免疫組化的原理和步驟

1、免疫組織化學(xué)的概念：免疫組化是利用抗原與特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原 （多肽和蛋白質(zhì)），對其進(jìn)行定位、定性及 定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)。免疫組化實驗所用的有哪些？免疫組化實驗中常用的抗體為單抗體和多抗體。單抗體是一個B淋巴細(xì)胞分泌的抗體，應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動物制備.多克隆抗體是將純化后的抗原直接免疫動物后，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。免疫組化實驗所用的組織和細(xì)胞標(biāo)本有哪些？實驗所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組

2、織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法，對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對組織 內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進(jìn)行抗原修復(fù)，是免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法。石蠟切片為什么要做抗原修復(fù) ？有哪些方法？石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，使得細(xì)胞內(nèi)抗原形成醛鍵、竣甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。所以要求在進(jìn)行IHC染色時，需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯(lián)破壞， 而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。 常用的抗原修復(fù)方法有微波修復(fù)法 ，高壓加熱法，酶消

3、化法，水煮加熱法等，常用的修復(fù)液是pH6.0 的0。01 mol/L 的檸檬酸鹽緩沖液。免疫組化常用的染色方法有哪些？根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標(biāo)法，親和組織化學(xué)法，后者是以一種物質(zhì)對 某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗體）在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位，其中生物素一一抗生物素染色法最常用?？贵w交叉反應(yīng)的原因：指抗體除與其相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性反應(yīng)外還與其它抗原發(fā)生反應(yīng)。產(chǎn)生的原因有以下幾個方面：1 .抗原特異性指用于免疫動物的抗原性物質(zhì)中含有多種抗原分子，它引起動物產(chǎn)生針對 多種抗原分子特異性的相應(yīng)抗體。任何其它物質(zhì)只要含有一種或多種與上述

4、物質(zhì)相同的抗原分子，必將與上述多特異性的抗血清發(fā)生交叉反應(yīng)。2 .共同決定簇即兩種抗原分子中都含有相同的抗原決定簇。3 .決定簇相似，兩種不同的抗原決定簇，如果結(jié)構(gòu)大致相同，由于空間構(gòu)象關(guān)系，某一決定 簇的相應(yīng)抗體可以與大致相同的決定簇發(fā)生交叉反應(yīng)。當(dāng)然抗原一抗體之間構(gòu)象相似時的結(jié)合力小于吻合時的結(jié)合力。免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)一、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的概述* 免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry , ICC ）-是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定細(xì)胞內(nèi)抗原的成分（主要是多肽和蛋白質(zhì)），對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，

5、稱為。(一) 對抗原和抗體的要求*具有特異性高和親和力強的抗體是實驗成功的首要條件。一對抗體的要求：純度高、比活性強；*高度特異性抗體的獲得，取決于抗原的純度.- 對抗原的要求：純度高，免疫原性強，穩(wěn)定無變化。(二)抗原(antigen , Ag)- 抗原的概念：凡是在機體內(nèi)引起體液免疫和(或)細(xì)胞免疫反應(yīng)的物質(zhì)，稱為抗原?？?原具有兩個方面的特性：- 免疫原性：引起機體產(chǎn)生抗體和(或)致敏淋細(xì)胞的特性；免疫反應(yīng)性：抗原能與相應(yīng)的抗體及致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異的結(jié)合或反應(yīng)的特性。*根據(jù)抗原是否顯示免疫原性分為：-完全抗原：分子量較大，一般在10kDa以上，并具有較復(fù)雜的化學(xué)組成。*免疫原性最強的是

6、蛋白質(zhì)抗原，多糖次之；脂類和核酸必需和蛋白質(zhì)及多糖形成復(fù)合物 才具有良好的免疫原性。一半抗原：又稱為不完全抗原，分子量較小。例如：某些短肽、多糖、類脂和藥物等。*半抗原必需與載體結(jié)合，才能獲得免疫原性。載體：通常是具有高度免疫原性的大分子物質(zhì)，具有將免疫原性傳遞給耦聯(lián)的半抗原能 力。-常用的載體有鑰孔血藍(lán)蛋白 (keyhole limpet hemocyanin , KLH )、牛血清白蛋白 (bovine serum albumin, BSA) 、卵白蛋白(Ovalbumin , OVA)等。-用戊二醛或碳化二亞胺作為交聯(lián)劑通過功能基團(tuán)一NH2、-COOH等將半抗原結(jié)合到載體上。結(jié)合比例為5

7、kDa結(jié)合525個分子的小肽。(三)抗體(antibody , Ab)1、抗體的概念：*機體受到抗原刺激后，由漿細(xì)胞合成并分泌出一類具有與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋 白，被稱為抗體。- 抗體主要存在于血清內(nèi)；一抗體都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗體。- 免疫球蛋白根據(jù)重鏈的結(jié)構(gòu)及抗原特異性不同分為五種，既 IgG、 IgD、IgE、 IgA、 IgM。2、免疫組化實驗中常用的抗體：單克隆抗體和多克隆抗體。- 單克隆抗體：是一個B淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體， 是應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動物制 備的.- 特異性強、抗體產(chǎn)量高。*多克隆抗體：是將純化后的抗原直接免疫動物后，從動物血中所獲得的免

8、疫血清，是多 個B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。一特異性低，會產(chǎn)生抗體的交叉反應(yīng).-多克隆抗體廣泛應(yīng)用于石蠟包埋組織切片，可減少假陰性染色機會。-抗原與抗體的結(jié)合，要求量保持一定比例，當(dāng)抗原或抗體過量時，是不能聚合成大顆粒.3、抗體的制備-多克隆抗體的制備*動物的選擇* 佐劑(adjuvant )*免疫方法* 免疫劑量*抗體效價的測定* 放血或定期抽血(1)動物的選擇選擇什么動物來免疫取決于：* 所需抗血清的量一小鼠只能提供1.01.5ml的血液，而山羊能提供幾升.*能供免疫用的抗原量- 小鼠50 g足夠，而山羊需要幾毫克。(1)動物的選擇(續(xù))- 動物的品系：免疫動物與提供抗原的動物之間的

9、種系差異越大越好。- 例如哺乳動物的抗原可選擇非哺乳動物來制備抗體。- 常用的動物有兔、羊、馬、豬等，以兔(新西蘭兔，年輕，健壯，體重在 2.5kg左右，雄性)為最常用。(2 )佐劑(adjuvant)- 一般可溶性抗原注射后，迅速從注射部位擴(kuò)散、吸收代謝。佐劑可延長潴留時間，且延 長免疫刺激作用。因此在制備抗體的過程中，常將抗原和佐劑一起注射。* 最常用的佐劑是弗氏佐劑，又分為：一弗氏不完全佐齊U (Freund ' s incomplete adjuvant )-弗氏完全佐齊U (Freund's complete adjuvant)弗氏不完全佐劑(Freund's

10、 incomplete adjuvant, FIA)* 是由油劑(石蠟油或植物油)與乳化劑(羊毛脂或Tween80 )混合而成，比例為1:1、2:1、3:1或5 : 1 ,可根據(jù)需要而定，通常 2:1 。* 使用時與水溶性抗原按1 : 1比例充分混合，使抗原分散在佐劑中形成油包水乳劑。弗氏完全佐劑(Freund' s complete adjuvant, FCA)* 在弗氏不完全佐劑中加入活卡介苗或死的結(jié)核分枝桿菌(終濃度為220mg/ml ),即成為FCA。*免疫動物時，將弗氏佐劑與抗原按體積1:1混合乳化后(油包水)注入動物。-一般首次注射時用完全佐劑乳化，第二次或第三次注射時用不

11、完全佐劑或不用佐劑。 佐劑與抗原乳化的方法*研磨法：適于制備大量的佐劑抗原-先將不完全佐劑加熱，取1.73ml放人無菌玻璃研缽內(nèi)；緩緩?入0.23ml活卡介苗，邊滴邊按同一方向研磨，使菌體完全分散.一按同樣方法滴人抗原，每加一滴應(yīng)研磨至小滴消失.滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，應(yīng)成為乳白色粘稠的油包水乳劑。*缺點：研缽壁上粘附大量乳劑，抗原損失較大，對微量或難得抗原不宜采用。佐劑與抗原乳化的方法（續(xù)）*注射器混合法-將等量的完全佐劑和抗原分別吸人兩個5ml注射器內(nèi)，然后插入三通管內(nèi)，交替推動針管混勻，往復(fù)操作直至形成粘稠的乳劑為止。*優(yōu)點：無菌操作，節(jié)省抗原或佐劑。*缺點：不易乳化，時間

12、長 .佐劑與抗原乳化的方法（續(xù)）*快速乳化法：利用超聲波粉碎器可快速乳化抗原和佐劑混合物一將抗原和佐劑按所需量加入一中，置于超聲波粉碎器上，粉碎頭浸入液面下0.5cm ,離瓶底0.5cm 左右，以免打碎。* 每次乳化1015s,然后置冰箱lmin左右.反復(fù)乳化34次即可完全乳化。管內(nèi)殘余 量800r/min 離心510min 收集。* 優(yōu)點：簡單、快速、節(jié)省材料。乳化劑的鑒定* 判斷乳化是否充分，可將一滴乳化好的液體滴在水面上（冷水中），如能長時間保持圓珠形而不散開，表示乳化達(dá)到要求。（3 ） 免疫方法免疫途徑* 常有靜脈、腹腔、肌肉、皮下、皮內(nèi)、淋巴結(jié)、腳掌等注射。* 一般采用多點注射方法*

13、 常在足、掌、腋窩淋巴結(jié)周圍、背部兩側(cè)、頜下、耳后等處的皮內(nèi)或皮下。* 皮內(nèi)易引起細(xì)胞免疫反應(yīng)，有利于提高抗體的效價。（3）免疫方法-免疫途徑（續(xù)）*幾點說明：- 大動物一般不用腹腔注射- 顆?？乖褪褂米魟r不能靜脈注射- 抗原寶貴可采用淋巴結(jié)內(nèi)微量注射法，只需10100 g抗原即可獲得較好的免疫效果。- 皮內(nèi)注射較困難，特別是天冷時更難注入。（3）免疫方法一一次數(shù)及間隔時間* 次數(shù)一般為23次（初次免疫和加強免疫 ）一首次注射后，1015 天再加強注射；一劑量同首次或為首次的一半，用不全佐劑或不用佐劑* 間隔時間，一般而言，動物越大，間隔越長一豚鼠、大鼠為78天，兔子為1015天，羊為14

14、28天；一第三次注射的間隔時間更長些，效果更好.舉例1 :家兔的免疫* 初次免疫一用50200 g Ag加入FCA ,在背部皮下注射 68點，每點0。10。2ml,也可肌肉 內(nèi)或皮內(nèi)注射；*兩周后，加強免疫-將50200 g Ag于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、靜脈或腹腔內(nèi)注射；*抗體效價的檢測：加強免疫一周后，耳緣靜脈采血- 抗體效價測定可用環(huán)狀沉淀試驗、瓊脂雙向擴(kuò)散法等方法。前者抗體效價在1 : 4000以上，后者在1 : 16以上，即可采血，取血清進(jìn)一步提純。舉例2:微量抗原淋巴結(jié)內(nèi)注射免疫家兔- 一般選擇2。53。0kg的新西蘭種公兔- 先在其兩腳墊注射完全福氏佐劑0.2ml（卡介苗

15、每兔合5mg ）;-10天后，見胭窩淋巴結(jié)腫大，然后將抗原注射至腫大的淋巴結(jié)內(nèi)，第一次注射抗原用完全福氏佐劑混合乳化；一以后每隔20天用不完全福氏佐劑乳化抗原，以同樣方法加強 2次,各次注射的抗原均為25 50 g ;-末次注射兩周后兔耳放血測價（可達(dá)1:128）。舉例3:豚鼠和大鼠的免疫*初次免疫一用10100 g Ag加入FCA,在背部皮內(nèi)注射 46點，每點0。lml ,也可肌肉內(nèi)或 皮下注射；*加強免疫一每隔78天，將1050 g Ag于PBS或FIA中。在肌肉、皮下或靜脈注射；*抗體效價的檢測（4 ） 免疫劑量*抗原性強的抗原量應(yīng)小，過大反會引起免疫抑制；*免疫周期長的動物可少量多次注

16、射，短的可大量少次。（4）免疫劑量（續(xù)）*各種動物首次免疫抗原劑量和加強免疫的劑量（5）抗體效價的檢測多采免疫雙向擴(kuò)散法【基本原理】*指抗原和抗體在同一凝膠內(nèi)都擴(kuò)散，彼此相遇后形成特異性的沉淀線 .一將抗原與抗體分別加入同一凝膠板中兩個相隔一定間距的小孔內(nèi)，使兩者進(jìn)行相互擴(kuò)散，當(dāng)抗原抗體濃度之比相適宜時，彼此相遇形成一白色弧狀沉淀線。*優(yōu)缺點：簡便，但敏感性較低，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。免疫雙向擴(kuò)散法的操作步驟*將玻璃板用水洗凈后用 75 %乙醇沖洗，晾干后放在水平臺上備用。*將1%agar 融化后，置56 c水浴。* 在玻璃板上鋪膠，約 1.5mm 厚，凝固后打孔（直徑 3rnm）,孔間距10mm

17、。* 中心孔加5 l抗原樣品，周圍孔內(nèi)每孔加5 l抗血清（抗體預(yù)先作系列倍比稀釋即1:2、1:4、1 : 8、1 : 16、1 : 32 等比例）。* 凝膠板置濕盒內(nèi)，室溫擴(kuò)散24h。* 觀察結(jié)果。抗體效價檢測的其它方法* 環(huán)狀沉淀試驗，需較多的抗血清，現(xiàn)已很少用；* 對流免疫電泳，比瓊脂免疫雙擴(kuò)散法敏感，較簡便、實用；* 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA ）。放血或定期抽血常用以下3種方法* 頸動脈放血法：放血量較多 ，動物不易中途死亡。例如： 2.5kg白兔可放血約80ml。家 兔、山羊、綿羊等動物采血常用此法。* 心臟采血法：常用于家兔、豚鼠、大白鼠、雞等小動物，但操作不當(dāng)易引起動物死亡。*

18、 靜脈采血：家兔可用耳緣靜脈采血；山羊、綿羊、馬和驢可用頸靜脈采血，這種放血法可隔日1次，有時可采集多量血液。放血或定期抽血（續(xù)）* 采血過程中，動作要輕柔，盡量避免溶血*血液凝固后，及時離心收集血清，否則細(xì)胞溶解釋放的雜蛋白（例如蛋白水解酶）將污染抗體并將抗體水解，降低效價；*加疊氮化鈉，分裝，低溫保存，也可加一定的保護(hù)劑如BSA、甘油等。二、組織和細(xì)胞標(biāo)本的制備*標(biāo)本制備恰當(dāng)，是免疫組化成功的首要條件- 免疫組化對組織和細(xì)胞標(biāo)本的要求- 保持所檢標(biāo)本原有的結(jié)構(gòu)、形態(tài)；- 在原位最大程度地保持待測抗原 （或抗體）的免疫活性，既不淬滅、流失或彌散，也不被 隱蔽。*免疫組化的組織和細(xì)胞標(biāo)本，制作

19、流程與常規(guī)處理方法基本相同，但對組織、細(xì)胞的處理又有其特殊要求及注意事項 一各種抗原由于其含量及特性的差異對標(biāo)本處理方式常有不同要求，因此要選擇適用于本實驗的最佳方法。免疫組化中常用的組織和細(xì)胞標(biāo)本*組織標(biāo)本- 石蠟切片- 冰凍切片- 細(xì)胞標(biāo)本- 組織印片一片（細(xì)胞爬片）一細(xì)胞涂片（一）石蠟切片*石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法-最大優(yōu)點是組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；-石蠟塊還能長期存檔，供回顧研究。*石蠟切片制作過程對組織內(nèi)抗原顯現(xiàn)有一定的影響，但可通過某些措施予以改善，因而它是大多數(shù)免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法。1、取材的特殊要求及注意事項*標(biāo)本新

20、鮮：一般在2h以內(nèi)進(jìn)行，超過2h ,組織將有不同程度的自溶，其抗原或變性消失， 或嚴(yán)重彌散.*取材部位：除取病灶或含待檢抗原部位外，還應(yīng)取病灶與正常交界處，即所取組織切片中同時應(yīng)有抗原陽性和陰性區(qū)，以形成自身對照- 細(xì)胞壞死后，不僅抗原彌散或消失，而且常引起非特異著色，干擾觀察，因此取材時應(yīng) 盡可能避開壞死區(qū)。1、取材的特殊要求及注意事項 （續(xù)）- 避免擠壓：取材時組織受擠壓可使邊緣部細(xì)胞形態(tài)改變并加深非特異著色，因而取材時應(yīng)使用鋒利的刀刃；- 鐐?cè)〗M織動作要輕；一經(jīng)窺鏡直接鉗取的組織往往有過度擠壓，觀察結(jié)果時應(yīng)有所考慮。2、固定及常用的固定液*取材后的組織需立刻投于固定劑中一固定使組織和細(xì)胞

21、的蛋白質(zhì)凝固，終止內(nèi)源性或外源性酶反應(yīng)，防止組織自溶或異溶，以保持原有結(jié)構(gòu)和形態(tài)；一對免疫組化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或彌散。*常用固定液：固定劑品種很多，但大多屬于醛類和醇類.其固定原理不同，各有優(yōu)缺點。一醛類（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）一醇類（常用乙醇）-其它（丙酮）（1）醛類*甲醛（福爾馬林）應(yīng)用最廣* 原理：形成分子間的交聯(lián)，影響蛋白構(gòu)型而使之固定。* 優(yōu)點：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，且穿透性強，組織收縮少* 缺點：* 甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色；* 醛基與抗原蛋白的氨基交聯(lián)形成竣甲基，使抗原決定簇的三維構(gòu)象出現(xiàn)空間障礙；* 分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能

22、部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結(jié)果。一注意事項：* 縮短固定時間，降低固定溫度（4 C）,為此組織塊不宜過厚。* 改用中性緩沖福爾馬林，以pH值7。27.4 0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液配制成 10 %甲醛固定液，減少固定液 pH的變化。* 固定后充分水洗以減少分子間交聯(lián)。*切片在作免疫組化染色前，先經(jīng)預(yù)處理使抗原再現(xiàn)（抗原修復(fù)）。*戊二醛：穿透性強，微細(xì)結(jié)構(gòu)保存好，但對抗原有一定影響，常與其他固定劑聯(lián)合用作免疫電鏡固定液。*多聚甲醛（常用4%）:一可用于免疫電鏡；也可用于免疫熒光染色.*主要檢測組織內(nèi)一些性能嬌弱的抗原特別是細(xì)胞表面抗原，例如各類淋巴細(xì)

23、胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等。(2)醇類*最常用的醇類固定劑是乙醇。-其固定作用：使細(xì)胞內(nèi)蛋白、糖類發(fā)生沉淀。一優(yōu)點：穿透性強、抗原性保存好。一缺點：*脫水性強，易引起組織收縮、變硬，影響切片質(zhì)量，因而乙醇固定時間不宜過長(2h內(nèi))。*乙醇使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而 減弱反應(yīng)強度。(3) 其它固定劑*丙酮：-對抗原性的保存好，但脫水性更強，較少 用于組織標(biāo)本，但細(xì)胞爬片常用丙酮固定.3、抗原修復(fù)原因*常規(guī)的石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，結(jié)果使得：一抗原性物質(zhì)形成醛鍵、竣甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇；一蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。*

24、 要求：在染色時，需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。3、抗原修復(fù)-方法*化學(xué)方法* 加熱方法一水浴加熱法* 微波照射法* 高壓加熱法一酸水解法(1)化學(xué)方法* 主要是通過一些酶的作用，使抗原決定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。一胰蛋白酶：一般使用濃度為 0。05 %0.1 %,消化時間為37 C,1040min ,主要用 于細(xì)胞內(nèi)抗原的顯示；* 胃蛋白酶：一般使用濃度為0。1%0.4 %,消化時間為 37 C、30180min ,主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示。* 例如：Laminin 、CollagenIV(2)水浴加熱法*將玻片放入裝有抗原修復(fù)液的容器中，加熱至沸騰，持續(xù)1015分鐘。優(yōu)點：操作簡單、經(jīng)濟(jì)，適用于所有的實驗室，一缺點：對封閉牢固的抗原決定簇暴露不理想。(3)微波照射法*將玻片放入裝有抗原修復(fù)液的容器