蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究現(xiàn)狀與展望

1、學(xué)院畢業(yè)論文論文題目：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究現(xiàn)狀與展望學(xué)生院（系）名稱 專業(yè)名稱 年級班級 指導(dǎo)教師 指導(dǎo)教師職稱雪化學(xué)與化工學(xué)院生物制藥技術(shù)2009級2班磊山副教授容摘要 1關(guān) 鍵 詞 1Abstract 1Key words 1前言 21. 蛋白質(zhì)簡介 21.1 蛋白質(zhì)的作用 21.2 蛋白質(zhì)的元素組成與分子組成22. 蛋白質(zhì)的研究32.1 研究方法簡介32.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的方法43. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測53.1 蛋白質(zhì)幾何的表示方法63.2 勢能函數(shù)與勢能搜索方法64. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)64.1 . 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類與比較74.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)確定75. 蛋白質(zhì)相互作用85.1 酵母雙雜交技術(shù)85.2 串

2、聯(lián)親和純化技術(shù)85.3 熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)96. 蛋白質(zhì)折疊機(jī)理的研究96.1 分子生物學(xué)的中心法則與蛋白質(zhì)折疊的研究概況96.2 蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)和動力學(xué)106.3 蛋白質(zhì)折疊與分子伴侶11前景展望11參考文獻(xiàn) 13致 14容摘要：蛋白質(zhì)是一種生物大分子，多是由20 種氨基酸以肽鍵連接成肽鏈。肽鏈再進(jìn)一步空間卷曲折疊成為特定的空間結(jié)構(gòu)，包括二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。有的蛋白質(zhì)由多條肽鏈組成，每條肽鏈稱為亞基，亞基之間又有特定的空間關(guān)系，稱為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。因此蛋白質(zhì)分子往往具有特定的復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)。對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析可以從根本上闡明蛋白質(zhì)功能的分子機(jī)制和基礎(chǔ)，同時也是研究蛋白質(zhì)功能的一個重途

3、徑。 本文將對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究概況以與意義進(jìn)行綜述，并在此基礎(chǔ)之上對今后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究提出了一些自己的看法。關(guān) 鍵 詞： 蛋白質(zhì) 結(jié)構(gòu)研究相互作用折疊Abstract: Proteins are biological macromolecules,mostly from 20 kinds of amino acids connected by peptide bonds into the peptide chain. Further space in the peptide chain folds into a specific space curled structure, includi

4、ng secondary and tertiarystructure. Someof the protein by the number of peptidechains, called subunits of each peptide chain, subunits have specific spatial relationships between the known quaternary structure of proteins. So often with a specific protein complex spatial structure.For protein struct

5、ure analysis can clarify the fundamental mechanism of protein function and molecular basis of protein function is also an important way.This paper will overview the study of protein structure and meaning are reviewed,and on this basis for future studies of protein structure presented some of his vie

6、ws.Key words: Protein structure interaction fold前言人類進(jìn)入21世紀(jì)之際，生命科學(xué)也迎來了一個嶄新的時代。2001年 2月 12日參與人類基因組計劃的六國科學(xué)家共同向世人正式公布了人類基因組圖譜與初步分析結(jié)果， 這是生命科學(xué)史，也是人類科學(xué)史上的又一次飛躍，同時標(biāo)志著后基因組時代的來臨， 但是隨著大量生物體全基因組序列的獲得，人們發(fā)現(xiàn)僅從基因組序列的角度根本無法完整、系統(tǒng)地闡明生物體的功能。蛋白質(zhì)作為生命體的主要組成成分和生命活動的主要執(zhí)行者，正在成為新的研究熱點(diǎn)；而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)則是蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域中的一個重要環(huán)節(jié)。以蛋白質(zhì)為主體的生物大分子的功能主

7、要取決于它們的三維結(jié)構(gòu)、運(yùn)動與相互作用。只有全面了解相關(guān)蛋白質(zhì)與其復(fù)合物、組裝體的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)、運(yùn)動和相互作用網(wǎng)絡(luò)，與其在亞細(xì)胞、細(xì)胞層次上表現(xiàn)出來的生命活動的功能關(guān)系，才能最終闡釋人類個體發(fā)育、生長、 衰老和凋亡機(jī)理，才能在分子和原子水平上理解神經(jīng)活動、認(rèn)知等腦功能表現(xiàn)機(jī)理，細(xì)胞增殖、分化和凋亡機(jī)理，信息傳遞和作用機(jī)理，疾病發(fā)生、發(fā)展機(jī)理等一切生命科學(xué)問題。1 . 蛋白質(zhì)簡介1.1 蛋白質(zhì)的作用蛋白質(zhì)(Protein )是細(xì)胞組分中含量最為豐富、功能最多的高分子物質(zhì)，在生命活動過程中起著各種生命功能執(zhí)行者的作用，幾乎沒有一種生命活動能離開蛋白質(zhì)， 所以沒有蛋白質(zhì)就沒有生命。在人體中，蛋白質(zhì)的

8、主要生理作用表現(xiàn)在六個方面：(1) 構(gòu)成和修復(fù)身體各種組織細(xì)胞的材料；(2) 構(gòu)成酶、激素和抗體；(3) 維持正常的血漿滲透壓，使血漿和組織之間的物質(zhì)交換保持平衡；(4) 供給肌體能量；(5) 維持肌體的酸堿平衡；(6) 運(yùn)輸氧氣與營養(yǎng)物質(zhì)。1.2 蛋白質(zhì)的元素組成與分子組成蛋白質(zhì)是化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的一類有機(jī)化合物，是人體的必須營養(yǎng)素。其主要是由碳、氫、氧、氮、硫、磷、碘、鐵、鋅等元素組成。蛋白質(zhì)分子的基本單位是氨基酸，它是由多種不同的氨基酸通過肽鍵相互連接而成。 蛋白質(zhì)在受到酸、堿或酶的作用下最終水解成氨基酸。組成自然界蛋白質(zhì)的氨基-碳原子上，還有酸主要有20種，具化學(xué)結(jié)構(gòu)具有共同的特點(diǎn)，即在連

9、接竣基的COOHH3-C-H一個氨基，故稱a -氨基酸?？捎孟率奖硎荆篟不同的氨基酸其側(cè)鏈（R）各異。除甘氨酸外，其余氨基酸的a-碳原子均為不對稱碳原子，故有L型或D 型之分。組成天然蛋白質(zhì)的氨基酸，除甘氨酸外，都是L- a-氨基酸。2 .蛋白質(zhì)的研究2.1 研究方法簡介目前蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測方法按照其對模板的依賴與否主要分為兩類：模板依賴模型以與從頭預(yù)測方法（自由模型）。模板依賴模型又可以分為兩種模型：同源模型（比較 模型）和折疊識別模型（穿線法）。兩種方法的差別在于模板的同源度。同源模型所 使用的模板擁有較高的同源度，序列相似度一般大于30 %折疊識別模型所使用的模 板為遠(yuǎn)程同源關(guān)系。兩種方法

10、所采用的預(yù)測步驟基本一致:（1）搜索結(jié)構(gòu)模型的模板： 即為待預(yù)測的蛋白質(zhì)序列尋找具有同源性的已知結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)作為模板。（2）序列比對:將目標(biāo)蛋白質(zhì)的序列與模板蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對，使目標(biāo)序列的氨基酸殘基與模板蛋 白質(zhì)的殘基匹配。（3）建立骨架：將模板結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)拷貝到目標(biāo)序列，僅拷貝匹配殘基 的坐標(biāo)。通過這一步建立目標(biāo)蛋白質(zhì)的骨架。（4）構(gòu)建目標(biāo)蛋白質(zhì)的側(cè)鏈與環(huán)區(qū)：可將 模板相同殘基的坐標(biāo)直接作為目標(biāo)蛋白質(zhì)的殘基坐標(biāo)，對于不完全匹配的殘基，其側(cè)鏈構(gòu)象是不同的，需要進(jìn)一步預(yù)測。其中前兩步是預(yù)測方法的關(guān)鍵。當(dāng)目標(biāo)序列沒有同源結(jié)構(gòu)時，進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測就必須使用從頭預(yù)測方 法。從頭預(yù)測方法預(yù)測蛋白質(zhì)三

11、級結(jié)構(gòu)一般由下列3個部分組成：（1） 一種蛋白質(zhì)幾何的表示方法：由于表示和處理所有原子和溶劑環(huán)境的計算開銷非常大，因此需要對蛋白質(zhì)和溶劑的表示形式作近似處理，例如，使用一個或少數(shù)幾個原子代表一個氨基 酸殘基；（2） 一種勢能函數(shù)與其參數(shù)：或者一個合理的構(gòu)象得分函數(shù)，以便計算各種 構(gòu)象的能量；（3） 一種構(gòu)象空間搜索技術(shù)：必須選擇一個優(yōu)化方法，以便對構(gòu)象空間 進(jìn)行快速搜索，迅速找到與某一全局最小能量相對應(yīng)的構(gòu)象。 其中，構(gòu)象空間搜索和能 量函數(shù)的建立是從頭預(yù)測方法的關(guān)鍵。2.2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的方法蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定方法主要包括 X射線晶體學(xué)、核磁共振波譜學(xué)技術(shù)和三維電鏡重構(gòu)。這三種方法都可以完整獨(dú)立

12、地在原子分辨水平上測定出蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)。2.2.1 X- 射線晶體學(xué)X-射線晶體學(xué)是最早也是最主要的測定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法，第一個蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)一一血紅蛋白的結(jié)構(gòu)就是通過 X-射線晶體學(xué)方法解析的。目前PD葉收錄的蛋白 質(zhì)的結(jié)構(gòu)85%左右是利用X寸線晶體學(xué)方法解析的。蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的X寸線衍射分析 包含樣品制備、蛋白質(zhì)結(jié)晶、衍射數(shù)據(jù)收集和處理、相位求解、模型建立和修正等五 個主要步驟。五個步驟彼此密切相關(guān)，每一個部分取得進(jìn)展可以加快下一步的研究， 同樣任何一個部分的瓶頸也可以成為下一步的限速步驟。其中樣品制備和蛋白質(zhì)結(jié)晶階段是要獲得足夠量的蛋白樣品以與可以用于衍射數(shù)據(jù)收集的高質(zhì)量單晶，前

13、者可以通過針對所選目的基因的特性構(gòu)建和改造高效表達(dá)質(zhì)粒，而后利用多種表達(dá)系統(tǒng)，高質(zhì)量單晶的獲得是蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)研究的主要瓶頸之一，由于不同蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)差別以與各種修飾和相互作用更增加了蛋白質(zhì)的復(fù)雜性，所以不是所有的蛋白質(zhì)都可以獲得單晶的。1990年以后，利用X-射線晶體學(xué)解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，目前 平均每天有15個蛋白質(zhì)通過該方法獲得結(jié)構(gòu)。X-射線晶體學(xué)的缺點(diǎn)是分子在晶體中往 往是被鎖定于某一狀態(tài)，所得到的晶體往往是分子處于基態(tài)或不同構(gòu)象的平均，而分子行使功能時多發(fā)生在激發(fā)態(tài)、過渡態(tài)、X-射線晶體技術(shù)很難捕捉到分子的動態(tài)信息 10但是無論怎樣，X-射線晶體學(xué)方法無論過去、

14、現(xiàn)在或?qū)矶紩堑鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)研究 的主要方法。2.2.2 核磁共振波譜學(xué)核磁共振波譜學(xué)是對X-射線晶體學(xué)的有力補(bǔ)充。目前，該技術(shù)已經(jīng)成為確定生物大分子溶液三維空間結(jié)構(gòu)的主要手段2 。核磁共振波譜學(xué)技術(shù)在蛋白質(zhì)- 蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DN*分子間的相互作用方面，具有高分辨率的特點(diǎn)，僅次于X-射線晶體學(xué)技術(shù)，可以在溶液中操作，在近似蛋白質(zhì)生理環(huán)境下測定其結(jié)構(gòu)，甚至可以對活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，獲得“活”的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。 核磁共振波譜學(xué)技術(shù)在分析蛋白質(zhì)折疊穩(wěn)定性、 運(yùn)動性和蛋白質(zhì)復(fù)合體中各亞基的相互作用方面具有優(yōu)勢。核磁共振波譜學(xué)技術(shù)的缺點(diǎn)是只能測定小蛋白和中等大小的蛋白質(zhì)分子( 相對分子質(zhì)量一般在300

15、00以下 ) ， 并且圖譜分析工作極為費(fèi)時，往往需要數(shù)月到一年的時間，導(dǎo)致實驗周期延長，速度緩慢；另外核磁共振衍射技術(shù)的反應(yīng)是在溶液中進(jìn)行的，研究對象必須是可溶的蛋白， 對不溶蛋白的研究就比較困難；而且樣品需要同位素標(biāo)記等，這些在一定程度上制約了核磁共振波譜學(xué)技術(shù)的應(yīng)用。隨著一些新技術(shù)的發(fā)現(xiàn)，如 G巨陣傅立葉變換式核磁共振波譜學(xué)技術(shù)等，使得核 磁共振波譜學(xué)的發(fā)展速度也很快，目前 PD葉收錄的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)15%左右是利用核 磁共振波譜學(xué)方法解析的，其快速發(fā)展主要?dú)w功于以下幾個方面：儀器技術(shù)的不斷發(fā)展，計算速度的飛速提升和實驗方法上的不斷創(chuàng)新和發(fā)展3 。 1990 年以前平均每年只能解10個結(jié)構(gòu)，

16、現(xiàn)在平均每天可以解2個結(jié)構(gòu)，相信隨著核磁共振波譜學(xué)技術(shù)不斷的改進(jìn)和發(fā)展，核磁共振波譜學(xué)技術(shù)在未來結(jié)構(gòu)生物學(xué)上的貢獻(xiàn)將會越來越大。2.2.3 三維電鏡重構(gòu)電子顯微鏡在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的應(yīng)用近年來變得越來越重要，成為解析大型蛋白質(zhì)復(fù)合體、 病毒乃至細(xì)胞器的三維納米分辨率結(jié)構(gòu)的有力手段，同時電子顯微鏡二維晶體學(xué)在膜蛋白的三維精細(xì)結(jié)構(gòu)解析上也有特殊的優(yōu)勢。冷凍電鏡三維重構(gòu)的基本技術(shù)路線為： 利用快速冷凍技術(shù)對樣品進(jìn)行冷凍固定，然后利用冷凍電鏡和低劑量成像技術(shù)對樣品進(jìn)行電子成像，利用高靈敏底片進(jìn)行成像記錄，利用高分辨率掃描儀對底片進(jìn)行數(shù)字化，對數(shù)字化的圖像進(jìn)行二維圖像分析選點(diǎn)、分類、校正和平均，最后完成樣品

17、的三維重構(gòu)計算。自從 1968 年 DeRosier 和 Klug 第一次用電子顯微鏡對T4噬菌體的尾部進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析至今，已有 140 余種蛋白質(zhì)通過該方法獲得了結(jié)構(gòu)，尤其是最近5 年隨著計算機(jī)圖像處理技術(shù)和顯微鏡設(shè)備的不斷發(fā)展，使得三維電鏡重構(gòu)技術(shù)成為繼X-射線晶體學(xué)和核磁共振波譜學(xué)技術(shù)后，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的另一種重要 方法。三維重構(gòu)技術(shù)的優(yōu)勢在于：(1) 可以直接獲得分子的形貌信息，即使在較低分辨率下，電子顯微學(xué)也可給出有意義的結(jié)構(gòu)信息；(2)適于解析那些不適合應(yīng)用X-射 線晶體學(xué)和核磁共振技術(shù)進(jìn)行分析的樣品，如難以結(jié)晶的膜蛋白、大分子復(fù)合體等；(3) 適于捕捉動態(tài)結(jié)構(gòu)變信息；(4) 易同

18、其他技術(shù)相結(jié)合得到分子復(fù)合體的高分辨率的結(jié)構(gòu)信息；(5)電鏡圖像中包含相位信息，所以在相位確定上要比X-射線晶體學(xué)直接和方便 4 。3. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測3. 1 蛋白質(zhì)幾何的表示方法限制蛋白骨架構(gòu)象中可采取的自由度是在模擬過程中簡化蛋白質(zhì)的一種方法，其中一種限制是Ca只允許位于二維或三維格子（網(wǎng)格）的位置上。這種簡化方法大大減少了一個蛋白質(zhì)可以采取的構(gòu)象數(shù)目。于是，對于一個中等大小的多肽鏈，我們可以對它的構(gòu)象空間進(jìn)行窮舉搜索，直到找到能量全局最小的構(gòu)象。而對于比較長的多肽鏈，簡化的格點(diǎn)模型可以使非窮盡的搜索方法對所有可能的構(gòu)象進(jìn)行較大比例的取樣， 因此可以比較準(zhǔn)確地估計出能量全局最小的構(gòu)象雖然

19、使用格點(diǎn)模型，本身所能達(dá)到的精確度比較低，但是其計算上的優(yōu)點(diǎn)使其在低精度預(yù)測上依然有很大的發(fā)展。4. 2 勢能函數(shù)與勢能搜索方法勢能函數(shù)的構(gòu)建從本質(zhì)上來講可以分兩類：分子力學(xué)方法和統(tǒng)計學(xué)方法。分子力學(xué)方法假設(shè)正確的蛋白質(zhì)折疊對應(yīng)于最低能量的構(gòu)象。分子力學(xué)勢能是原子坐標(biāo)的函數(shù)， 其極小值對應(yīng)于原子體系的局部能量最小點(diǎn)。分子力學(xué)中的勢能參數(shù)有各種來源，包括從頭計算和半經(jīng)驗量子化學(xué)計算結(jié)果、氨基酸和小分子的實驗觀察結(jié)果等。分子力學(xué)應(yīng)用經(jīng)驗勢函數(shù)，即力場方法模擬分子的結(jié)構(gòu)，計算分子的性質(zhì)。盡管計算量很大 , 基于分子力學(xué)的勢能函數(shù)在計算高分辨率結(jié)構(gòu)方面依然有很大的應(yīng)用。另外一種方法就是根據(jù)一些已知結(jié)構(gòu)

20、的蛋白質(zhì)構(gòu)象為一個未知結(jié)構(gòu)的蛋白設(shè)計一個經(jīng)驗性的偽能量函數(shù)。通常， 為得到這種經(jīng)驗性的能量函數(shù)表達(dá)式，我們首先要選擇一系列已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，然后對于每一個氨基酸，采用統(tǒng)計學(xué)方法分析在三維空間上與其相鄰的氨基酸?？梢愿鶕?jù)不同氨基酸的相對位置得到一個得分矩陣。依據(jù)這種方法在計算上非常高效，同樣也可以被用于全原子模型。對于勢能的搜索有多種方法。常用的方法是梯度下降法，其中最陡下降法是一種最基本的優(yōu)化算法。用這種方法可以迅速向極小點(diǎn)靠近，但接近極小點(diǎn)時，會產(chǎn)生振蕩，收斂速度慢。共軛梯度法也是一種基于梯度的方法，其收斂的速度快，但是更容易陷入能量局部極小點(diǎn)。牛頓- 拉普森方法是另一類能量優(yōu)化方法。梯度方

21、法在計算時使用的是一階微分，而牛頓- 拉普森方法除使用一階微分外還計算二階微分。應(yīng)用該方法能夠迅速收斂，但是計算量非常大。蒙特卡羅算法是一種隨機(jī)采樣的方法，通過該方法可以期望找到非常接近于全局能量最優(yōu)的構(gòu)象。5. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)5.1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類人類關(guān)于進(jìn)化的知識與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相似性比較方法的研究使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類成為可能，而且近年來取得的研究進(jìn)展表明大部分蛋白質(zhì)可以成功地分入到適當(dāng)數(shù)目的家族中。目前國際上流行的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類數(shù)據(jù)庫基本上采取兩種不同的思路。一種是數(shù)據(jù)庫中儲存所有結(jié)構(gòu)兩兩比較的結(jié)果。第二種思路是致力于構(gòu)建非常正式的分類體系。 由于所有分類方法反映了各研究小組在探究這個重要領(lǐng)域的不同

22、角度，所以這些方法是同等有效的。目前 , 被廣泛應(yīng)用的四種分類標(biāo)準(zhǔn)是：手工構(gòu)造的層次分類數(shù)據(jù)庫SCOP,全自動分類的MMDB FSSP ,和半手工半自動的CATHIo蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)自動分類問題可以被納入機(jī)器學(xué)習(xí)的疇，通過提取分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵特征，構(gòu)造算法來學(xué)習(xí)蘊(yùn)含于大量已知結(jié)構(gòu)和分類的數(shù)據(jù)中的專家經(jīng)驗知識，來實現(xiàn)對未知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分類預(yù)測。目前， 對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的不同層次分類，結(jié)果比較好的機(jī)器學(xué)習(xí)方法是：神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)多層感知器、支持向量機(jī)和隱馬爾可夫模型。支持向量機(jī)應(yīng)用于分類問題最終歸結(jié)于求解一個最優(yōu)化問題。上世紀(jì)90 年代中期，隱馬爾可夫模型與其他機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)結(jié)合, 高效地用于多重比對、數(shù)據(jù)挖掘和

23、分類、結(jié)構(gòu)分析和模式發(fā)現(xiàn)。多層感知器即誤差反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，它是在各種人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型中，在機(jī)器學(xué)習(xí)中應(yīng)用最多且最成功的采用 BP學(xué)習(xí)算法的分類器805.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的確定蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)確定的主要手段是：X-射線晶體衍分析和核磁共振。蛋白質(zhì) 數(shù)據(jù)庫PD葉80%勺蛋白質(zhì)2構(gòu)是由X-射線衍射分析得到的，約15%勺蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是由 核磁共振這種新的結(jié)構(gòu)測定方法得到。X-射線衍射法的分辨率可達(dá)到原子的水平，使 它可以測定亞基的空間結(jié)構(gòu)、各亞基間的相對拓?fù)洳季?，還可清楚的描述配體存在與否對蛋白質(zhì)的影響。多維核磁共振波譜技術(shù)已成為確定蛋白質(zhì)和核酸等生物分子溶液三維結(jié)構(gòu)的唯一有效手段9 。 核磁共振波譜

24、學(xué)技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)是在于它能對溶液中和非晶態(tài)的蛋白質(zhì)進(jìn)行測量。在晶體結(jié)構(gòu)分析中給定大量結(jié)構(gòu)因子，確定電子密度分布函數(shù)的位相的問題其實就是從圖像分析得到結(jié)構(gòu)坐標(biāo)數(shù)據(jù)過程中出現(xiàn)的數(shù)學(xué)問題。當(dāng)給定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中部分原子的距離時，求解原子坐標(biāo)的方法是將距離空間的約束矩陣轉(zhuǎn)化為坐標(biāo)空間的矩陣， 由坐標(biāo)空間矩陣構(gòu)建蛋白質(zhì)分子的初始矩陣，運(yùn)用模擬退火等算法對初始結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化， 經(jīng)分子動力學(xué)進(jìn)行能量最小化，由此得到一組收斂的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)。關(guān)于蛋白質(zhì)的氨基酸序列分析，到目前為止，最經(jīng)典的蛋白質(zhì)的氨基酸序列分析方法是，Sanger等人基于Edman降解原理研制的液相蛋白質(zhì)序列儀， 與后來發(fā)展的固相和氣相的蛋白

25、質(zhì)序列分析儀。人們通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)和源后衰減基質(zhì)輔助的激光解析6. 蛋白質(zhì)相互作用機(jī)體細(xì)胞每個蛋白質(zhì)并不是獨(dú)立發(fā)揮作用, 通常與其他蛋白質(zhì)相互作用形成較大復(fù)合體 , 在特定的時間和空間行使特定的功能, 構(gòu)成各項生命活動的基礎(chǔ)，因此解決蛋白質(zhì)相互作用問題具有舉足輕重的意義。目前, 用于研究蛋白質(zhì)間相互作用的方法非常多 , 包括酵母雙雜交技術(shù)、串聯(lián)親和純化技術(shù)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、噬菌體表面展示技術(shù)、表面胞質(zhì)團(tuán)共振技術(shù)、免疫共沉淀等等。6.1 酵母雙雜交技術(shù)酵母雙雜交系統(tǒng)是由Field和Song4 1989年研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控時首次發(fā)明,是一種在酵母中利用轉(zhuǎn)錄激活物的重組來鑒定

26、蛋白質(zhì)之間相互作用的方法, 在蛋白質(zhì)相互作用方面扮演著重要角色。真核生長轉(zhuǎn)錄因子具有兩個不同的結(jié)構(gòu)域：DN船合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域, 分別與誘餌蛋白與可能與誘餌蛋白相互作用的獵物蛋白相連 , 并共同轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞。如果兩個蛋白能夠發(fā)生相互作用就能使轉(zhuǎn)錄因子原來分開的兩部分結(jié)合, 從而激活下游報告基因。通過檢測報告基因的表達(dá)產(chǎn)物就可判斷兩種蛋白是否發(fā)生相互作用10。雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白分子間兩兩相互作用的傳統(tǒng)技術(shù),其假陽性率和假陰性率比較高, 所以必須與其他技術(shù)聯(lián)用加以鑒定。6.2 串聯(lián)親和純化技術(shù)串聯(lián)親和純化是近些年來發(fā)展起來的新技術(shù)，與酵母雙雜交系統(tǒng)不同, 此方法可在生理條件下研究多種蛋白質(zhì)

27、復(fù)合物的相互作用，兼具融合蛋白親和色譜法和免疫共沉淀兩種生化方法的優(yōu)點(diǎn)，通過兩步特異性的親和純化可獲得與目的蛋白結(jié)合的高純度蛋白質(zhì)復(fù)合物。該方法首先對目的蛋白進(jìn)行TAPS簽標(biāo)記，標(biāo)簽包括3個部分：蛋白 A、鈣調(diào)素結(jié)合多肽和中間連接的TEVI識別的酶切位點(diǎn)。在蛋白復(fù)合物的分離純化中， 第一步利用與蛋白標(biāo)簽具有親和作用的色譜柱， 采用TEVt白酶斷裂TEVt白酶切位點(diǎn) 的方式洗脫；第二步利用與鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽具有親和作用的鈣調(diào)蛋白色譜柱，將蛋白復(fù)合物和TEg白酶分開，純化出的蛋白復(fù)合物用凝膠電泳、質(zhì)譜技術(shù)或Edma降解法 進(jìn)行鑒定11。TAPJ術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是利用酶切的方法進(jìn)行洗脫，條件溫和，不破壞復(fù)合物

28、 的結(jié)構(gòu)， 并且經(jīng)兩步洗脫，去除了雜蛋白的干擾，提高了蛋白質(zhì)相互作用結(jié)果的可靠性、特異性，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越了酵母雙雜交傳統(tǒng)技術(shù)。6.3 熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的基本原理是處于激活狀態(tài)的供體能在足夠近的距離（ 小于10nm）等本身的熒光傳遞到受體上。因此，用熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)，可以通過熒光體 的能量傳遞來檢測兩蛋白質(zhì)的相互作用。此技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是可以在生理條件下無損傷、動態(tài)地研究蛋白質(zhì)的相互作用，同時還能檢測蛋白質(zhì)在細(xì)胞的定位。但是， 該方法受熒光發(fā)色基團(tuán)空間距離的限制，只能用于研究分子量小于200 kD的蛋白12 o目前隨著計算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，很多研究者運(yùn)用計算分析和構(gòu)建相互作用模型的方法來

29、預(yù)測蛋白質(zhì)相互作用，從而發(fā)現(xiàn)更多未發(fā)現(xiàn)有相互作用的蛋白，但這些發(fā)現(xiàn)的蛋白需要利用以上提到的方法進(jìn)行鑒定?？傊糜谘芯康鞍踪|(zhì)相互作用的方法很多，所有方法都各有千秋，但至今尚無十分理想的方法可以大規(guī)模獲得蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)，故相互作用圖譜有賴于各種研究方法的綜合分析。7. 蛋白質(zhì)折疊機(jī)理的研究長期以來關(guān)于蛋白質(zhì)折疊，形成了自組裝的主導(dǎo)學(xué)說，因此， 在研究新生肽段的折疊時， 就很自然的把在體外蛋白質(zhì)折疊研究中得到的規(guī)律推廣到體，用變性蛋白的復(fù)性作為新生肽段折疊的模型，并認(rèn)為細(xì)胞中新合成的多肽鏈，不需要別的分子的幫助， 不需要額外能量的補(bǔ)充，就應(yīng)該能夠自發(fā)的折疊而形成它的功能狀態(tài)。九十年代一類具有

30、新的生物功能的蛋白，分子伴侶的發(fā)現(xiàn)，以與在更廣泛意義上說的幫助蛋白質(zhì)折疊的輔助蛋白的提出，說明細(xì)胞新生肽段的折疊一般意義上說是需要幫助的，而不是自發(fā)進(jìn)行的。7.1 分子生物學(xué)的中心法則與蛋白質(zhì)折疊的研究概況根據(jù)分子生物學(xué)中心法則，生物遺傳信息的傳遞是由DNAiJ RNA RNA到蛋白質(zhì)多肽鏈、 再由多肽鏈形成具有生物活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行的。目前對前兩者的過程已有相當(dāng)深入和清晰的了解，但對后者尚不十分清楚。因此可以說蛋白質(zhì)折疊是生物學(xué)中心法則中至今尚未解決的一個重大生物學(xué)問題。通過蛋白質(zhì)折疊的研究發(fā)現(xiàn)一級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)之間存在某種確定的關(guān)系，那么是否像核苷酸通過 “三聯(lián)密碼”決定氨基酸順序那樣有一套

31、密碼呢？有人把這設(shè)想的一級結(jié)構(gòu)決定空間結(jié)構(gòu)的密碼叫作“第二遺傳密碼”?，F(xiàn)已經(jīng)觀察出 mRNA勺二級結(jié) 構(gòu)單元數(shù)與其編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)（a -螺旋與 B -折疊）單元數(shù)之間存在明顯 的相關(guān)性，二者的總符合率為97.3%,相關(guān)系數(shù)達(dá)0.99;其次，mRNA!級結(jié)構(gòu)中5， 端至3/端的每一發(fā)夾或復(fù)合發(fā)夾與 PD吸據(jù)庫所提供的蛋白質(zhì)N端至C端的每一個 a螺旋或B折疊之間存在幾乎是一一對應(yīng)的現(xiàn)象。 通過上述數(shù)據(jù)可以看出，mRNA 的三維結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中確實存在某種相關(guān)13。我們知道，多數(shù)蛋白質(zhì)在體外是不穩(wěn)定的，外界環(huán)境的變化，如溫度、酸度等，都可以導(dǎo)致空間結(jié)構(gòu)的破壞和生物活性的喪失，但卻并不破

32、壞它的一級結(jié)構(gòu)，這稱為蛋白質(zhì)的變性。變性的蛋白質(zhì)往往成為一條伸展的肽鏈，由于一級結(jié)構(gòu)仍然完整，根據(jù) Anfinsen 14 原理它應(yīng)該可以在一定的條件下重新折疊成原有的空間結(jié)構(gòu)并恢復(fù)原有的活性。這就是長時間來在體外研究蛋白質(zhì)折疊的基本模型。目前的實驗和理論研究多以小分子量、單鏈蛋白質(zhì)為模擬體系，這類蛋白質(zhì)通常采用稀釋法折疊、復(fù)性，其中研究最多的模型蛋白是溶菌酶15 。7.2 蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)和動力學(xué)蛋白質(zhì)折疊根本的科學(xué)問題是具有完整一級結(jié)構(gòu)的多肽鏈又是如何折疊成為它特定的高級結(jié)構(gòu)？這是一個折疊的動力學(xué)的問題，長期以來，主要用體外的實驗方法研究，雖然已有四五十年，但至今尚未解決。由 Anfin

33、sen 14等根據(jù)對RNase 復(fù)性研究的經(jīng)典實驗提出的 “熱力學(xué)假說”認(rèn)為一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)。他們認(rèn)為天然蛋白質(zhì)多肽鏈所采取的構(gòu)象是在一定環(huán)境條件下熱力學(xué)上最穩(wěn)定的結(jié)果，采取天然構(gòu)象的多肽鏈和它所處的一定溶液組分、PH、 溫度、 離子強(qiáng)度等環(huán)境條件下整個系統(tǒng)的總自由能最低，所以處于變性狀態(tài)的多肽鏈在一定的環(huán)境條件下能自發(fā)折疊成天然構(gòu)象。 “熱力學(xué)假說”提出后，得到了許多實驗證據(jù)的證明，因此得到廣泛支持。Bakei, D.等認(rèn)為，對某些蛋白質(zhì)而言，天然構(gòu)象也許并非是多肽鏈自由能最低狀態(tài)或唯一的低能量狀態(tài)，多肽鏈采取的某些非天然構(gòu)象也很穩(wěn)定。若某一多肽鏈具有兩種低能量狀態(tài)：一種是天然構(gòu)象，一種

34、是非天然構(gòu)象，而且處于這兩種低能量狀態(tài)的多肽鏈相互轉(zhuǎn)變由于要克服較高的能壘而難以實現(xiàn)。 那么在蛋白質(zhì)折疊過程中就會有兩種途徑相互競爭。一種是正確折疊形成天然構(gòu)象的途徑，另一種是錯誤折疊成穩(wěn)定的非天然構(gòu)象的途徑。蛋白質(zhì)多肽鏈之所以能正確折疊是由于一些因素在蛋白質(zhì)折疊的動力學(xué)過程中起著控制作用，促進(jìn)多肽鏈走入正確折疊途徑。蛋白質(zhì)的折疊是遵循“熱力學(xué)假說”的，從高能態(tài)向低能態(tài)轉(zhuǎn)變，但在這個過程中會受到動力學(xué)上的控制，熱力學(xué)控制與動力學(xué)控制在蛋白質(zhì)多肽鏈的折疊反應(yīng)中是統(tǒng)一的，不同的蛋白質(zhì)的折疊過程中所體現(xiàn)出來的二者所起作用大小可能有所不同16。7.3 蛋白質(zhì)折疊與分子伴侶蛋白質(zhì)分子的三維結(jié)構(gòu)，除了共價

35、的肽鍵和二硫鍵，還靠大量極其復(fù)雜的弱次級鍵共同作用。因此新生肽段在一邊合成一邊折疊過程中有可能暫時形成在最終成熟蛋白中不存在不該有的結(jié)構(gòu)，他們常常是一些疏水表面，它們之間很可能發(fā)生本不應(yīng)該有的錯誤的相互作用而形成的非功能的分子，甚至造成分子的聚集和沉淀。按照自組裝學(xué)說，每一步折疊都是正確的，充分的，必要的。實際上折疊過程是一個正確途徑和錯誤途徑相互競爭的過程，為了提高蛋白質(zhì)生物合成的效率的，應(yīng)該有幫助正確途徑的競爭機(jī)制，分子伴侶就是這樣通過進(jìn)化應(yīng)運(yùn)而生的。它們的功能是識別新生肽段折疊過程中暫時暴露的錯誤結(jié)構(gòu)的，與之結(jié)合，生成復(fù)和物，從而防止這些表面之間過早的相互作用，阻止不正確的非功能的折疊途

36、徑，抑制不可逆聚合物產(chǎn)生，這樣必然促進(jìn)折疊向正確方向進(jìn)行。分子伴侶的研究有利于蛋白質(zhì)折疊機(jī)理的探索。其研究成果必然會大大加深我們對生命現(xiàn)象的認(rèn)識，同時也一定會增加我們與自然斗爭的能力和自身生存的能力。由于分子伴侶在生命活動的各個層次都具有重要作用，它的突變和損傷也必定會引起疾病，因此可以期望運(yùn)用分子伴侶的知識來治療所謂的“分子伴侶病”。另一方面，利用對分子伴侶的研究成果從根本上提高基因工程和蛋白工程的成功率，也必將對大幅度提高人類生活水平起重要作用。前景展望根據(jù)預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)大概有2000 種不同的折疊類型，3000 5000 蛋白質(zhì)超家族， 當(dāng)前僅發(fā)現(xiàn)1000 余種不同的折疊類型和1600

37、種蛋白質(zhì)超家族。人類基因組測序研究揭示，人體大約有3 萬個編碼蛋白質(zhì)的基因，這就是說，人類生命過程約需要3萬種不同的基礎(chǔ)蛋白質(zhì)，它們在生命活動中發(fā)揮著重要功能，而這些功能的發(fā)揮則依賴于這些蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。因此， 獲得這些蛋白質(zhì)并闡明它們的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)與與其生物功能的關(guān)系，成為揭示生物體活動本質(zhì)的關(guān)鍵一步。近年來基因組工程的迅猛發(fā)展與生物信息學(xué)的新進(jìn)展，給結(jié)構(gòu)生物學(xué)開創(chuàng)了道路，使此目標(biāo)的實現(xiàn)成為可能。隨著人類基因組計劃的執(zhí)行，找到人類5 萬到 10 萬個基因的堿基序列是指日可待的事， 因而確定人的上千萬個原癌基因和幾萬個與疾病有關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸順序也會逐漸實現(xiàn)。然而要了解它們的功能還必須

38、知道它們的三維結(jié)構(gòu)，且藥物設(shè)計、 基因芯片均需要知道三維結(jié)構(gòu)。當(dāng)前， 雖然眾多技術(shù)為蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測定提供了有效的實驗手段，但蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的增長速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于蛋白質(zhì)序列的增長速度，并且這些方法仍然存在局限性。于是要求現(xiàn)代生物信息學(xué)工作者運(yùn)用數(shù)學(xué)物理思想、方法和計算手段進(jìn)一步研究分子生物機(jī)理，使人類更準(zhǔn)確地掌握蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)知識，從而促進(jìn)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等生命科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究是蛋白質(zhì)研究中的核心容之一，雖然它還處于一個初級發(fā)展階段， 其研究方法和系統(tǒng)還不夠完善，但隨著其不斷深入發(fā)展，相信在揭示諸如生長、發(fā)育和代調(diào)控等生命活動規(guī)律上將會有所突破。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究將為從細(xì)胞和分子水平上

39、探討人類重大疾病的機(jī)制、診斷、 防治和新藥開發(fā)提供重要的理論基礎(chǔ)從而使蛋白質(zhì)科學(xué)研究達(dá)到一個新的高度。參考文獻(xiàn)1 光地，陸長德，金哲元. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究方法進(jìn)展Z. 江南大學(xué)圖書館情報部，2006， 3 (2) ： 4547.2 閻隆飛，之榮. 蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)M. 清華大學(xué), 1997 ， 25( 8) : 131154.3 余亦華 . 蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)研究的里程碑J. 科學(xué)，2003， 55(2) ： 5758.4 王大能， 勇， 隋森芳 . 電子顯微學(xué)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中的新進(jìn)展J. 電子顯微學(xué)報，2003，22(5) ： 449456.5 T. J. Hubbard, B. Ailey, S. E. Brenner, A. G. Murzin and C.Chothia. SCOP: A structural classification of proteins databaseJ. Nucleic Acids Research, 1999, 27(1) : 254256.6 L. Holm and C. Sander. Protein structure comparison by alignment ofd