S20135417-肖春林-小麥外源染色體片段鑒定方法比較

1、小麥外源染色體片段鑒定方法比較肖春林 S20135417作物摘要：對(duì)5種鑒定小麥背景中1BL/1RS易位染色體的生化和分子標(biāo)記方法，包括酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE)、熒光原位雜交(FISH)、RAPD、特異性PCR標(biāo)記、和RELP，進(jìn)行比較研究。結(jié)果表明，5種方法中除了RAPD標(biāo)記難以鑒定1BL/1RS易位染色體，其他方法都能對(duì)1BL/1RS易位染色體進(jìn)行有效的鑒定。RFLP和FISH方法比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力且花費(fèi)昂貴，特異性PCR標(biāo)記又在一定程度上受模板DNA濃度的影響。因此認(rèn)為，酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE)方法是一種簡單、快速、經(jīng)濟(jì)有效的方法，最易于在小麥育種選擇中應(yīng)用。關(guān)鍵詞

2、：小麥；1BL/1RS易位染色體；特異性PCR標(biāo)記；A-PAGE；FISH； RFLP；RAPDAbstract：For five kinds of appraisal 1BL/1RS translocation chromosomes in wheat background of biochemical and molecular marker method, including acid polyacrylamide gel electrophoresis (A-PAGE), fluorescence in situ hybridization (FISH), RAPD, specific

3、 PCR markers, and RELP, A comparative study.The results showed that RAPD markers are difficult to identify 5 ways, in addition to 1BL/1RS translocation chromosomes, other methods can effectively of the 1BL/1RS translocation chromosomes of identification.RFLP and FISH method is time-consuming and exp

4、ensive, specific PCR markers and to a certain extent, affected by the concentration of template DNA.Therefore believe that acid polyacrylamide gel electrophoresis (A-PAGE) method is A simple, rapid, economic and effective method, the most easy to application in wheat breeding selection.Key words: Wh

5、eat;1BL/1RS translocation chromosomes ;Specific PCR markers;A - PAGE;The FISH; RFLP;RAPD在全世界范圍內(nèi)，1BL/1RS小麥一黑麥易位系作為優(yōu)異基因資源在小麥改良中廣泛利用。這主要是由于1BL/1RS易位染色體的1RS片段上不但具有抗條銹病(Yr9)、葉銹病 (Lr26)、稈銹病(St31)和白粉病(Pm8)等抗病基因,還攜帶有提高小麥產(chǎn)量和增強(qiáng)小麥對(duì)環(huán)境適應(yīng)性的基因。在四川省1998-1999年省區(qū)試的24個(gè)優(yōu)良新品系中20個(gè)新品系含有1BL/1RS易位染色體,可見1BL/1RS易位染色體對(duì)四川的小麥改良仍

6、具有重要的作用。許多方法可用于鑒定小麥背景中1BL/1RS易位染色體，包括形態(tài)學(xué)標(biāo)記、抗性反應(yīng)、生化標(biāo)記，細(xì)胞學(xué)鑒定，基因組原位雜交、PCR標(biāo)記等。廣大小麥育種者最關(guān)心的是選用一種快速、經(jīng)濟(jì)、簡單易行的方法來對(duì)雜種后代群體進(jìn)行有效鑒定。Javornik等對(duì)幾種鑒定小麥背景中1BL/1RS易位染色體的細(xì)胞學(xué)和生化標(biāo)記方法進(jìn)行比較研究，認(rèn)為N-帶技術(shù)是最費(fèi)時(shí)費(fèi)力的一種方法,而生化標(biāo)記則是比較簡單快速的方法。90年代以后,伴隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展與成熟,又出現(xiàn)了一些鑒定小麥背景中1BL/1RS易位染色體的分子標(biāo)記方法，如熒光原位雜交(FISH)和特異性PCR標(biāo)記等。本研究的目的是對(duì)酸性聚丙烯酰胺凝膠

7、電泳(A-PAGE)、熒光原位雜交(FISH)、RAPD、特異性PCR標(biāo)記、和RFLP等5種鑒定小麥背景1BL/1RS易位染色體方法進(jìn)行比較研究，以便為育種者選用1BL/1RS易位染色體的鑒定方法提供理論依據(jù)。一、材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料主要包括秦嶺黑麥、多小穗小麥10-A、普通穗型小麥品系88-1643、Aurora、川育12、中國春、以及來源于三交組合10-A/88-1643/川育12后代的一些穩(wěn)定株系。1.2 方法1.2.1 酸性聚丙烯酰氨凝膠電泳（A-PAGE）使用ISTA于1986年頒布的APAGE(pH3.2)標(biāo)準(zhǔn)程序，電泳分析醇溶蛋白位點(diǎn)GLd1B3。Sozinovc1

8、al將GLidlB3這組醇溶蛋白位點(diǎn)定為小麥背景中1R的標(biāo)記位點(diǎn)。利用該標(biāo)記位點(diǎn)來判斷是否含1BL/1RS易位染色體。1.2.2 熒光原位雜交(FISH) 利用直接原位雜交法，以中國春總DNA作為封阻DNA，將已標(biāo)記好的黑麥基因組DNA作探針與根尖有絲分裂細(xì)胞染色體進(jìn)行原位雜交。熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，拍照。 1.2.3 特異性PCR檢測 選用3對(duì)小麥背景中1RS的特異PCR標(biāo)記和1對(duì)黑麥1RS基因組特異性SSR引物，對(duì)供試材料進(jìn)行分析。反應(yīng)總體積25L，其中含1U TaqDNA聚合酶(MBI)、1×buffer、1.5mMMgCl2、200MdNTPs、65rig引物和20-200n

9、g模板DNA。擴(kuò)增程序?yàn)?4預(yù)變性2min，接著40個(gè)循環(huán)。每循環(huán) 為94 1min、60 lmin、72 2min。最后72延伸10min。NOR、RIS和J0713對(duì)引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，黑麥1RS的SSR引物SCM9由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所揚(yáng)足君博士提供。擴(kuò)增產(chǎn)物在2.0或3的瓊脂糖凝膠中電泳，EB染色檢測。1.2.4 RFLP分析取生長旺盛的幼苗葉片提取植株的總DNA含量。DNA的提取、酶解、跑電泳、Southern轉(zhuǎn)移、探針標(biāo)記、雜交以及洗膜都采用魏育明等的方法。共選用13個(gè)已定位于第1同源群上的探針，均為單拷貝，進(jìn)行Southern分析。1.2.5 RAPD分析選用O

10、peron公司10堿基引物A、D、E、G、C，五組共100條，按照Welsh和MeClelland的方法進(jìn)行RAPD分析，擴(kuò)展產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳，EB染色檢測。二、結(jié)果與分析 2.1 三種鑒定方法的有效性 2.1.1 APAGE分析 采用APAGE方法，對(duì)秦嶺黑麥、Aurora、10-A、雅安矮10號(hào)、88-1643、川育12、異源2號(hào)和95-75分析發(fā)現(xiàn)。Aurora、10-A、88-1643、異源2號(hào)和95-7 5具有1BL/1RS易位染色體，而雅安矮10號(hào)和川育12則不含1BL/1RS易位染色體。在這些材料中，Aurora是1個(gè)含1BL/1RS易位染色體的前蘇聯(lián)著名面包小麥品種。這說明

11、APAGE方法能對(duì)小麥背景中1BL/1RS易位染色體進(jìn)行有效鑒定。利用APAGE方法，對(duì)三交組合10-A/88-1643/川育12后代的一些穩(wěn)定株系進(jìn)行 分析發(fā)現(xiàn),95-69等株系也具有1BL/1RS易位染色體。 2.1.2 熒光原位雜交(FISH) 利用普通小麥中國春的總DNA作封阻DNA(封阻DNA：探針DNA=1：50)，以熒光紅標(biāo)記的黑麥基因組DNA作探針，與95-69根尖有絲分裂細(xì)胞染色體進(jìn)行原位雜交。結(jié)果表明，在根尖細(xì)胞有絲分裂的問期和中期，均能清晰地觀察到標(biāo)記的探針與95-69染色體的雜交信號(hào)，說明95-69中含有黑麥染色體片段。同時(shí)在有絲分裂的中期細(xì)胞中，還可清晰地觀察到黑麥的

12、核仁組成染色體的短臂(1RS)易位到95-69中，而在其它染色體上未檢測到黑麥的染色體片段存在。這些結(jié)果說明，熒光原位雜交能對(duì)95-69的1BL/1RS易位染色體進(jìn)行有效鑒定。 2.1.3 特異性PCR標(biāo)記檢測 分別以20、60、100、150和200ng的中國春和異源2號(hào)總DNA為模板，對(duì)NOR、RIS、J07I和SCM-9進(jìn)行引物特異性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4對(duì)引物中除1對(duì)黑麥1RS的R引物SCM-9對(duì)模板DNA不敏感外，均能得到1RS的特異性DNA擴(kuò)增片段，而中國春未出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物。在其它3對(duì)引物中，當(dāng)模板DNA為150和200ng時(shí)，在中國春中也能擴(kuò)增出與異源2號(hào)相同分子量的DNA片段。只是存

13、在強(qiáng)弱差異。表明選3對(duì)引物對(duì)模板DNA較為敏感，模扳DNA濃度太高時(shí)，會(huì)出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。因此，用這3對(duì)引物來鑒定小麥背景中的1RS染色體片段時(shí)，DNA的準(zhǔn)確定量是關(guān)鍵。 2.1.4 RFLP分析選用13個(gè)位于第1同源群染色體上的RFLP探針，對(duì)中國春、黑麥、88-1643、川育12、10-A等5個(gè)材料的基因組DNA的4種限制性內(nèi)切酶的限制性酶解片段進(jìn)行Southern分析。結(jié)果表明，所有小麥第1部分同源群染色體短臂上的11個(gè)RFLP探針都可以檢測到黑麥1RS的特異限制性片段的存在，它取代了缺失的10-A、88-1643中1BS特異限制性片段。并且，在中國春、川育12號(hào)中1BS特異限制性片段并沒

14、有發(fā)生缺失，因此就沒有出現(xiàn)黑麥特異限制性片段。位于小麥第1部分同源群染色體長臂的2個(gè)探針在各種限制性內(nèi)切酶/探針組合中，4個(gè)小麥材料都沒有發(fā)生特異限制性片段的缺失，也沒有出現(xiàn)黑麥特異限制性片段。利用RFLP標(biāo)記對(duì)三交組合后代進(jìn)行Southern分析，發(fā)現(xiàn)異源2號(hào)、95-69、95-75等株系都具有1BL/1RS易位染色體。這些結(jié)果表明，RFLP標(biāo)記能有效鑒定小麥背景中的1BL/1RS易位染色體。2.1.5 RAPD分析選用Operon公司10堿基引物A、D、E、G、C等共五組100條，對(duì)黑麥、88-1643、川育12號(hào)、10-A的總DNA為模版，使用華美生物工程公司、上海生工生物工程公司生產(chǎn)的

15、Tap DNA聚合酶進(jìn)行RAPD擴(kuò)增。結(jié)果表明，在所選擇的所有RAPD引物中，沒找到黑麥1RS的特異DNA擴(kuò)增片段。這說明，很難用RAPD來標(biāo)記小麥背景中的1BL/1RS易位染色體。2.2 幾種鑒定小麥背景中的1BL/1RS易位染色體的方法比較 在本研究中共采用特異性PCR標(biāo)記；A-PAGE；FISH；RFLP；RAPD等5種方法來鑒定小麥背景中的1BL/1RS易位染色體,除了RAPD標(biāo)記外，其他4種方法均能鑒定小麥背景中1BL/1RS易位染色體。從實(shí)驗(yàn)操作難易程度、實(shí)驗(yàn)花費(fèi)和耗時(shí)方面來看，RFLP和FISH標(biāo)記技術(shù)不但實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，需要一定的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，而且花費(fèi)昂貴、周期較長；其它3種方法操作

16、簡單且周期較短。從檢測時(shí)期來看,APAGE和FISH能在播種前完成,真正做到外源染色質(zhì)檢測與育種間有效結(jié)合；其他的三種方法只能在苗期才能完成。APAGE與特異性PCR標(biāo)記相比,在特異性PCR標(biāo)記檢測中部分引物對(duì)模扳DNA的量有一定要求。如果模扳DNA過量則易出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。由此可見,這幾種鑒定1BL/1RS易位染色體的方法中,對(duì)多數(shù)育種者來說,APAGE是一種最經(jīng)濟(jì)有效的檢測方法,最易于在育種選擇中應(yīng)用。 三、討論Javornik等對(duì)鑒定小麥背景中1BL/1RS易位染色體的N-帶技術(shù)和其他3種蛋白質(zhì)電泳方法間進(jìn)行比較研究，認(rèn)為蛋白質(zhì)電泳技術(shù)是最為簡便有效的方法。在本研究中，通過對(duì)4中分子技術(shù)和

17、1種蛋白質(zhì)電泳技術(shù)(APAGE)進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，APAGE是1種最經(jīng)濟(jì)有效的檢測方法，最易于在育種選擇中應(yīng)用。雖然1BL/1RS易位染色體具有抗條銹病(Yr9)、葉銹病(Lr26)、稈銹病(Sr31)和白粉病(Prn8)等抗病基因，還攜帶有提高小麥產(chǎn)量和增強(qiáng)小麥對(duì)環(huán)境適應(yīng)性的基因；但是1BL/1RS易位染色體對(duì)小麥面包烘烤品質(zhì)具有不良效應(yīng)。因此，育種者的育種目標(biāo)不同，對(duì)該染色體的選擇就不同。如果以優(yōu)質(zhì)為主要育種目標(biāo)，育種者就期望在選擇的優(yōu)良株系中不含1BL/1RS易位染色體。相反，如果以高產(chǎn)、抗病為主要育種目標(biāo)。那么1BL/1RS易位染色體就是育種者所要選擇的對(duì)象。利用APAGE方法，育種者

18、一方面能在播種前采用半粒法進(jìn)行選擇，縮小播種量，以達(dá)到標(biāo)記選擇與育種相結(jié)合；另一方面利用該方法還能從F2代開始對(duì)分離群體進(jìn)行早化選擇，大大縮短育種年限、提高育種效率。 參考文獻(xiàn)：1 Rabinovich S V Importance of wheat-rye translocations for breedingmodern cultivar of Triticum aestivum L.J.Euphytica.1998,100:323-304.2 蘭秀錦，魏育明，劉登才等.四川小麥優(yōu)良新品系醇溶蛋白分析J.四川農(nóng) 業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,18(1):21-24.3 魏育明,鄭有良,周榮華等.應(yīng)

19、用熒光原位雜交和RELP標(biāo)記檢測多小穗小麥新品種10-A中的黑麥染色質(zhì)J.植物學(xué)報(bào),1999,41(2):722-725.4 Porceddu E,Ceoloni C,Lafiandra D,Tanzarella O,Scarascia A,Mugnozza G T.Genetic resources and plant breeding:problems and prospects. In:Miller T E, Koebner R M D eds. Proc. 7th Inter Wheat Genet Symp,Bath, UK: Bath Press, 1988.7-21.5 鄭有良,

20、蘭秀錦,魏育明等.導(dǎo)入黑麥異源基因選育大穗型超高產(chǎn)小麥新品種 研究J.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1997,152:166-171.6 Jiang J,Fribe B,Gill B S. Recent advance in alien gene transfer in wheat. Euphytica, 1994,73:199-212.7 魏育明,鄭有良,周永紅等.異源2號(hào)和綿陽26號(hào)在分子水平上的差異性研究J.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2000,13(2):1-5.8 魏育明等.幾種鑒定小麥背景中1BL/1RS易位染色體的分子標(biāo)記方法比較研究J.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,19(1):1-3.9 John H,B

21、irnstiel M, Jones K. RNA:DNA hybrids at the cytological level. Nature,1969,223:582-587.10 Pardue M L,Gall J G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparation.Proc Natl Acad Sci USA,1969,64:600-60411 Zhang H，Jia J-Z. Derection of rye chromatin by using fluorescence i

22、n situ hybridization.Sci Agric Sin,1996,29(2):90-93.12 Zheng Y-L,Yen C,Yang J-L.Location of genes for grain weight in common wheat. Acta Agro Sin,1993,19:304-308.13 Zheng Y-L,Yen C. Effect of chromosomes on grain yield per plant in common wheat multispikelet line 10-A.Hereditas,1994,16(4):27-30.14 Z

23、heng Y-L,Yen C,Yang J-L. Monosomic analysis for total and sterile floret number per spike in the multispikelet line 10-A of common wheat. Wheat Infor Ser,1993,77:25-28.15 Yan Q-C,Huang Y-J,Xu Y. Cultivar identification of barley and wheat with standard reference method from International Seed Testing Association. Acta Agro Sin,1992,18:61-68.16 Sozinv A A, Novoselskaya A Yu, Lushnikova A A, Bogdanov Yu F. Cytological and biochemical analysis of bread wheat variant with 1B/1R substitutions and translocations in karyotype. Tsitologi