的最終結(jié)果，也是引發(fā)肺水腫的直接原因.【參考文獻(xiàn)】 1Burklow TR, Yu CE, Madsen JM. Industrial chemicals: Terrorist weapons of opportunityJ. Pediatric Annals, 2003,32(4): 230-234.2Evison D, Hinsley D, Rice P. Chemical weaponsJ. BMJ, 2002,324(7333):332-335.

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