實(shí)驗(yàn)三、動(dòng)物性食品生物性污染的檢驗(yàn)ppt課件

1、動(dòng)物性食品衛(wèi)生學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物性食品衛(wèi)生學(xué)實(shí)驗(yàn)一一. .生物性污染的來(lái)源生物性污染的來(lái)源p微生物污染微生物污染 (microorganism pollution )(microorganism pollution )p寄生蟲污染寄生蟲污染 (parasitical pollution )(parasitical pollution )p昆蟲污染昆蟲污染 (insectical pollution )(insectical pollution )PathogensSpoilage OrganismsVirusesBacteriumMicroorganismsUnpleasant smell and t

2、asteFungi 內(nèi)源性污染內(nèi)源性污染 外源性污染外源性污染外源性生物性污染是動(dòng)物性食品微生物污染的主要途徑外源性生物性污染是動(dòng)物性食品微生物污染的主要途徑二二. .生物性污染的評(píng)價(jià)目的生物性污染的評(píng)價(jià)目的 菌落總數(shù)菌落總數(shù) 細(xì)菌總數(shù)細(xì)菌總數(shù) 大腸菌群值大腸菌群值MPNMPN 致病菌檢測(cè)致病菌檢測(cè)(PCR(PCR法法) ) 其他其他實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握動(dòng)物性食品菌落總數(shù)、大腸菌群測(cè)定掌握動(dòng)物性食品菌落總數(shù)、大腸菌群測(cè)定及常見致病菌及常見致病菌PCRPCR檢測(cè)的原理、步驟和方法檢測(cè)的原理、步驟和方法 了解動(dòng)物性食品菌落總數(shù)的衛(wèi)生規(guī)范，進(jìn)了解動(dòng)物性食品菌落總數(shù)的衛(wèi)生規(guī)范，進(jìn)展衛(wèi)生斷定展衛(wèi)生斷定

3、 1. 1.鮮乳的微生物學(xué)檢驗(yàn)鮮乳的微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)的測(cè)定菌落總數(shù)的測(cè)定檢檢 驗(yàn)驗(yàn) 處處 理理24 2h或或48 2h36 1 報(bào)報(bào) 告告菌落記數(shù)菌落記數(shù)每皿參與適量營(yíng)養(yǎng)瓊脂每皿參與適量營(yíng)養(yǎng)瓊脂選擇選擇3個(gè)適宜稀釋度，汲取個(gè)適宜稀釋度，汲取1ml參與滅菌平皿參與滅菌平皿作成幾個(gè)倍數(shù)的稀釋液作成幾個(gè)倍數(shù)的稀釋液注注 意意 事事 項(xiàng)項(xiàng) 無(wú)菌操作無(wú)菌操作 稀釋度的選擇稀釋度的選擇 平均菌落數(shù)在平均菌落數(shù)在30-30030-300之間的稀釋度為之間的稀釋度為宜；宜； 每個(gè)稀釋度作兩個(gè)平皿每個(gè)稀釋度作兩個(gè)平皿 記數(shù)要求記數(shù)要求 30-30030-300 300300 3030 300300或或 3

4、0302.2.鮮乳大腸菌群值的測(cè)定鮮乳大腸菌群值的測(cè)定 報(bào)報(bào) 告告 根據(jù)證明為大腸菌群陽(yáng)性的管數(shù)，查根據(jù)證明為大腸菌群陽(yáng)性的管數(shù)，查MPNMPN檢索表，檢索表，報(bào)告每報(bào)告每100mL(g)100mL(g)檢樣中大腸菌群的最能夠數(shù)。檢樣中大腸菌群的最能夠數(shù)。斷定規(guī)范斷定規(guī)范3. 常見致病菌的快速檢測(cè)常見致病菌的快速檢測(cè) SE的的PCR檢測(cè)檢測(cè) 原原 理理 以擴(kuò)增的以擴(kuò)增的DNADNA分子為模板，以一對(duì)分分子為模板，以一對(duì)分別與模板互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在別與模板互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNADNA聚合酶的作用下，按半保管復(fù)制的機(jī)制聚合酶的作用下，按半保管復(fù)制的機(jī)制沿著模板鏈延伸直至完成新

5、的沿著模板鏈延伸直至完成新的DNADNA合成。不合成。不斷反復(fù)這一過(guò)程，可使目的斷反復(fù)這一過(guò)程，可使目的DNADNA片段得到擴(kuò)片段得到擴(kuò)增。由于新合成的增。由于新合成的DNADNA也可以作為模板，因也可以作為模板，因此此PCRPCR可使可使DNADNA的合成量呈指數(shù)增長(zhǎng)。的合成量呈指數(shù)增長(zhǎng)。 PCRPCR的根本成分的根本成分 模板模板DNADNA 特異性引物特異性引物(SEF14)(SEF14) 熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶聚合酶 dNTPdNTP 二價(jià)陽(yáng)離子二價(jià)陽(yáng)離子 緩沖液緩沖液 過(guò)過(guò) 程程 ( (高溫變性、低溫退火、中溫延伸高溫變性、低溫退火、中溫延伸) ) 引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì) 利用引物

6、設(shè)計(jì)軟件利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0Primer5.0針對(duì)針對(duì)SEF14SEF14主要構(gòu)造亞單位主要構(gòu)造亞單位sefAsefA的基因序列的基因序列設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)引物: : 上游引物上游引物Usef AUsef A為為5-5-ATGCGTAAATCAGCATCTG-3ATGCGTAAATCAGCATCTG-3；下游引物；下游引物L(fēng)sefALsefA為為5-TTAGTTTTGATACTGCTGAAC-35-TTAGTTTTGATACTGCTGAAC-3樣品處置模板制備樣品處置模板制備以以12000rpm12000rpm離心離心5min,5min,上清液即含基因組上清液即含基因組DNADNA待檢

7、肉樣乳待檢肉樣乳1g/mL1g/mL以以9mL9mL增菌液混合研碎，增菌液混合研碎，制成食品勻漿液制成食品勻漿液3737振蕩培育振蕩培育3 3小時(shí)小時(shí)取樣液取樣液1mL1mL以以2000rpm2000rpm離心離心2min,2min,取上清液取上清液以以8000rpm8000rpm離心離心5min,5min,沉淀以沉淀以50uL50uL懸浮懸浮沸水浴沸水浴10min10min后迅后迅速置冰浴速置冰浴5min5min 反響體系反響體系10Buffer 2.5uLdNTP 2.0MgCl2 2.0上游引物上游引物20uM 1uL下游引物下游引物 20uM 1uL模模 板板 2uLTaq DNA P

8、olymerase 0.25 滅菌滅菌ddH2O up to 25uL 反響參數(shù)反響參數(shù) 1. Initial denature 95 1. Initial denature 95 5 min 5 min 2. Denature 2. Denature 95 60s95 60s 3. Anealing 3. Anealing 47 60s 47 60s 4. Elongation 4. Elongation 72 60s72 60s Return to 2 for 30 cycleReturn to 2 for 30 cycle 5. Final elongation 72 5. Final elongation 72 10 min 10 min Keep 4 Keep 4 5 min5 min 瓊脂