瓊脂糖凝膠電泳

1、瓊脂糖凝膠電泳1.原理瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳最主要區(qū)別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時(shí)會(huì)受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當(dāng)大，對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)來說其分子篩效應(yīng)微不足道，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中。蛋白質(zhì)和核酸會(huì)根據(jù)pH不同帶有不同電荷，在電場(chǎng)中受力大小不同，因此跑的速度不同，根據(jù)這個(gè)原理可將其分開。電泳緩沖液的pH在69之間，離子強(qiáng)度0.020.05為最適。常用1%的

2、瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達(dá)107bp的DNA片段。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動(dòng)。2操作流程準(zhǔn)備干凈的配膠板和電泳槽瓊脂糖凝膠電泳：水平電泳注意DNA酶污染的儀器可能會(huì)降解DNA，造成條帶信號(hào)弱、模糊甚至缺失的現(xiàn)象。(1)電泳

3、方法一般的核酸檢測(cè)只需要瓊脂糖凝膠電泳就可以；如果需要分辨率高的電泳，特別是只有幾個(gè)bp的差別應(yīng)該選擇聚丙烯酰胺凝膠電泳；用普通電泳不合適的巨大DNA鏈應(yīng)該使用脈沖凝膠電泳。注意巨大的DNA鏈用普通電泳可能跑不出膠孔導(dǎo)致缺帶。(2)凝膠濃度對(duì)于瓊脂糖凝膠電泳，濃度通常在0.52%之間，低濃度的用來進(jìn)行大片段核酸的電泳，高濃度的用來進(jìn)行小片段分析。低濃度膠易碎，小心操作和使用質(zhì)量好的瓊脂糖是解決辦法。注意高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易分辨，造成條帶缺失現(xiàn)象。(3)緩沖液常用的緩沖液有TAE和TBE，而TBE比TAE有著更好的緩沖能力。電泳時(shí)使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。注意電

4、泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產(chǎn)生條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。三羥甲基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)aminomethane，一般簡(jiǎn)稱為Tris）是一種有機(jī)化合物，其分子式為(HOCH2)3CNH2。Tris被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的緩沖液的制備。例如，在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的TAE和TBE緩沖液（用于核酸的溶解）都需要用到Tris。(4)電壓和溫度電泳時(shí)電壓不應(yīng)該超過20V/cm，電泳溫度應(yīng)該低于30，對(duì)于巨大的DNA電泳，溫度應(yīng)該低于15。注意如果電泳時(shí)電壓和溫度過高，可能導(dǎo)致出現(xiàn)條帶模糊和不規(guī)則的DNA

5、帶遷移的現(xiàn)象。特別是電壓太大可能導(dǎo)致小片段跑出膠而出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象(5)DNA樣品的純度和狀態(tài)注意樣品中含鹽量太高和含雜質(zhì)蛋白均可以產(chǎn)生條帶模糊和條帶缺失的現(xiàn)象。乙醇沉淀可以去除多余的鹽，用酚可以去除蛋白。注意變性的DNA樣品可能導(dǎo)致條帶模糊和缺失，也可能出現(xiàn)不規(guī)則的DNA條帶遷移。在上樣前不要對(duì)DNA樣品加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋可以防止DNA變性。(6)DNA的上樣正確的DNA上樣量是條帶清晰的保證。注意太多的DNA上樣量可能導(dǎo)致DNA帶型模糊，而太小的DNA上樣量則導(dǎo)致帶信號(hào)弱甚至缺失。(7)Marker的選擇DNA電泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正對(duì)照DNA來估計(jì)D

6、NA片段大小。Marker應(yīng)該選擇在目標(biāo)片段大小附近ladder較密的，這樣對(duì)目標(biāo)片段大小的估計(jì)才比較準(zhǔn)確。需要注意的是Marker的電泳同樣也要符合DNA電泳的操作標(biāo)準(zhǔn)。如果選擇DNA/HindIII或者DNA/EcoRI的酶切Marker，需要預(yù)先65加熱5min，冰上冷卻后使用。從而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接頭導(dǎo)致的片段連接不規(guī)則或條帶信號(hào)弱等現(xiàn)象。(8)凝膠的染色和觀察實(shí)驗(yàn)室常用的核酸染色劑是溴化乙錠（EB），染色效果好，操作方便，但是穩(wěn)定性差，具有毒性。注意觀察凝膠時(shí)應(yīng)根據(jù)染料不同使用合適的光源和激發(fā)波長(zhǎng)，如果激發(fā)波長(zhǎng)不對(duì)，條帶則不易觀察，出現(xiàn)條帶模糊的現(xiàn)象。3回

7、收編輯(1)DNA片段的膠回收方法電泳洗脫法低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳挖塊法凍融回收法玻璃奶回收法柱回收法(2)膠回收注意事項(xiàng)a.將電泳槽用ddH2O反復(fù)清洗干凈，倒入新鮮配制的滅菌電泳緩沖液；b.根據(jù)點(diǎn)樣量制備合適厚度的瓊脂糖凝膠板；c.切膠時(shí)盡可能切掉不含DNA片段的凝膠；d.要盡量減少DNA在紫外下的照射時(shí)間以減少對(duì)DNA的損傷；e.熔膠要完全。loading bufferloading buffer 的中文名字叫上樣緩沖液，6*的緩沖液中可以顯示兩條帶，前面的紫蘭色的條帶是溴酚藍(lán)，在0.6%、1%、1.4%和2%瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚蘭的遷移率分別與1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15K

8、b的雙鏈線性DNA片段大致相同；后面的蘭色條帶是二甲苯青，它在1%和1.4%瓊脂糖中電泳時(shí)，其遷移速率分別與2Kb和1.6Kb的雙鏈線性DNA大致相似。而對(duì)于PAGE膠他們的遷移速率也分別不同。1.主要用途loading buffer的功能主要有兩個(gè)：第一，里邊的指示劑溴酚藍(lán)和二甲苯青FF起到指示的作用，顯示電泳的進(jìn)程，以便我們適時(shí)終止電泳；第二，里邊的成分甘油可以加大樣品密度，使樣品密度大于TAE，從而沉降到點(diǎn)樣孔中，防止樣品飄出點(diǎn)樣孔。另外，有的Buffer是加有SDS的，一般都會(huì)寫明。SDS主要是促使聚合酶變性，因?yàn)闆]有除盡的聚合酶會(huì)結(jié)合在DNA雙鏈上影響它的遷移速率。細(xì)胞裂解后的裂解液

9、，加loading 100加熱，也是為了中止酶促反應(yīng)，防止提取的蛋白質(zhì)降解。2.制備方法 loading buffer 一般配置：(1) 6×Loading buffer:30mM EDTA36%(v/v) Glycerol0.05%(w/v) Xylene Cyanol FF0.05%(w/v) Bromophenol Blue主要用于DNA電泳(2) 10×Loading buffer:30mM EDTA50%(v/v) Glycerol0.25%(w/v) Xylene Cyanol FF0.25%(w/v) Bromophenol Blue主要用于RNA電泳注：（1

10、）10×loading buffer中僅有色素溴酚藍(lán)（Bromophenol Blue)一種染料（濃度0.05%）； （2）6×loading buffer中含色素溴酚藍(lán)（Bromophenol Blue)、二甲苯青藍(lán)FF（Xylene Cyanol FF)兩種染料（濃度都是0.05%） 在瓊脂糖凝膠（0.5% 1.4%）中溴酚藍(lán)（Bromophenol Blue）約與300 bp的雙鏈線狀DNA的遷移速度相同，二甲苯腈藍(lán)FF則與4 kbp的雙鏈線狀DNA的遷移速度相等。6×loading buffer是用來上樣的；10×loading buffer是s

11、top buffer，是停止酶促反應(yīng)的，如果一定要用10×loading buffer的上樣當(dāng)然也可以，唯一要注意的是：10×loading buffer中多了一樣SDS，它會(huì)使酶類如taq酶變性，以PCR產(chǎn)物為例，在電泳泳道上會(huì)產(chǎn)生一片彌散，如果電泳跑的距離短，和多出來一條帶沒有什么區(qū)別（大概1000bp左右）。(3) 5×SDS-PAGE Loading Buffer配制方法組份濃度：250mM Tris-HCl（pH6.8）10%（W/V） SDS0.5%（W/V） BPB50%（V/V） 甘油5%（W/V） -巰基乙醇配制量： 5mL配

12、制方法：1.量取下列試劑，置于10mL塑料離心管中。1M Tris-HCl 1.25mLSDS（ 十二烷基硫酸鈉 ） 0.5gBPB（溴酚藍(lán)） 25mg甘油 2.5mL2.加入去離子水溶解后定容至5mL。3.小份（500l/份）分裝后，于室溫保存。4.使用前將25l的2-ME加到每小份中。5.加入2-ME的Loading Buffer可在室溫下保存一個(gè)月左右16S 核糖體RNA1.簡(jiǎn)介16S 核糖體RNA（16S ribosomal RNA，或簡(jiǎn)稱為 16S rRNA）是1 分。16S rRNA的長(zhǎng)度約為1,542 nt。一個(gè)細(xì)菌的細(xì)胞中可包含多種具有不

13、同序列的16S rRNA已知16S rRNA具有如下幾項(xiàng)功能：16S rRNA具有與原核生物核糖體大亞基中的23S rRNA相似的結(jié)構(gòu)決定功能，可作為核糖體蛋白質(zhì)結(jié)合的架構(gòu)。在足量Mg2+存在下分離到的16S rRNA處于緊密狀態(tài)，其空間結(jié)構(gòu)與30S 亞基的大小和形狀十分相似。16S rRNA的3'端含有能與mRNA上游AUG起始密碼子通過氫鍵結(jié)合的反夏因-達(dá)爾加諾序列。另有發(fā)現(xiàn)表明，16S rRNA中1,5051,539的CCUCC序列與mRNA的相應(yīng)序列有互補(bǔ)關(guān)系。16S rRNA能通過氫鍵與23S rRNA結(jié)合，增強(qiáng)原核生物70S 核糖體一大一小兩個(gè)亞基（50S 亞基與30S 亞

14、基）結(jié)合時(shí)的穩(wěn)定性。16S rRNA能通過其1,492及1,493的腺嘌呤殘基（參見嘌呤分子結(jié)構(gòu)圖解）的N1原子與mRNA骨架上的2'OH基團(tuán)之間產(chǎn)生氫鍵，使核糖體A位密碼子反密碼子的堿基互補(bǔ)配對(duì)穩(wěn)定化。2.通用前體由于不同種的真細(xì)菌與古細(xì)菌間的16S rRNA基因（16S rDNA）是高度保守的，16S rDNA常被用于對(duì)各種生物進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)方面的研究這種運(yùn)用16S rRNA對(duì)生物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究的方法由卡爾·沃斯（Carl Woese）開創(chuàng)。另外，線粒體和葉綠體中的rRNA也都被擴(kuò)增了。 在獲得能提供系統(tǒng)發(fā)育學(xué)信息的16S rRNA分子時(shí)需要利用通用PCR引物對(duì)16

15、S rRNA分子進(jìn)行擴(kuò)增。 16S rRNA序列的對(duì)比分析需要在這類“通用引物”的脫氧核糖核酸分子的輔助下完成，這類分子具有如下序列：8UA正向：5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3'519B反向：5-GTA TTA CCG CGG CKG CTG-3'反向：ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT這類引物因并未在近期發(fā)現(xiàn)的幾種屬于納古菌門（Nanoarchaeota）的熱液古菌中分離識(shí)別出來，也被稱為準(zhǔn)通用引物。3.進(jìn)化指征在眾多的生物大分子中，最適合于提示各類生物親緣關(guān)系的是rRNA,尤其是16S rRNA被普遍認(rèn)為是一把好的譜系的“分子尺”這是因?yàn)椋海?） rRNA參與生物蛋白質(zhì)的合成過程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物進(jìn)化的漫長(zhǎng)經(jīng)歷中其可能保持不變。（2）在16S rRNA分子中，既含有高度保守的序列區(qū)域又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，因而它適用于進(jìn)化距離不同的各類生物。（3） 16S rRNA相對(duì)分子質(zhì)量大小適中，便于分析