共聚焦顯微鏡簡介及免疫熒光染色

1、共聚焦顯微鏡簡介及免疫熒光染色共聚焦顯微鏡簡介及免疫熒光染色 德國Leica激光掃描共聚焦顯微鏡SP5 II簡介基本參數(shù)型號：德國Leica SP5 II激光器：4個 發(fā)射波長400nm-800nm物鏡：10倍 20倍 63倍通道：多通道 多色系統(tǒng)：windows 7LAS AF 活體細(xì)胞裝置：配有激光掃描共聚焦顯微鏡的基本特點l 觀察方式：以熒光為主l 光源：激光（紫外、可見光）l 照明方式：點照明、逐點掃描l 成像方式：共聚焦、逐點成像l 輸出：實時觀測，數(shù)字化圖像，可以進(jìn)行 圖像處理和定量分析l 多重染色樣品的觀察基本功能l多熒光標(biāo)記樣品的高清晰度、高分辨率圖像 采集光學(xué)顯微鏡分辨率：0

2、.25m共焦顯微鏡分辨率：0.18m基本功能l 定位、定量分析基本功能l 無損傷、連續(xù)光學(xué)切片，顯微“CT”l三維重構(gòu)成像 三維重構(gòu)成像基本功能l活體細(xì)胞熒光染色的動態(tài)觀察及快速掃描成像 LAS AF軟件的基本界面 在生物醫(yī)學(xué)中的主要應(yīng)用（一）原位鑒定細(xì)胞或組織內(nèi)生物大分子、觀察細(xì)胞及亞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)1.細(xì)胞原位檢測核酸2.原位檢測蛋白質(zhì)、抗體及其他分子3.檢測細(xì)胞凋亡4.細(xì)胞器觀察及測定5.觀察細(xì)胞骨架6.檢測細(xì)胞融合7.檢測細(xì)胞內(nèi)脂肪（二）活體細(xì)胞或組織功能的實時動態(tài)監(jiān)測1.細(xì)胞內(nèi)離子動態(tài)變化的測量2.膜電位的測量3.細(xì)胞內(nèi)PH值的測定4.檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧物種的產(chǎn)生5.檢測藥物等跨膜進(jìn)入組織

3、或細(xì)胞過程及其定位日常保養(yǎng)及注意事項按照手冊正確操作。如有疑問請及時聯(lián)系 Leica Leica 工程師，尋求專業(yè)幫助。保證外部電源供應(yīng)穩(wěn)定。由于環(huán)境的變化會影響各部件的相對位等，無論工作與否請保持室內(nèi)恒溫，清潔，干燥。室溫 22-25 22-25 攝氏度，相對濕度80%80%以下為宜。使用一段時間后，精密器件可能會由于環(huán)境等因數(shù)引起偏移，為保證儀器正常使用，請與 Leica Leica 的專業(yè)工程師聯(lián)系，及時調(diào)較儀器。使用顯微鏡油鏡后請用無水乙醇清潔鏡頭前部。日常保養(yǎng)及注意事項短時間的停頓工作時，無需關(guān)閉系統(tǒng)。只是做一些分析圖片等工作時，無需打開激光器控制鑰匙，以減少激光器的損耗。請避免使用

4、外界存儲設(shè)備（U U盤，移動硬盤等），以免電腦受病毒感染。請不要安裝包含殺毒軟件在內(nèi)的任何未經(jīng)軟件生產(chǎn)商授權(quán)和經(jīng)LeicaLeica工程師認(rèn)可的軟件。 熒光探針的選擇選擇熒光探針的主要步驟：1 1、根據(jù)實驗?zāi)康拇_定需要檢測的目標(biāo)；2 2、確定可供選擇的熒光探針的范圍；3 3、考察熒光探針的特性是否符合熒光樣品的制備 要求；4 4、熒光探針與所用共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的匹配情況。樣品要求樣品經(jīng)熒光標(biāo)記組織切片在載玻片上，用蓋玻片封片固定的或活的貼壁培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)培養(yǎng)在共聚焦專用小培養(yǎng)皿或蓋玻片上懸浮細(xì)胞，甩片或滴片后，用蓋玻片封片樣品要求載玻片厚度應(yīng)在0.81.2mm之間，蓋玻片應(yīng)光潔，厚度在0.17mm

5、左右標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不能充分激發(fā)盡量去除非特異性熒光信號封片劑多用甘油：PBS混合液（9：1)激光共聚焦適用的器皿及要求一、活細(xì)胞直接免疫熒光染色（溶酶體或鈣離子）（1）將A549細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)于35 mm 激光共聚焦 培養(yǎng)皿中間的圓形凹槽里；（2）染色前吸除培養(yǎng)皿的培養(yǎng)液，用PBS洗2-3 次；（3）向培養(yǎng)皿中輕輕滴入Lyso-Tracker Red或 Fluo-4/AM工作液200L，使其覆蓋凹槽里 全部細(xì)胞；（4）37 、5%CO2 培養(yǎng)箱中孵育30 min；（5）吸除染液，用PBS洗2-3次；（6）再用800L的PBS覆蓋凹槽里全部細(xì)

6、胞， 用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察Ca2+的變 化。 二、間接免疫熒光染色（FITCFITC標(biāo)記）（1）收集細(xì)胞 收集細(xì)胞爬片，吸取各培養(yǎng)孔上清，PBS沖洗（ 5min3），4%多聚甲醛固定20min，晾干后用。（2）通透及封閉 取出細(xì)胞爬片，貼于載玻片上，用PBS（5min3） 沖洗后，加入0.3% Triton X-100穿透細(xì)胞膜5min， PBS（5min3），加入2% BSA封閉抗原30min。（3）滴加一抗 滴加用PBS稀釋的一抗，濕盒內(nèi)4孵育過夜。每次 實驗均作空對照白（PBS代替一抗）和同型對照（ 兔/鼠血清或IgG亞型代替一抗）。二、間接免疫熒光染色（FITCFITC標(biāo)記）（4

7、）滴加二抗 次日用PBS（5min3）沖洗后，滴加用 PBS稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗兔/鼠二抗， 37孵育60 min（避光）。（5）染核并封片 用PBS（5min3）沖洗后，滴加DAPI染 核5min, PBS沖洗（5min3），滴加抗熒 光淬滅封片液。（6）激光共聚焦顯微鏡拍照Leica網(wǎng)上課程Leica Science Lab網(wǎng)址： 激光掃描共聚焦顯微鏡的基本特點l 觀察方式：以熒光為主l 光源：激光（紫外、可見光）l 照明方式：點照明、逐點掃描l 成像方式：共聚焦、逐點成像l 輸出：實時觀測，數(shù)字化圖像，可以進(jìn)行 圖像處理和定量分析l 多重染色樣品的觀察基本功能l活體細(xì)胞熒光染色的動態(tài)觀察及快速掃描成像 二、間接免疫熒光染色（FITCFITC標(biāo)記）（1）收集細(xì)胞 收集細(xì)胞爬片，吸取各培養(yǎng)孔上清，PBS沖洗（ 5min3），4%多聚甲醛固定20min，晾干后用。（2）通透及封閉 取出細(xì)胞爬片，貼于載玻片上，用PBS（5min3） 沖洗后，加入0.3% Triton X-100穿透細(xì)胞膜5min， PBS（5min3），加