兔冬眠心肌模型骨髓干細(xì)胞動(dòng)員及心肌組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的基因表達(dá)

1、兔冬眠心肌模型骨髓干細(xì)胞動(dòng)員及心肌組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的基因表達(dá)【摘要】 目的: 探討兔冬眠心肌模型外周血骨髓干細(xì)胞的變化及缺血心肌組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因表達(dá)的變化. 方法: 選用雄性日本大耳白兔為研究對(duì)象，通過(guò)開(kāi)胸不全結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支方法建立冬眠心肌動(dòng)物模型. 將成功制備的24只兔模型隨機(jī)分為4組，即缺血3 d組、缺血7 d組、缺血28 d組和假手術(shù)對(duì)照組. 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各組模型動(dòng)物外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD34+細(xì)胞百分率，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定各組動(dòng)物模型缺血心肌組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá). 結(jié)果: 兔冬眠心肌模型于手術(shù)后出現(xiàn)骨髓干細(xì)胞動(dòng)員，1 wk內(nèi)達(dá)高峰，

2、隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減弱；同時(shí)相應(yīng)地出現(xiàn)手術(shù)后1 wk內(nèi)缺血心肌組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá)明顯升高，隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)逐漸降低. 結(jié)論: 冬眠心肌可通過(guò)組織局部血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)增高而動(dòng)員骨髓干細(xì)胞進(jìn)入外周血. 【關(guān)鍵詞】 心肌頓抑 骨髓干細(xì)胞 動(dòng)員 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子0引言干細(xì)胞治療缺血性心臟病在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和小規(guī)模臨床試驗(yàn)均取得了很大進(jìn)展1-2. 目前這方面的研究主要集中在兩方面，即急性心肌梗死和心肌梗死后慢性心衰，這兩方面均屬于冠心病的嚴(yán)重類型和晚期階段. 冬眠心肌屬于存活心肌，大多存在于冠心病的早期階段即未發(fā)生心肌梗死時(shí)，此時(shí)同樣存在心肌缺血和局部微環(huán)境的改變. 本研究以兔冬眠心肌模型為研究

3、對(duì)象，探討心肌冬眠狀態(tài)下外周血骨髓干細(xì)胞的變化及心肌組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）基因表達(dá)的變化，為干細(xì)胞移植治療冬眠心肌提供理論基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料兔淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于北京普利萊基因技術(shù)有限公司；CD34單克隆抗體及陰性對(duì)照購(gòu)于B.D公司；RevertAidTM First Stand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Fermentas公司；SYBR ExScriptTM RTPCR Kit(Perfect Real Time)試劑盒購(gòu)自TaKaRa大連寶生物工程有限公司；Trizol購(gòu)于Invitrogen公司. Beckman Coulter公司流式細(xì)胞儀

4、和美國(guó)BioRad公司iQ5型 Real Time PCR儀分別由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心和第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科提供. 選用雄性日本大耳白兔30只，體質(zhì)量23 kg，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心. 實(shí)驗(yàn)前，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在動(dòng)物中心適應(yīng)性喂養(yǎng)1 wk.1.2方法1.2.1兔冬眠心肌模型制備和分組日本大耳白兔30只，30 g/L戊巴比妥鈉（30 mg/kg）耳緣靜脈麻醉. 隨后經(jīng)耳緣靜脈注射利多卡因（1 mg/kg），以預(yù)防冠狀動(dòng)脈結(jié)扎過(guò)程中發(fā)生室性心律失常. 將兔仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，備皮，沿胸骨左緣剪斷左側(cè)第34肋軟骨，暴露縱隔和心臟，保持兩側(cè)胸膜完整，距左冠狀動(dòng)脈冠狀竇開(kāi)口45 mm處，用5

5、0無(wú)損傷帶針縫合線穿過(guò)左前降支下方，將直徑分別為0.8 mm和0.1 mm的粗、細(xì)絲線各一根置于左前降支前緣，將絲線與左前降支一起結(jié)扎，隨后迅速抽出細(xì)絲線，相當(dāng)于血管90%狹窄. 觀察左前降支遠(yuǎn)端血管充盈不明顯，左心室前壁和心尖部心肌顏色稍變暗，表明結(jié)扎成功. 假手術(shù)組將縫合線穿過(guò)左前降支下方，但不結(jié)扎. 術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)，肌肉注射青霉素（40萬(wàn)U/只）3 d預(yù)防感染. 術(shù)中及術(shù)后2 d內(nèi)共死亡6只，均為模型組，原因?yàn)闅庑睾褪а^(guò)多. 術(shù)后第3 d對(duì)實(shí)驗(yàn)兔行超聲心動(dòng)圖檢查，觀察左室前壁出現(xiàn)節(jié)段性運(yùn)動(dòng)障礙，未出現(xiàn)心肌梗死征象，提示手術(shù)成功. 將存活的24只兔隨機(jī)分為缺血3 d組，缺血7 d組、缺血2

6、8 d組和假手術(shù)組，每組6只.1.2.2外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD34+百分率測(cè)定各組每只兔耳緣靜脈取血5 mL，肝素抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞. 取2×106個(gè)細(xì)胞，分別加入10 L CD34單克隆抗體和熒光素藻紅蛋白標(biāo)記（陰性對(duì)照），室溫避光孵育20 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血中CD34+細(xì)胞百分率.1.2.3缺血心肌組織中VEGF mRNA表達(dá)(1)引物設(shè)計(jì)：根據(jù)美國(guó)國(guó)立圖書(shū)館基因數(shù)據(jù)庫(kù)(Genebank)檢索VEGF基因序列，應(yīng)用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，由北京三博遠(yuǎn)志生物公司合成引物. VEGF上游引物為5GGC AGA AGA AGG AGA CA

7、A TAA ACC3， 下游引物為5CAG AGG CAC GCA GGA AGG3，產(chǎn)物大小361 bp；管家基因actin上游引物為5CCA TCT ACG AGG GCT ACG C3，下游引物為5CGG CTG TGG TCA CGA AGG3，產(chǎn)物大小397 bp. （2）標(biāo)本采集和總RNA提取：各組每只兔按各自觀察時(shí)間點(diǎn)處死，取出心臟，切取左室前壁缺血心肌迅速置于液氮中保存. 取新鮮組織樣品100 mg剪碎，加入1 mL Trizol 裂解細(xì)胞，勻漿后進(jìn)行總RNA的提取. 對(duì)所有提取的總RNA進(jìn)行紫外分光光度定量，測(cè)定RNA在分光光度計(jì)260 nm和280 nm處的吸收值，計(jì)算A2

8、60/A280值，均在1.82.0之間. （3）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行. 在20 L反應(yīng)體系中分別加入：樣本RNA模板0.5 g，隨機(jī)六聚體引物(0.2 g/L)1 L,加入去RNA酶水至12 L, 70孵育5 min；然后加入5×反應(yīng)緩沖液4 L,RNase 抑制劑（20 u/L）1 L,10 mmol/L dNTP 混合液2 L，25孵育5 min；最后加入RevertAidTM MMuLV反轉(zhuǎn)錄酶（200 u/L）1 L，總體積為20 L. 混勻后置于下列條件反應(yīng)：42 60 min，70 10 min，產(chǎn)物即為cDNA. （4）實(shí)時(shí)熒光定量PCR：反應(yīng)

9、體系在美國(guó)iQ5 RealTime PCR儀上進(jìn)行,采用25 L反應(yīng)體系，其中含SYBR GREEN PCR mix 12.5 L,去離子水10.5 L，cDNA 1 L（50 ng）,引物（5 mmol/L）各1 L. PCR擴(kuò)增條件為：95 10 s預(yù)變性；95 5 s，57 15 s，72 10 s，共40個(gè)循環(huán). 取待測(cè)cDNA樣品，按10倍濃度梯度稀釋，在同樣反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制作目的基因和管家基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)擴(kuò)增效率.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用GraphPad Prism 4.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析. 計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析及LSDt檢驗(yàn)，P0

10、.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.1各組模型兔外周血CD34+細(xì)胞百分率的變化冬眠心肌模型兔于術(shù)前、術(shù)后3,7,28 d各時(shí)間點(diǎn)外周血中CD34+細(xì)胞百分率分別為2.66±0.34, 5.16±0.61, 8.69±0.34, 2.73±0.57. 術(shù)后3 d組和7 d組外周血CD34+細(xì)胞百分率高于術(shù)前和術(shù)后28 d組（P<0.01）；術(shù)后7 d組較3 d組為高（P<0.01）；術(shù)后28 d組與術(shù)前比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）.2.2各組模型兔冬眠心肌組織中VEGF mRNA表達(dá)采用相對(duì)定量分析法中比較2-C

11、T法，利用公式F=2-CT得到VEGF mRNA表達(dá)的相對(duì)量. 假手術(shù)和術(shù)后3，7，28 d各組冬眠心肌組織中VEGF mRNA表達(dá)相對(duì)量分別為1.00±0.05, 1.66±0.17, 2.32±0.31, 1.15±0.07. 術(shù)后3 d和7 d組VEGF mRNA表達(dá)量顯著高于假手術(shù)和術(shù)后28 d組（P<0.01）；術(shù)后7 d組高于術(shù)后3 d組（P<0.01）；術(shù)后28 d組與假手術(shù)組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）.3討論干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞替代治療冠心病是近年冠心病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一. 心臟內(nèi)有絲分

12、裂的發(fā)現(xiàn)，使人們認(rèn)識(shí)到心臟內(nèi)有可能存在干細(xì)胞3，新近的研究成果證實(shí)了心肌干細(xì)胞的存在4，眾多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了干細(xì)胞治療缺血性心臟病的作用5. 同時(shí)，應(yīng)用成體多能干細(xì)胞治療缺血性心臟病的臨床試驗(yàn)也取得了振奮人心的結(jié)果6.急性心肌梗死后，骨髓干細(xì)胞在心肌修復(fù)過(guò)程中涉及兩個(gè)環(huán)節(jié). 首先是骨髓干細(xì)胞動(dòng)員、增殖進(jìn)入外周血，其次是骨髓干細(xì)胞向損傷部位的歸巢. 冬眠心肌是由于長(zhǎng)期冠狀動(dòng)脈供血減少產(chǎn)生的可逆性功能障礙狀態(tài)，表現(xiàn)為局部心肌收縮功能持續(xù)低下，其心肌血流量的減少與心肌收縮力的下降維持平衡狀態(tài). 冠脈血流量一旦恢復(fù)，該心肌功能即可部分或完全恢復(fù)，它是心肌功能為適應(yīng)降低的血流量而發(fā)生的匹配性下降，是生存心

13、肌在低灌注下防止自身壞死的自我保護(hù). PTCA和CABG是目前治療冬眠心肌的有效方法7. 目前關(guān)于干細(xì)胞與缺血性心臟病的研究主要集中在心肌梗死，即冠心病的嚴(yán)重類型. 我們提出在心肌處于冬眠狀態(tài)即未發(fā)生心肌梗死時(shí)，機(jī)體是否也存在干細(xì)胞動(dòng)員和歸巢，發(fā)揮內(nèi)源性自我保護(hù)機(jī)制？細(xì)胞因子在細(xì)胞移植治療缺血性心臟病中的作用機(jī)制有：（1）在心臟損傷處作為趨化因子8；（2）誘導(dǎo)移植細(xì)胞分化；（3）促進(jìn)血管生成9. VEGF作為細(xì)胞因子可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成，在生理和病理狀態(tài)下對(duì)于血管新生起著重要作用. 有研究證實(shí)10，心肌梗死后局部微環(huán)境中VEGF表達(dá)增加，將VEGF轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后，壞

14、死心肌周圍的VEGF表達(dá)上調(diào)，同時(shí)觀察到梗死區(qū)血管密度明顯增加.本研究結(jié)果證實(shí)，兔冬眠心肌模型于術(shù)后可發(fā)生骨髓干細(xì)胞動(dòng)員至外周血，且7 d達(dá)到動(dòng)員高峰；同時(shí)觀察到術(shù)后冬眠心肌組織中VEGF基因表達(dá)升高，且于7 d達(dá)高峰. 從中可發(fā)現(xiàn)心肌缺血早期隨著缺血心肌局部VEGF表達(dá)升高，外周血骨髓干細(xì)胞數(shù)量在增加；隨著心肌缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，心肌局部VEGF表達(dá)下降，外周血骨髓干細(xì)胞數(shù)量減少.因此，冬眠心肌早期也存在干細(xì)胞動(dòng)員的自我保護(hù)機(jī)制，并且與心肌缺血局部微環(huán)境的改變有關(guān).【參考文獻(xiàn)】 1 Tse HF, Kwong YZ, Chan JK, et al. Angiogenesis in ischaem

15、ic myocardium by intramyocardial autologous bone marrow mononuclear cell in plantationJ. Lancet, 2003,361(9351):47-49.2 Perin EC, Dohmann HF, Borojevie R, et al. Transendocardial autologous bone marrow cell transplantation for severe chronic ischemic heart failureJ. Circulation,2003,107(18):2294-230

16、2.3 Beltrami AP, Urbanek K, Kajstura J, et al. Evidence that human cardiac myocytes divide after myocardial infarctionJ. N Engl J Med,2001,344(23):1750-1757.4 Oh H, Bradfute SB, Gallardo TD, et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium homing, differentiation, and fusion after infarctionJ.

17、Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100(21):12313-12318.5 Kocher AA, Schuster MD, Szahoks MJ, et al. Neovascularization of ischemic myocardium by human bonemarrowderived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis,reduces remodeling and improves cardiac functionJ. Nat Med,2001,7(4):430-436.6 Strauer BE, B

18、rehn M, Zeus T, et al. Myocardial regeneration after intracoronary transplantation of human autologous stem cells following acute myocardial infarctionJ. Dtsch Med Wochenschr,2001,126(3435):932-938.7 Abbate A, BiondiZoccai G, Agostoni P, et al. Hibernating myocardium, apoptosis, and a simple mathematical taskJ. J Am Coll Cardiol,2004,43(12):2191-2199.8 Ciulla MM, Lazzari L, Pacchiana R, et al. Homing of peripherally injected bone marrow cells in rat after experimental myocardial injuryJ. Haematologica,2003,88:614-621.9