中藥天年飲對衰老大鼠睪丸生精細(xì)胞端粒酶表達(dá)的影響

1、中藥天年飲對衰老大鼠睪丸生精細(xì)胞端粒酶表達(dá)的影響 作者：龐曉靜， 楊振軍， 郭森， 高福祿【關(guān)鍵詞】 天年飲；,衰老；,睪丸；,端粒酶摘要：目的觀察中藥天年飲對衰老大鼠睪丸生精細(xì)胞端粒酶表達(dá)的影響。方法40只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、衰老模型組、天年飲用藥組和陰性對照組，每組均為10只。采用D半乳糖連續(xù)腹腔注射制作亞急性衰老的大鼠模型。ELISA方法檢測各組大鼠血清睪酮含量、黃嘌呤氧化酶法檢測血清超氧化物歧化酶（SOD）的活性、SP免疫組化法檢測睪丸生精細(xì)胞端粒酶的表達(dá)。結(jié)果衰老大鼠血清睪酮含量、SOD活性明顯下降（與正常大鼠相比P<0.05，P<0.01）；衰老大鼠

2、睪丸生精細(xì)胞端粒酶的表達(dá)明顯少于正常大鼠。天年飲可明顯抑制衰老大鼠血清睪酮含量、SOD活性的下降（用藥組與模型組相比P<0.05，P<0.01）；并能明顯提高衰老大鼠睪丸生精細(xì)胞端粒酶的表達(dá)。結(jié)論 中藥天年飲可明顯改善衰老大鼠睪丸生精細(xì)胞端粒酶的表達(dá)，具有一定延緩衰老的作用。關(guān)鍵詞：天年飲； 衰老； 睪丸； 端粒酶Effects of Traditional Chinese Medicine Tiannianyin on Telomerase Expression of Spermatogenic Cells in Testis of Aging RatsAbstr

3、act：ObjectiveTo observe the effects of traditional Chinese medicine Tiannianyin on telomerase expression of spermatogenic cells in testis of aging rats. Methods40 SD rats were applied in this study and divided into 4 groups at random: normal group, aging model group, Tiannianyin group, negative cont

4、rol group, and each group had 10 rats. The subacutely aging model rats were made by injecting Dgal into abdominal cavity continously. ELISA was used to detect the testosterone content in serum, xanthine oxidase method to detect the superoxide dismutase (SOD) activity in serum, SP immunohistochemistr

5、y to observe the telomerase expression of spermatogenic cells in testis. ResultsThe testosterone content and SOD activity in serum of aging rats decreased significantly compared with normal rats (P<0.05, P<0.01); the telomerase positive cells of aging rats were much less than normal ra

6、ts. Tiannianyin could inhibit the decreasing of testosterone content and SOD activity in serum significantly (Tiannianyin group compared with aging model group: P<0.05, P<0.01), and increase the telomerase expression significantly. ConclusionTraditional Chinese medicine Tiannianyin can

7、 improve the telomerase expression of spermatogenic cells in testis, and has fairly antiaging effects.Key words：Tiannianyin; Aging; Testis; Telomerase 隨著年齡的增長，睪丸的結(jié)構(gòu)和功能會出現(xiàn)一個由盛到衰的演變過程，發(fā)生精子生成能力減弱、血游離睪酮含量下降等變化。天年飲(由我院中醫(yī)系主任賈春華教授提供) 具有補(bǔ)肝腎、益精血、延年益壽之功效。本實驗采用D半乳糖致亞急性衰老的大鼠模型, 觀察天年飲對衰老大鼠血清睪酮含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性及睪

8、丸生精細(xì)胞端粒酶表達(dá)的影響, 以期揭示天年飲延緩衰老的作用機(jī)理。1 材料與方法1.1 動物的選擇及分組實驗選用4 月齡雄性SD 大鼠40 只(由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部提供),體重180250 g。將40 只大鼠隨機(jī)分為4組：正常組、衰老模型組、天年飲用藥組和陰性對照組, 每組均為10 只。其中模型組、用藥組、陰性對照組均采用D半乳糖連續(xù)腹腔注射(200 mg/kg，1次/d, 共40 d) 制作亞急性衰老的大鼠模型。模型組大鼠于造模成功后不再作任何處理；用藥組大鼠于造模成功后每天用天年飲灌胃,共30 d；陰性對照組大鼠在造模成功后每天灌胃同等劑量的生理鹽水,時間同用藥組大鼠。1.2 藥品及試

9、劑天年飲由何首烏、懷牛膝、肉蓯蓉、淫羊藿、丹參、茯苓6味中藥組成, 經(jīng)熬制后每毫升含生藥1.5 g按8.1 g/kg灌胃。D半乳糖，北京化學(xué)試劑公司生產(chǎn)（批號：020402），用生理鹽水配成5%的溶液。檢測血清睪酮含量的ELISA試劑盒、端粒酶免疫組化試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司。檢測血清SOD活性的試劑盒購自南京建成生物工程公司。1.3 指標(biāo)的檢測1.3.1 血清睪酮含量的檢測大鼠經(jīng)內(nèi)眥取血, 離心取上清，采用ELISA方法檢測大鼠血清睪酮含量。1.3.2 血清SOD活性的檢測大鼠經(jīng)內(nèi)眥取血, 離心取上清，采用黃嘌呤氧化酶法檢測大鼠血清SOD的活性。1.3.3 睪丸生精細(xì)胞端粒酶表達(dá)的

10、觀察2.5%戊巴比妥腹腔注射（0.3 ml/100 g）麻醉大鼠， 4%多聚甲醛灌注固定，取雙側(cè)睪丸入4%多聚甲醛后固定。將固定好的組織塊經(jīng)常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。Leica石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，片厚5 m，每隔20張取蠟帶貼于涂有APES的載玻片上。SP免疫組化染色（一抗為兔抗端粒酶1100）顯示生精細(xì)胞內(nèi)端粒酶的表達(dá)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。陰性對照用PBS代替一抗。以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色粗顆?；蚣?xì)膩顆粒彌漫分布為陽性反應(yīng)。1.4 統(tǒng)計處理計數(shù)資料采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。2 結(jié)果2.1 血清睪酮含量 結(jié)果見表1。由表中可見，與正常大鼠相比，衰老大鼠血清睪酮含量明顯降低(P&

11、;lt;0.01),天年飲可明顯抑制衰老大鼠血清睪酮含量的下降, 用藥組與模型組比較差異顯著(P<0.01)。2.2 血清SOD活性見表1。由表中可見，與正常大鼠相比，衰老大鼠血清SOD活性明顯下降（P<0.05），天年飲可明顯抑制衰老大鼠血清SOD活性的下降，用藥組與模型組比較差異顯著(P<0.05)。表1 各組大鼠血清睪酮含量及SOD活性（略）與正常組比較，*P<0. 01, # P<0. 05；與模型組比較，*P<0.01，# P<0.05；n=102.3 睪丸生精細(xì)胞端粒酶的表達(dá)情況 各組

12、大鼠睪丸端粒酶免疫陽性細(xì)胞多為精子細(xì)胞，免疫陽性產(chǎn)物呈彌散狀，主要位于細(xì)胞核，為強(qiáng)陽性表達(dá)，另外精子細(xì)胞的胞漿也可見端粒酶免疫陽性產(chǎn)物，但反應(yīng)比較弱、量比較少，結(jié)果見圖1。正常組大鼠端粒酶染色由圖2可見生精小管近管腔側(cè)有許多密集的精子細(xì)胞核著色；模型組大鼠見圖3，著色的精子細(xì)胞數(shù)明顯少于正常組大鼠；天年飲用藥組大鼠見圖4，陽性精子細(xì)胞數(shù)明顯增多。圖1 正常大鼠生精細(xì)胞 端粒酶的表達(dá)（×1000）（略） 圖2 正常大鼠生精細(xì)胞 端粒酶的表達(dá)（×400）（略）圖3 衰老大鼠生精細(xì)胞 端粒酶的表達(dá)（×200） （略） 圖4 用藥大鼠生精細(xì)胞 端粒酶的表達(dá)（×2

13、00）（略）3 討論睪酮的分泌受下丘腦垂體的調(diào)節(jié)，在維持生精功能、刺激生殖器官的生長發(fā)育、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成(特別是肌肉和生殖器官的蛋白質(zhì)合成)方面起重要作用；它還參與神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)，并且與三大物質(zhì)代謝、抗氧化、各種應(yīng)激反應(yīng)等密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)性類固醇激素能改變成年動物神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)1、增加動物下丘腦視前區(qū)神經(jīng)元樹突的長度2；雄激素還可以減少線粒體質(zhì)子漏而促進(jìn)線粒體氧化偶聯(lián)，亦可通過刺激基因表達(dá)調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)各種酶的活性，從而促進(jìn)ATP的生成和利用3。Vermeulen等4報道衰老時下丘腦促性腺激素釋放激素(GnRH)神經(jīng)元減少，GnRH分泌量下降，同時垂體促性腺激素細(xì)胞的體積密度隨年

14、齡增加進(jìn)行性下降并且對GnRH刺激反應(yīng)性下降，在下丘腦、垂體衰老變化的共同作用下，老年男性Leydig細(xì)胞功能降低，使睪酮合成和分泌能力下降，導(dǎo)致老年人血清中睪酮水平降低5。由于線粒體呼吸耗氧量占機(jī)體總耗氧量的90%，所以線粒體是活性氧（ROS）的主要生成場所，線粒體在產(chǎn)生能量的同時生成ROS。在正常生理情況下，體內(nèi)存在清除自由基的防御系統(tǒng)，它包括SOD、谷胱甘肽過氧化物酶等，還有一些抗氧化物質(zhì)VE、VC等。隨著年齡增長，這些抗氧化防御體系活性降低，清除自由基能力下降，使體內(nèi)ROS生成過量，引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松、核酸鍵斷裂與多聚核糖體解聚等多種變化，導(dǎo)致衰老的發(fā)生6。研究表明，SOD活性下降與衰

15、老有密切關(guān)系7，它的含量減少或活性降低被認(rèn)為是衰老的一項重要指標(biāo)。端粒（Telomere）是真核細(xì)胞染色體末端一段特殊的DNA蛋白質(zhì)復(fù)合體，在維護(hù)染色體的完整性，防止DNA降解、染色體缺失及抵御細(xì)胞內(nèi)各種蛋白酶對染色體末端的異常操作有重要作用，并參與染色體在細(xì)胞核內(nèi)的定位及基因表達(dá)調(diào)控8。端粒的長短和穩(wěn)定性決定了細(xì)胞的壽命，并與衰老和癌變密切相關(guān)。影響端粒長度的因素很多，主要有端粒結(jié)合蛋白、端粒帽蛋白、端粒酶等，其中端粒酶是重要的延長端粒的因素。Ichiyoshi等9在研究時發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞端粒嚴(yán)重縮短和端粒酶功能不足可以使細(xì)胞凋亡增加，并且他們認(rèn)為端粒的縮短和端粒酶活性的下調(diào)是細(xì)胞凋亡的觸發(fā)器；Z

16、hang等8的研究認(rèn)為，端粒酶活性的提高可以使細(xì)胞增殖增加，反之可以使凋亡增多。睪丸組織細(xì)胞成分比較復(fù)雜，在正常睪丸組織中部分生精細(xì)胞（精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞）即可以表達(dá)端粒酶活性10，并且各級生精細(xì)胞中端粒的長度是不同的，從精原細(xì)胞到精母細(xì)胞再到精子細(xì)胞，端粒是逐漸延長的。Kang等11的研究發(fā)現(xiàn)，24月齡大鼠與6月齡大鼠相比，血清睪酮含量和睪丸組織端粒酶活性明顯下降，同時端粒酶組分之一的TP1的mRNA水平也相應(yīng)下降，因此認(rèn)為端粒酶活性是年齡依賴性的，隨著年齡增加逐漸降低。素問・金匱真言論有記載：“夫精者，身之本也”，并認(rèn)為“天癸竭，精少，腎藏衰，形體皆極”是衰

17、老的主要原因, 所以歷代醫(yī)家多用補(bǔ)腎為主的方藥來延年益壽。天年飲由劉河間宣明論方何首烏丸加味而成。何首烏丸本由何首烏、肉蓯蓉、懷牛膝組成，能填精補(bǔ)髓、烏發(fā)延年。于此基礎(chǔ)上加淫羊藿補(bǔ)腎壯陽以強(qiáng)筋骨，丹參活血化瘀以通心脈，茯苓健脾利濕以寧心神。諸藥相配通調(diào)心脾肝腎四臟，而以腎為主。本研究發(fā)現(xiàn)，天年飲可明顯提高衰老大鼠血清睪酮含量、SOD活性，并可明顯改善衰老大鼠睪丸生精細(xì)胞端粒酶的表達(dá)，說明天年飲可顯著改善衰老大鼠睪丸的功能，具有良好的延緩性腺衰老的作用。參考文獻(xiàn)：1 Motta PM. Ultrastructure of endocrine cell and tissueM. Boston: M

18、artiuus Nijhoff Publishers, 1984：12.2 Lu KH, Hopper BR, Vargo TM, et al. Chronological changes in sex steroid, gonadotropin and prolactin secretion in aging female rats displaying different reproductive stateJ.Biol Reprod, 1979，21(1):193.3 Lukianora LD, Bobyleva V, Loschmava D, et al. The effect of

19、various steroid hormones on Ca2+ transport and oxidative metobolism in isolated mitochondriaJ.Biull Eksp Biol Med, 1994, 118(12):616.4 Vermeulen-A, Kaufman-JM. Ageing of the hypothalamopituitary-testicular axis in menJ. Horm Res. 1995;4(1-3)：25.5 Chen H, Hardy MP, Hhtaniemi I, et al. Age-related dec

20、reased Leydig cell testosterone production in the Brown Norway ratJ. J Androl. 1994;15(6):551.6 Vohra BP, Sharma SP, Kansal VK. Age-dependent variations in mitochondrial and cytosolic antioxidant enzymes and lipid peroxidation in different regions of central nervous system of guinea pigsJ.Indian J Biochem Biophys, 2001,38(5):321.7 Inal ME, Kanbak G, Sunal E. Antioxidant enzyme activities and malondialdehyde levels related to agingJ.Clin Chim Acta, 2001,305(1-2):75.8 Zhan