生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課件二

1、 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)理論生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)理論一、層析技術(shù)l19031903年，俄國科學(xué)家年，俄國科學(xué)家M.C.JberM.C.Jber首創(chuàng)了一種從綠葉中分離首創(chuàng)了一種從綠葉中分離多種不同顏色色素成分的方法，命名為色譜法多種不同顏色色素成分的方法，命名為色譜法(Chromatography)(Chromatography)，由于翻譯和習(xí)慣的原因又常稱為，由于翻譯和習(xí)慣的原因又常稱為層析法。層析法。l8080多年來，層析法不斷發(fā)展，形式多種多樣。多年來，層析法不斷發(fā)展，形式多種多樣。5050年代開年代開始，相繼出現(xiàn)了分配層析、離于交換層析、凝膠層析、始，相繼出現(xiàn)了分配層析、離于交換層析、凝膠層析、親

2、和層析、吸附層析等。親和層析、吸附層析等。l幾乎每一種層析法都已發(fā)展成為一門獨(dú)立的生化高技術(shù)，幾乎每一種層析法都已發(fā)展成為一門獨(dú)立的生化高技術(shù)，在生化領(lǐng)域內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用。在生化領(lǐng)域內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用。一、層析技術(shù)l1、層析技術(shù)原理、層析技術(shù)原理l2、層析技術(shù)分類、層析技術(shù)分類l3、常用層析技術(shù)原理、常用層析技術(shù)原理 1、層析技術(shù)原理l層析原理：是一種物理的分離方法，利用混合層析原理：是一種物理的分離方法，利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩相中，其中一相為以不同程度分布在兩相中，其中一相為固定固定相相，另一相流過此相稱作

3、另一相流過此相稱作流動(dòng)相流動(dòng)相，并使各組分以不并使各組分以不同速度移動(dòng)，從而達(dá)到分離的目的。同速度移動(dòng)，從而達(dá)到分離的目的。l可分離物質(zhì)：可分離物質(zhì)：糖類、有機(jī)酸、氨基酸、核苷酸糖類、有機(jī)酸、氨基酸、核苷酸。名稱名稱操作方式操作方式固定相固定相流動(dòng)相流動(dòng)相分離依據(jù)分離依據(jù)分配層析分配層析紙層析紙層析薄層層析薄層層析液體液體液體液體溶解度溶解度離子交換層析離子交換層析離子交換柱層析離子交換柱層析固體固體液體液體帶電性帶電性靜電引力靜電引力吸附層析吸附層析吸附薄層層析吸附薄層層析氣體吸附層析氣體吸附層析固體固體固體固體液體液體氣體氣體吸附力吸附力親合層析親合層析酶與底物酶與底物抗原與抗體抗原與抗體

4、固體固體液體液體配體專一性配體專一性凝膠層析凝膠層析 凝膠過濾凝膠過濾固體固體液體液體分子大小分子大小淀 粉 凝 膠 電 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳凝 膠 支 持 物 區(qū) 帶 電 泳紙 電 泳醋 酸 纖 維 薄 膜 電 泳 薄 層 電 泳非 凝 膠 支 持 物 電 泳用 支 持 物 區(qū) 帶 電 泳顯 微 電 泳等 電 聚 焦 電 泳等 速 電 泳不 用 支 持 物 電 泳是 否 用 支 持 物u=v=d/t=dleV/lVt類型類型優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)缺點(diǎn)紙電泳紙電泳設(shè)備操作簡單設(shè)備操作簡單分辨率差，電滲現(xiàn)分辨率差，電滲現(xiàn)象象醋酸纖維薄膜電醋酸纖維薄膜電泳泳設(shè)備操

5、作簡單，樣品設(shè)備操作簡單，樣品用量少用量少分辨率差分辨率差瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳快速，分辨率高快速，分辨率高電滲現(xiàn)象嚴(yán)重電滲現(xiàn)象嚴(yán)重聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳可調(diào)節(jié)凝膠孔徑，樣可調(diào)節(jié)凝膠孔徑，樣品用量少分辨率高，品用量少分辨率高，無電滲現(xiàn)象無電滲現(xiàn)象高濃度凝膠難剝離高濃度凝膠難剝離 OCH2=CH-C-NH2 O OCH2=CH-C-NH -CH2-NH-C-CH=CH2A. 樣品的濃縮效應(yīng)樣品的濃縮效應(yīng)緩沖液成分及緩沖液成分及pH的不連續(xù)性的不連續(xù)性l濃縮膠濃縮膠pH6.7pH6.7l緩沖液緩沖液 濃縮膠濃縮膠Tris-HClTris-HCl, , 電極緩沖液電極緩沖液Tri

6、s-GlyTris-Glyl解離度解離度 ： ClCl 蛋蛋 GlyGlylm mcl clcl clmm蛋蛋蛋蛋m m GlyGly GlyGlyl凝膠中凝膠中ClCl為快離子，為快離子， GlyGly為慢離子，為慢離子，蛋白質(zhì)樣品被夾在中間。蛋白質(zhì)樣品被夾在中間。 緩沖液緩沖液樣品樣品濃縮膠濃縮膠分離膠分離膠緩沖液成分及緩沖液成分及pH的不連續(xù)性導(dǎo)致蛋白質(zhì)樣品的不連續(xù)性導(dǎo)致蛋白質(zhì)樣品濃縮效應(yīng)示意圖濃縮效應(yīng)示意圖 快離子快離子 慢離子慢離子 蛋白質(zhì)樣品蛋白質(zhì)樣品 E：每厘米的電壓降每厘米的電壓降 E EI( I(電流強(qiáng)度電流強(qiáng)度)/ )/( (電導(dǎo)率電導(dǎo)率) ) E E與電泳速度成正比與電泳

7、速度成正比l電泳開始后，由于快離子泳動(dòng)電泳開始后，由于快離子泳動(dòng)率最大，在快離子后面形成一率最大，在快離子后面形成一個(gè)離子濃度低的低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)個(gè)離子濃度低的低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)生較高的電位梯度，使蛋白質(zhì)生較高的電位梯度，使蛋白質(zhì)和慢離子加速移動(dòng)，蛋白質(zhì)樣和慢離子加速移動(dòng)，蛋白質(zhì)樣品被進(jìn)一步濃縮。品被進(jìn)一步濃縮。電位梯度的不連續(xù)性電位梯度的不連續(xù)性lE：每厘米的電壓降每厘米的電壓降 E EI( I(電流強(qiáng)度電流強(qiáng)度)/ )/( (電導(dǎo)率電導(dǎo)率) )lE E與電泳速度成正比與電泳速度成正比l電泳開始后，由于快離子泳動(dòng)電泳開始后，由于快離子泳動(dòng)率最大，在快離子后面形成一率最大，在快離子后面形成一個(gè)離子濃度低

8、的低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)個(gè)離子濃度低的低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)生較高的電位梯度，使蛋白質(zhì)生較高的電位梯度，使蛋白質(zhì)和慢離子加速移動(dòng)，蛋白質(zhì)樣和慢離子加速移動(dòng)，蛋白質(zhì)樣品被進(jìn)一步濃縮。品被進(jìn)一步濃縮。 電位梯度的不連續(xù)性電位梯度的不連續(xù)性A. 樣品的濃縮效應(yīng)樣品的濃縮效應(yīng) 四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括原理包括：l緩沖液成分及緩沖液成分及pHpH的不連續(xù)性的不連續(xù)性l電位梯度的不連續(xù)性電位梯度的不連續(xù)性 緩沖液緩沖液濃縮膠濃縮膠樣品樣品分離膠分離膠A. 樣品的濃縮效應(yīng)樣品的濃縮效應(yīng) 四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括應(yīng)原理包括：l凝膠層的不連續(xù)性：凝膠層的

9、不連續(xù)性： 樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮效應(yīng)效應(yīng)(緩沖液緩沖液pH8.3)pH8.3) 蛋白質(zhì)從蛋白質(zhì)從“”極向極向“”極移極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。度變慢，堆積濃縮。 緩沖液緩沖液樣品樣品濃縮膠濃縮膠分離膠分離膠A. 樣品的濃縮效應(yīng)樣品的濃縮效應(yīng) 四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括應(yīng)原理包括：l凝膠層的不連續(xù)性：凝膠層的不連續(xù)性： 樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮效應(yīng)效應(yīng)(緩沖液緩沖液pH8.3)pH8.3) 蛋白質(zhì)從蛋白質(zhì)從“”極向極向“”極移極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入

10、分離膠，速動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。度變慢，堆積濃縮。 緩沖液緩沖液樣品樣品濃縮膠濃縮膠分離膠分離膠A. 樣品的濃縮效應(yīng)樣品的濃縮效應(yīng) 四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括應(yīng)原理包括：l凝膠層的不連續(xù)性：凝膠層的不連續(xù)性： 樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮效應(yīng)效應(yīng)(緩沖液緩沖液pH8.3)pH8.3) 蛋白質(zhì)從蛋白質(zhì)從“”極向極向“”極移極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。度變慢，堆積濃縮。 緩沖液緩沖液濃縮膠濃縮膠分離膠分離膠A. 樣品的濃縮效應(yīng)樣品的濃縮效應(yīng) 四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效

11、四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括應(yīng)原理包括：l凝膠層的不連續(xù)性：凝膠層的不連續(xù)性： 樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮效應(yīng)效應(yīng)(緩沖液緩沖液pH8.3)pH8.3) 蛋白質(zhì)從蛋白質(zhì)從“”極向極向“”極移極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。度變慢，堆積濃縮。 緩沖液緩沖液濃縮膠濃縮膠分離膠分離膠 B.電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)l蛋白質(zhì)樣品進(jìn)入分離膠后蛋白質(zhì)樣品進(jìn)入分離膠后 pHpH增大增大(pH 8.9)(pH 8.9)，GlyGly解離度增解離度增大，不存在快、慢離子之分，大，不存在快、慢離子之分，蛋白質(zhì)樣品在均一電場強(qiáng)度和蛋白質(zhì)樣品在均一電場強(qiáng)度和pHpH條件下泳動(dòng)。條件下泳動(dòng)。l由于各種蛋白質(zhì)由于各種蛋白質(zhì)pI不同，所載不同，所載有效電荷不同，因此質(zhì)點(diǎn)的有效電荷不同，因此質(zhì)點(diǎn)的 有有效遷移率不同，形成不同區(qū)帶。效遷移率不同，形成不同區(qū)帶。 緩