農業(yè)生物技術第3章電子教(學)案

1、第3章農業(yè)微生物技術第一節(jié)農業(yè)微生物概述一、授課章節(jié)第一節(jié)農業(yè)微生物概述。二、學時安排6學時。三、教學目標1 .掌握微生物定義、特征、分類、命名法則。2 .掌握微生物大小形態(tài)。3 .掌握微生物的結構。4 . 了解微生物的生活史。5 .熟悉微生物的營養(yǎng)。四、教學重點、難點分析重點：1 .微生物的定義、命名法則。2 .微生物的結構形態(tài)。難點：1 .微生物結構。2 .微生物命名法則。五、教具電化教學設備。六、教學方法講授法，多媒體課件。七、教學過程I導入本次課主要講述微生物的基礎知識，包括微生物定義、命名法則、形態(tài)結構等方面的知識。II新課一、微生物定義、分類1 .定義微生物是指大量的、極其多樣的、

2、不借助顯微鏡看不見的微小生物類群的總稱，通常 包括病毒、亞病毒（類病毒、擬病毒、骯病毒）、具原核細胞結構的真細菌、古生菌以及具真核細胞結構的真菌（酵母、霉菌、蕈菌等）、原生動物和單細胞藻類。2 .微生物的分類 簡單分類原核生物 一真細菌、古細菌細胞生物 J微 I真核生物 真菌、單細胞藻類、原生動物生物非細胞生物病毒、亞病毒 六界系統(tǒng)1969年，魏塔克，六界分別是病毒界、原生生物界、原核生物界、真菌界、植物界、 動物界。 三界學說1990年，伍斯，細菌域、古生菌域和真核生物域。 安斯沃思（Ainsworth,1971） 系統(tǒng)分為真菌門和黏菌門，而真菌門又分為鞭毛菌亞門、接合菌亞門、子囊菌亞門、擔

3、子 菌亞門和半知菌亞門。3.微生物的命名法則采用林奈雙名法，此為國際命名法規(guī)，即每一微生物的學名都依屬與種而命名，即屬名+種名+ （首次定名人）+現定名人+定名年份。屬名：拉丁文的名詞或作名詞的形容詞，字首大寫，表示微生物的主要特點。種名：為拉丁文形容詞，為微生物次要特征，字首小寫。出現在分類學文獻中的學名，在上述兩部分之后還應加寫 3項內容，即首次定名人（正 體字，用括號括?。?、現名定名人（正體字）和現名的定名年份。如在一般書刊中出現學名 時，則不必寫上后 3項內容。如 Escherichia coli（大腸桿菌），Escherichia 是屬名，第一個字母大寫；coli是種名，小寫；均用斜

4、體字。三、微生物形態(tài)與大小1 .微生物的形態(tài)細菌個體的基本形態(tài)可分為：球狀、桿狀和螺旋狀，分別稱為球菌、桿菌和螺旋菌；放線菌的菌體為單細胞原核分支的放射狀絲狀體，菌絲體分為基內菌絲（營養(yǎng)菌絲）、氣生菌絲和抱子絲；酵母菌的個體類似細菌，大多數為單細胞，一般呈球形、卵形或圓柱形，有些菌體能互相連接并延長成菌絲體，稱假菌絲；霉菌營養(yǎng)體的基本單位是菌絲，菌絲通常呈管狀。低等霉菌的菌絲沒有橫隔膜，稱無隔菌絲，整個菌絲就是一個單細胞，菌絲內有許多核；高等霉菌的菌絲有橫隔膜，稱有隔菌絲，橫隔膜將菌絲分隔成多個細胞，每個細胞含有1至多個細胞核。菌絲也像放線菌那樣分為基內菌絲和氣生菌絲，在氣生菌絲頂端可產生各

5、種抱子；擔子菌和霉菌一樣，也形成絨毛狀的菌絲體，并能進一步形成大型子實體。2 .微生物的大小細菌中單個球菌的直徑多為0. 51科mi桿菌多為（0 .5l）wmX5wmi螺旋菌多為（0 .5 2） m X （1 50）mi放線菌的菌絲，寬度1科m左右，無橫隔。酵母菌比細菌大得多，寬15d m,長530dmi霉菌的菌絲，粗細不一，一般寬510 m,少數小至0 . 5 m 大到100 dmi3 .微生物的菌落特征微生物在固體培養(yǎng)基上， 由一個菌體在一定溫度下經過一定時間的培養(yǎng)，生長繁殖成為肉眼可見并具有一定形狀的群體結構，稱為菌落。菌落的形狀、大小、顏色、透明度、光澤 及邊緣形狀等特點，因菌種不同而

6、異，因而可作為菌種鑒定的依據。細菌的菌落多數表面光滑、濕潤、半透明或不透明，大多數呈圓形，也有呈分枝狀或不規(guī)則擴展狀。有的有顏色，有的表面干燥有褶紋。直徑一般14mm菌體與培養(yǎng)基結合不緊，用挑針容易挑起。放線菌在固體培養(yǎng)基上一般為圓形、平坦或有皺褶，邊緣有輻射狀菌絲，質地緊密、堅實、不能無限擴張，形成抱子后，表面呈粉末狀。由于菌絲和抱子都具有色素，所以菌落表 面和背面的顏色往往不同。 正面是抱子絲和抱子層的顏色， 不同種類具有不同而穩(wěn)定的色澤； 背面是營養(yǎng)菌絲以及它們所分泌色素的顏色。酵母菌的菌落形狀與細菌的菌落相似，但比細菌菌落大而厚，多數不透明，一般為圓形，表面光滑、粘稠、濕潤呈油脂狀，多

7、數為乳白色，少數為粉紅色或紅色，用接種針很容易從 菌落中將菌挑起。培養(yǎng)時間較長的菌落，表面呈皺紋狀，較干燥，顏色往往變暗。霉菌的菌落由無數分支狀菌絲體組成， 呈絨毛狀，棉絮狀或蜘蛛網狀， 一般比細菌菌落 大幾倍至幾十倍。在固體培養(yǎng)基上， 霉菌菌落一般比較疏松，有些生長快的種類，能迅速蔓 延擴展；有些種類生長則有局限性。 菌落最初呈白色或淺色， 這是菌絲的顏色。隨后從菌落的中央逐漸向外擴展，在菌絲上長出各種顏色的抱子，有時菌絲也能分泌一些色素，擴散到 培養(yǎng)基內。所以不同霉菌在培養(yǎng)基的正面和反面顯示出不同顏色，這些特征是鑒別霉菌的重要依據。四、微生物結構1 .原核微生物的結構細菌的細胞一般具有細胞

8、壁、細胞膜、細胞質及原核等基本結構。有些還具有鞭毛、莢膜、芽抱等特殊結構2 .真核微生物的結構酵母菌細胞由細胞壁、細胞膜、原生質、細胞核和其他內含物組成。霉菌菌絲細胞的構造同酵母菌細胞相似，菌絲隔膜的中央有極小的孔，細胞質或養(yǎng)料可互相溝通，細胞核也可以通過。五、微生物生活史3 .原核微生物生活史4 .真核微生物生活史六、微生物營養(yǎng)代謝1 .微生物營養(yǎng)物質微生物的生長需要碳源（凡能供給微生物碳素營養(yǎng)的物質）、氮源（凡能供給微生物氮素營養(yǎng)的物質）、無機鹽（包括主要元素和微量元素）、生長因子（凡是微生物生長不可缺少 的微量有機物質）、能量（光能或化學能）和水六大營養(yǎng)要素。2 .微生物的營養(yǎng)類型根據微

9、生物所需的碳源和能源的不同，將微生物分為光能自養(yǎng)型、光能異養(yǎng)型、化能 自養(yǎng)型、化能異養(yǎng)型四種營養(yǎng)類型。3 .微生物培養(yǎng)基培養(yǎng)基是以人工方法按照微生物的需要，用多種物質調制而成的適合不同微生物生長繁殖或積累代謝產物需要的一種營養(yǎng)基質。III 作業(yè)1 .微生物命名法則是什么？2 .簡述微生物的概念和特征？3 .如何對菌落進行形態(tài)描述？第二節(jié)農業(yè)微生物分離技術、授課章節(jié)第二節(jié)農業(yè)微生物分離技術。二、學時安排6學時。三、教學目標1 . 了解微生物分離基本思路。2 .掌握土壤中細菌分離的方法步驟。3 .掌握植物真菌分離的方法步驟。四、教學重點、難點分析重點：1 .細菌分離方法、步驟。2 .真菌分離方法、

10、步驟。難點：1 .細菌分離步驟。2 .真菌分離步驟。五、教具電化教學設備。六、教學方法講授法，多媒體課件。七、教學過程I導入上節(jié)回顧：上節(jié)主要講述了微生物基礎知識，主要為微生物定義、分類、命名、結構、 生活史、營養(yǎng)等方面的內容。本節(jié)主要講述農業(yè)微生物的分離技術，重點講述細菌和真菌的分離技術。II新課一、微生物分離概述1 .菌種分離的方法和種類將特定的微生物個體從群體中或從混雜的微生物群體中分離出來的技術叫做分離；在 特定環(huán)境中只讓一種來自同一祖先的微生物群體生存的技術叫做純化。稀釋法中的稀釋涂布平板法、平板劃線法、稀釋搖管法較為常用，而鑒別分離法以鑒別 培養(yǎng)基分離技術較為常見；絲狀真菌和放線菌

11、分離常常采用組織分離法、胞子分離法、餌誘法等等。2 .優(yōu)勢菌的分離思路一般采用以下思路：細菌和單細胞微生物可以進行稀釋，從而使得每一個細胞繁殖形成單菌落，進行分離；而絲狀真菌可以進行抱子稀釋，進而繁殖形成單菌落，在菌落還沒產生抱子前，將平板上的單菌落挑出，進而得到純化。3 .不占優(yōu)勢菌的分離思路一般采用以下思路：先進行富集培養(yǎng)，即從微生物混合群開始，不斷增加特定種的數量比 例而引向純培養(yǎng)，將要分離的目的菌數量提高上去以后， 進而采用優(yōu)勢菌分離的思路進行分 離。二、土壤中細菌的分離1. 土壤中細菌分離所需要的工具2. 土壤中細菌分離技術路線3. 土壤中細菌分離步驟(1)查資料、定方案通過查閱資料

12、，確定目的菌的采樣地點、季節(jié)，分離的培養(yǎng)基配方、分離手段、鑒別手段、純化方法等等，最終確定整個分離方案。(2) 土壤樣品采樣采集土壤樣品時，按統(tǒng)計學觀點取樣(圖 3-18),確定取樣點。選好取樣地點后，用小 鏟子除去表土，用采集器(圖 3-19, 3-20, 3-21 , 3-22 )取離地面515cm處的士約10g, 盛入事先滅菌的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數量和類型盡量少變化，宜將樣品分批帶回實驗室，以便及時分離。(3) 土壤樣品預處理樣品預處理是制備菌懸液的過程，也是土壤浸提液的制備過程。首先將樣品放到事先滅菌的研缽中研

13、碎混勻，取 5g置于事先放入玻璃珠的無菌三角瓶中，加入無菌水100mL振蕩搖勻5min, 3層紗布過濾，取濾液備用。(4)稀釋分離首先，將制備好的菌懸液，置于60c水浴15min,進行梯度稀釋(10-1, 10-2, 10-310-10), 涂布于事先制備好的 NA平板(牛肉高蛋白月東培養(yǎng)基)上，然后 30c下培養(yǎng)，24h后觀察。(5)純化挑取培養(yǎng)平板上長出的乳白色菌落，接種到試管斜面上，30c下培養(yǎng)，24h后觀察，如發(fā)現菌落生長不均一，重復稀釋法，直至純化至滿意為止。(6)鑒定及性能測試根據細菌鑒定方法(以伯杰氏細菌鑒定手冊(第八版) 為準)對細菌進行鑒定，并對 有意義的生產性狀進行進一步地

14、研究。4 . 土壤中細菌分離操作要點(1)梯度稀釋操作時，應注意每個稀釋度的樣品一定要搖勻。(2)移液管口部滅菌前，要放置棉花，用報紙包扎好，滅菌備用。棉花可以起到過濾 保護的作用。(3)從每個梯度取樣時，應注意每個梯度更換一支無菌移液管，防止交叉感染。(4)涂布平板時，涂布器在培養(yǎng)皿中要正轉三圈，反轉三圈，涂布均勻。5 . 土壤中細菌分離的注意事項(1)采集來的樣品應及時進行分離，不能立刻分離的應放于4c冰箱中保存，保存時間不得超過24h。原因是微生物區(qū)系時刻發(fā)生著變化，越早分離越能分出原生態(tài)系中的菌種，減少由于環(huán)境變化引起的雜菌滋生。(2) 土樣浸提液水浴溫度不可高于75 C (非芽抱菌不

15、要水浴)，時間不得少于10 min,原因是溫度過高會使一些耐熱性較差的芽抱死亡，水浴時間過少，非芽抱菌存活下來的較多，造成分離的困難。三、植物上的真菌分離1 .植物上的真菌分離所需要的工具2 .植物上的真菌分離技術路線3 .植物上的真菌分離步驟(1)查資料、定方案通過查閱資料，了解植物病原真菌的分離方法、真菌特性、培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件等，確定方案。(2)植物采樣采樣樣品時的天氣最好選擇陰天多云的日子，選擇采集典型的病部葉片，葉斑病害應取 病健交界處進行分離。樣品應盡快送往實驗室分離。(3)植物樣品預處理采集的葉片，先用潔凈的清水洗去葉片上的灰塵和雜物，晾干備用。(4)分離取真菌性葉斑病的新鮮病

16、葉，用剪刀剪取病健交界處的組織(邊長45mm數塊；將病組織放入70%酉精中浸35s后，將病組織在 0.1%升汞(氯化汞)液中消毒1min,然后在無 菌水中連續(xù)漂洗3次，除去表面殘留的消毒劑； 按無菌操作規(guī)程將病組織移入平板培養(yǎng)基表 面上，一般每皿放 45塊，并用玻璃鉛筆注明培養(yǎng)材料的編號和種類；將平板培養(yǎng)基倒置 后放入恒溫箱內，在 25c下培養(yǎng)34d后，將分離的目的菌在無菌條件下移入斜面培養(yǎng)基 上，淘汰雜菌。(5)純化待平板上長出菌絲時， 用解剖刀將菌落邊緣切下，移入試管斜面，25 c培養(yǎng)，待長好后，4 c保藏備用。(6)菌種鑒定及性能測定根據真菌鑒定方法(以魏景超真菌鑒定手冊為準)對真菌進行

17、鑒定，并對有意義的 生產性狀進行進一步地研究。4 .植物上的真菌分離操作要點(1)無菌水水洗時，每次不得少于3 min ,洗滌時必須不斷振蕩，盡量洗下殘留的升汞溶液。(2) 70%酉精處理時間不得多于 30S,否則，葉片組織容易變黑，分離難度增大。(3)培養(yǎng)基可以選用 PDAt§養(yǎng)基(馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂1720 g,水1 000 mD,可以在此培養(yǎng)基中加入 15%勺植物組織浸提液，可提高分離效果。(4)為了防止雜菌污染，可以加入抗生素，抑制雜菌，提高分離效果。例如，青霉素、 硫酸慶大霉素、氯霉素等。5 .植物上的真菌分離注意事項(1)升汞可先配成母液。方法是：升汞

18、 20 g,加濃鹽酸100 mL使用時取5mL原液加 995 mL水即成；也可用升汞 1 g ,鹽酸2.5 mL ,水1 000 mL ,先將升汞溶于鹽酸中，再加 水稀釋即成。因升汞劇毒，通常在配制好的溶液中加入紅色或藍色的顏料。(2)分離前還要用70%酉精擦拭雙手，工作過程中，應盡量少說話，呼吸要輕。III作業(yè)1 .優(yōu)勢菌的分離思路是什么？2 .簡述土壤中細菌分離技術路線?3 .簡述土壤樣品采樣方法？4 . 土壤中細菌分離的注意事項？.下載可編輯.第三節(jié)農業(yè)微生物保藏技術、授課章節(jié)第三節(jié)農業(yè)微生物保藏技術。二、學時安排6學時。三、教學目標1 . 了解菌種保藏的依據、方法。2 .掌握常見的菌種

19、保藏方法、步驟。3 .掌握菌種復壯的步驟。四、教學重點、難點分析重點：1 .微生物菌種保藏方法步驟。2 .微生物菌種復壯步驟。難點：1 .菌種保藏方法。2 .菌種復壯步驟。五、教具電化教學設備。六、教學方法講授法，多媒體課件。七、教學過程I導入上節(jié)回顧：上節(jié)主要學習了微生物的分離技術，主要是細菌和真菌分離技術。本節(jié)主要講述微生物保藏的基本依據、4 c斜面菌種保藏技術、明膠顆粒保藏技術、菌種復壯技術。II新課一、微生物保藏依據和方式1 .微生物保藏的基本依據菌種保藏的基本依據是根據微生物的生理生化特點，人工制造環(huán)境條件，使微生物處于代謝不活潑，生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)，即采取低溫、干燥、缺氧等條

20、件，使菌種暫時處于休眠狀態(tài)。斜面冰箱（4C）保藏各類微生物（除病毒外）細菌、酵母菌3個月，霉菌、 放線菌6個月2 .微生物常見的保藏方式保藏方法適用范圍保存有效時間斜面室溫保藏各類微生物（除病毒外）細菌、酵母菌1個月，霉菌.、 放線菌28個月砂土管保藏芽抱桿菌、產抱子的霉菌、放線菌低溫1數年冷凍干燥保藏各類微生物低溫120年固體曲產大量抱子的霉菌低溫1數年載體保藏法（明膠顆粒、陶 瓷珠、玻璃珠、硅膠顆粒等）各類微生物（除病毒外）低溫1數年液氮保藏法各類微生物120年、菌種保藏技術（一）4 C斜面菌種保藏技術2 .技術路線待保藏的菌種 活化接種培養(yǎng)選優(yōu) 保藏定期檢查3 .操作步驟將要保藏的菌種接

21、種于培養(yǎng)基上，培養(yǎng)（細菌30C,真菌28C）,隨時觀察，待試管斜面長成，這樣的操作稱為活化。然后選擇生長良好的菌體或菌絲，重新轉接，再培養(yǎng)后，選 擇生長優(yōu)良的菌種，4c低溫保藏，定期檢查菌種是否污染和損壞，剔除壞的，保存好的。4 .注意事項（1）小心操作，防止寫錯編號及雜菌污染。（2）轉接時避開斜面上生長的白色斑點或與正常菌落外觀有異的菌落，另外由于斜面 上生長的培養(yǎng)物不同部位菌體有差異，保藏過程中菌株的遺傳性因此也有差異，為了盡可能保持其遺傳特性的均一性，應沿瓊脂斜面培養(yǎng)物全面地采用菌體或抱子，從平板培養(yǎng)物移種時，所采取的菌體或抱子應從不少于50個菌落中取得。同時，要有相當的斜面試管數目。（

22、3）培養(yǎng)基配方很重要，一般以碳水化合物濃度偏低的貧乏培養(yǎng)基為好。般不用接種環(huán)接種，并注意不讓（4）培養(yǎng)物繁殖速度不宜太快，培養(yǎng)中不要采取快速生長發(fā)育的培養(yǎng)條件。（5）移種厭氧菌時，以用毛細吸管進行移植為好，氣泡混入培養(yǎng)基中。(6)移植間隔時間因菌種特性，培養(yǎng)條件及保藏溫度而異，以保藏溫度影響最大，4c保藏一般為36個月。(二)明膠顆粒保藏技術1.技術路線待保藏的菌種活化 菌懸液制備 明膠顆粒制備硅膠管準備保藏定期檢查2.操作步驟(1)活化待保藏菌種的活化與斜面菌種保藏法一致。(2)菌懸液制備將活化后的菌種接種于斜面， 培養(yǎng)，選擇優(yōu)良的試管菌種制備菌懸液。 在試管斜面上加 入無菌水，使之覆蓋整個

23、斜面， 再用無菌接種環(huán)輕輕刮下菌苔，將菌苔 (培養(yǎng)基接種線上有 母細胞繁殖長成的一片密集的、具有一定形態(tài)結構特征的菌體群落。)懸浮液倒入事先滅菌的三角瓶中(內裝滅菌玻璃珠)，振蕩打散，制備成菌懸液備用。(3)明膠顆粒制備將2湖膠溶液滅菌，待冷卻至45 C,即不燙手背為宜。將菌懸液倒入明膠溶液，搖勻， 用無菌滴管吸取溶液，滴至事先備好的無菌石蠟平板上，待凝固后形成明膠顆粒。(4)硅膠管準備將硅膠顆粒和玻璃棉放入培養(yǎng)皿在160 c下干熱滅菌23h,取出放入無菌操作臺上，打開皿蓋冷卻，冷卻后，將硅膠顆粒用無菌鐐子轉入無菌試管中，大約占試管的三分之一體積，再在硅膠顆粒上面鋪上無菌玻璃棉，制成硅膠管。(

24、5)保藏及定期檢查將明膠顆粒放入硅膠管的玻璃棉上，再將硅膠管管口用石蠟封好。4c低溫保藏。定期檢查保存菌種管的情況。3.注意事項(1)整個過程要時刻注意無菌操作，稍有不慎，就會前功盡棄。(2)制備明膠顆粒，要特別注意不要使明膠溫度太低，否則，明膠很容易凝固，造成 顆粒無法制備，最好少量配兌，一旦菌液全部加入，明膠凝固后再溶化將對菌體造成損害。(3)硅膠管保存過程中，要注意硅膠顏色變化，一旦失效，應及時更換硅膠管或重新保種。三、菌種復壯技術1.菌種復壯技術路線待復壯的菌種 活化 菌懸液制備涂布平板菌落形態(tài)鑒別選種保藏生產性狀測定選優(yōu)保藏。2.菌種復壯操作步驟(1 )菌種的活化：前文已有敘述，在此

25、不再敘述了。(2)菌懸液的制備：與明膠顆粒保藏法中的菌懸液制備相同。(3)涂布平板：詳見第二節(jié)菌種分離中的相關內容。(4)菌落形態(tài)鑒別和選種保藏。根據菌落的形態(tài)進行初步篩選，選出平板中未退化的菌落，將其挑出，不得少于25個菌落，接種于試管斜面上。性狀優(yōu)良的菌種菌落具有以下特征：抱子生長有減弱趨勢； 菌種中度大小，有偏小趨勢，但不是極小；菌落偏小，而抱子生長豐富；抱子顏色有減弱的趨勢；溝紋多、密、直而 規(guī)整；營養(yǎng)菌絲分泌色素或逐漸加深或逐漸變淺。性狀退化的菌種菌落具有以下特征：光禿；生長嚴重衰退，如長的過小，抱子量過少到影響正常生長繁殖；表面結構不均勻，抱子生長不均勻，抱子顏色不均勻，菌落表面產

26、生白色斑點、或禿斑等。需要說明的是，在這一類菌落中，亦可能雜有高產型，但因其表型表 現嚴重不純，不宜選用， 此類菌落在傳代后往往遺傳分化強，不穩(wěn)定，不宜選擇此類不純的菌落；生長過于旺盛，如菌落生長特別快，直徑特別大，池子量特別豐富的野生型菌落類型。(5)生產性狀測定及選優(yōu)保藏：對于保存下來的菌種，進行生產性狀測定，比如產量、 生產周期、原料利用率等等，綜合考慮，選出優(yōu)秀的菌種加以保存。3.菌種復壯操作注意事項(1)菌種復壯工作應該是定期進行，隨時觀察，一旦菌種退化，盡快處理。(2)菌種復壯工作一次操作失敗，可以重復以上操作，直至復壯成功。(3)復壯后的菌種應妥善保管，定期檢查，保存的菌種應該存

27、有足夠的數量。III作業(yè)1 .簡述明膠顆粒保藏技術操作步驟？2 .簡述菌種復壯技術路線？3 .簡述4 c斜面菌種保藏的注意事項。第四節(jié)農業(yè)微生物培養(yǎng)技術一、授課章節(jié)第四節(jié)農業(yè)微生物培養(yǎng)技術。二、學時安排6學時。三、教學目標1 .掌握固體培養(yǎng)技術。2 .掌握液體培養(yǎng)技術。四、教學重點、難點分析重點：1 .固體培養(yǎng)技術。2 .液體培養(yǎng)技術。難點：1 .搖瓶培養(yǎng)技術。2 .發(fā)酵罐液體深層培養(yǎng)技術。五、教具電化教學設備。六、教學方法講授法，多媒體課件。七、教學過程I導入上節(jié)回顧：上節(jié)主要講述了微生物保藏技術和菌種復壯技術。本節(jié)主要講述微生物培養(yǎng)技術，主要包括固體培養(yǎng)技術、液體培養(yǎng)技術。II新課一、微生

28、物固體培養(yǎng)技術（一）平板培養(yǎng)技術1 .技術路線斜面菌種活化平板接種培養(yǎng) 收獲2 .操作步驟(1)菌種活化。(2)平板接種。固體培養(yǎng)基滅菌后倒入無菌培養(yǎng)皿中凝固之后制成平板。細菌和單細胞微生物的平板接種常使用劃線和涂布的方法，而絲狀真菌和產抱微生物常用點種接種方法。(3)培養(yǎng)。細菌培養(yǎng)溫度一般在 30 c下培養(yǎng)，真菌一般在 28 c下培養(yǎng)，人體微生物培養(yǎng)溫度一般 在37 Co細菌一般培養(yǎng)24h,真菌需要23d。培養(yǎng)儀器一般為培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱、光照 培養(yǎng)箱以及厭氧的二氧化碳培養(yǎng)箱等等。(4)收獲。待培養(yǎng)的微生物培養(yǎng)一定時間，菌落或菌苔豐厚，應該及時收集起來，4c保藏，以免出現老化現象。3.注意事

29、項(1)接種工具一定要滅菌徹底，防止污染，培養(yǎng)過程中也要注意無菌操作。(2)細菌收獲一般在生長旺盛時期，真菌一般在產生大量成熟的抱子之后再收集。(3)接種后的接種工具應及時消毒后存放，接種的工作臺和無菌室也應進行消毒，保 持潔凈。放置培養(yǎng)箱的培養(yǎng)室也應定期消毒，防止污染。(二)固體基料培養(yǎng)技術1 .技術路線斜面菌種活化基料接種培養(yǎng) 收獲2 .操作步驟(1)菌種活化。(2)基料接種?；现笧榕囵B(yǎng)微生物而配制的特定固體基質。例如，妹皮、鋸末、馬鈴薯塊、玉米粒等?；辖臃N時先將基料加熱(100C, 30min)滅菌消毒，再接入 10料量的菌種。(3)培養(yǎng)及收獲。固體基料發(fā)酵的溫度控制以基料表層溫度為

30、準，細菌一般為30 C,真菌為28 Co工業(yè)生產中往往為了避免雜菌污染，常選育耐高溫菌種，培養(yǎng)溫度常在40c左右。培養(yǎng)一定時間后，及時收獲。3.注意事項(1)固體培養(yǎng)多是粗放性培養(yǎng)方式，但也應注意環(huán)境衛(wèi)生，定期對培養(yǎng)室進行消毒處理。(2)基料接種培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物，可作為生產用種子，進一步擴接生產。二、微生物液體培養(yǎng)技術(一)搖瓶培養(yǎng)技術1 .技術路線斜面菌種活化搖瓶接種振蕩培養(yǎng)收獲2 .操作步驟(1)菌種活化：菌種的活化與斜面菌種保藏法一致。(2)搖瓶接種：一般500 mL三角瓶，裝液體培養(yǎng)基 100 mL,接種量一般為10%(3)振蕩培養(yǎng)及收獲細菌一般在 30 C, 380480 r/min

31、 振蕩，培養(yǎng)2448 h;真菌為28 C, 200300 r/min 振蕩，培養(yǎng) 4872 h ,就可以收獲了。3 .注意事項(1)細菌和單細胞微生物的菌懸液濃度要求必須大于106以上，最好108。(2)產抱微生物的抱子液濃度要求必須大于106以上，最好10%(3)對于以菌絲為主的種子，取生長旺盛的種子，按 1: 10體積分數進行接種。(4)培養(yǎng)時一定注意防止雜菌污染，保證培養(yǎng)環(huán)境潔凈。(二)發(fā)酵罐液體深層培養(yǎng)技術1 .技術路線斜面菌種 活化搖瓶種子培養(yǎng)發(fā)酵罐接種發(fā)酵與控制放罐 收獲2 .操作步驟(1)菌種活化：菌種的活化與斜面菌種保藏法一致。(2)搖瓶接種培養(yǎng)：同搖瓶培養(yǎng)技術。(3)發(fā)酵罐接

32、種：發(fā)酵罐接種一般在火環(huán)保護下接種，接種量一般為10%種子要求處于對數期或快速生長期。(4)發(fā)酵與控制：在發(fā)酵過程中，要進行控溫、控 pH控通氣量、控轉速、中間補料 及消泡等操作，及時檢測生物量、殘?zhí)橇俊⒋值鞍缀康戎笜恕?5)放罐與收獲：通過各種指標測定，綜合判斷發(fā)酵終點，收獲發(fā)酵產物或進一步提取分離。3.注意事項(1)接種時，應注意保持罐壓在 0.05MPa,停止攪拌，接種要快、準、穩(wěn)。(2)整個培養(yǎng)過程，都要維持發(fā)酵罐的罐內正壓，一般為 0.05 MPa。(3)培養(yǎng)過程要注意防止染菌，及時取樣檢查和測定各項指標，保證發(fā)酵正常進行。(4)發(fā)酵與控制。在發(fā)酵過程中，要進行控溫、控 pH控通氣

33、量、控轉速、中間補料 及消泡等操作，及時檢測生物量、殘?zhí)橇俊⒋值鞍缀康戎笜?。III作業(yè)1 .簡述搖瓶培養(yǎng)技術路線。2 .簡述發(fā)酵罐液體深層培養(yǎng)技術路線。3 .簡述固體基料培養(yǎng)技術路線。第五節(jié)微生物應用實例、授課章節(jié)第五節(jié) 微生物應用實例。二、學時安排6學時。三、教學目標1 . 了解微生物在農業(yè)上的應用情況。2 .熟悉微生物農藥的生產工藝。3 .熟悉微生物肥料的生產工藝。四、教學重點、難點分析重點：1 .微生物農藥的生產工藝。2 .微生物肥料的生產工藝。難點：1 .微生物農藥生產工藝。2 .微生物肥料生產工藝。五、教具電化教學設備。六、教學方法講授法，多媒體課件。七、教學過程I導入上節(jié)回顧：主

34、要講述微生物培養(yǎng)技術，包括固體和液體培養(yǎng)技術。本節(jié)主要講述微生物農藥和微生物肥料生產工藝和參數。II新課一、微生物應用概況1 .微生物在植物保護方面的應用植物上的病蟲害，長久以來依靠化學藥劑控制， 長時間大劑量的使用農藥， 不僅污染了環(huán)境，還使得一些病蟲產生了抗藥性，造成病害越來越難防治，只有不斷加大藥量，造成惡性循環(huán)。生物農藥是公認的“無公害農藥”般害蟲不易產生抗藥性，且選擇性強，不傷害天敵；微生物繁殖快，能利用農副產品甚至工業(yè)廢水作生產原料，廣泛生產。2 .微生物在植物營養(yǎng)方面的應用有益微生物在土壤中大量生長繁殖，增加土壤含氮量，如根瘤菌能在根瘤中固定氮素并被植物吸收，加快有機質在土壤中的

35、腐爛分解，提高磷、鉀養(yǎng)分的利用率；供給植物生長刺激類物質，或抑制植物病原菌的活動，從而提高了土壤肥力，改善了植物的營養(yǎng)條件，獲得增產效果，如 AM真菌是一種土壤真菌，它與多種植物根系共生，其菌絲可以吸收更多的營 養(yǎng)供給植物吸收利用，尤其磷的吸收最明顯，還可增加植物的抗病蟲害和抗旱能力。因此可將微生物制成肥料加以應用。二、微生物農藥生產實例1 .微生物農藥概述微生物農藥是利用微生物本身及其代謝產物來防治病、蟲、雜草的制劑。一般分為微生物殺蟲劑、微生物除草劑和農用抗生素三大類。目前國內外研究最多、應用最廣的是蘇云金芽抱桿菌和乳狀芽抱桿菌。正在試驗和研究的尚有蠟質芽抱桿菌、梭狀芽抱桿菌、黏質雷氏菌以

36、及氣桿菌等。蘇云金芽抱桿菌制劑的生產可采用液體深層培養(yǎng)、固體發(fā)酵和液體淺層培養(yǎng)三種方法。 其中，液體培養(yǎng)為大規(guī)模工業(yè)生產法，后兩種則便于在農村、鎮(zhèn)推廣應用。2 .菌體農藥生產的工藝流程保藏的菌種 活化搖瓶種子培養(yǎng)種子罐培養(yǎng)主發(fā)酵罐培養(yǎng)壓濾粉碎 成品 檢測入倉或出售3 .菌體農藥生產的工藝參數(1)菌種特性 蘇云金芽抱桿菌屬于真細菌目， 芽抱桿菌科，芽抱桿菌屬。大小為(0.8 1.2) mX (2.05.0) m周生鞭毛，革蘭氏染色陽性，生活過程中形成芽抱和伴抱晶 體，伴抱晶體是一種毒性蛋白。菌體生長對溫度的要求不嚴，1240 c均能生長，最適溫度為2732 C。對營養(yǎng)物質的要求也不高，能利用各

37、種氮源、碳源和無機鹽。蘇云金芽抱桿 菌是一種好氧性細菌，培養(yǎng)時要求通氣，適宜的 pH為7.07.2。蘇云金芽抱桿菌的治蟲 作用，主要是靠它在代謝過程中產生的毒素(8-內毒素、a -外毒素、3 -外毒素和丫 -外毒素)。(2)菌種活化 將保藏的砂土管菌種，接種于試管斜面上，3032 c下，培養(yǎng)24 h。(3)搖瓶種子培養(yǎng) 將活化后的試管斜面， 制成菌懸液，按10%勺接種量接入搖瓶(三 角瓶)中，300 r/min ,培養(yǎng)68 h。(4)種子罐培養(yǎng) 將搖瓶種子接入種子罐，接種量為 10%控制通風比1 ： 1.1 (即1 體積液體培養(yǎng)基通 1.1體積無菌空氣)、攪拌轉速400 r/min、溫度303

38、2C、初始pH7.0 7.5,培養(yǎng)68h。在培養(yǎng)過程中及時消泡。種子培養(yǎng)基配方：花生餅粉2 %、蠶蛹粉 0.5 %、磷酸二氫鉀0.04 %、硫酸鎂0.04%、 植物油0.15 %。(5)主發(fā)酵罐培養(yǎng) 將種子罐中的種子接入主發(fā)酵罐中， 接種量為10%控制通風比1 ： 1.5 ,攪拌轉速 400 r/min ,溫度3032C,初始 pH 7.07.5 ,培養(yǎng)1820 h。在培養(yǎng)過 程中及時消泡。(6)壓濾、粉碎 發(fā)酵液及時鏡檢，80%勺菌體產生芽抱，即到了發(fā)酵終點，將發(fā)酵液加碳酸鈣10% ,明磯1 %吸附菌體，攪拌均勻后，用壓濾機進行壓濾，吹風，將過濾物放 在60c烘房內干燥后，粉碎，包裝。(7)

39、成品檢測蘇云金芽抱桿菌制劑的質量檢驗，常用的檢驗方法為血細胞板計數法、平皿培養(yǎng)計數法和生物測定法。先將10倍懸浮液移入水浴鍋內 80 C處理15min,計數，活抱子數應在109/g以上視為 合格。(8)入倉或銷售成品存放應注意防潮、防火，及時銷售。4.菌體農藥生產的注意事項(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方和種子培養(yǎng)基配方一致，可以縮短發(fā)酵周期。(2)不同的菌株，發(fā)酵條件不同，相同菌株，培養(yǎng)基原料來源不同也常使得培養(yǎng)條件 發(fā)生偏差，需要重新優(yōu)化確定。(3)發(fā)酵過程注意防止雜菌污染，特別是生產環(huán)境和車間要定期消毒，操作人員應嚴 格按照規(guī)程操作。三、微生物肥料生產實例1 .微生物肥料概述微生物肥料是指一類含有活

40、微生物的特定制品，應用于農業(yè)生產中，作物能夠獲得特定的肥料效應，在這種效應的產生中，制品中活的微生物起關鍵作用。目前已推廣應用的微生物肥料主要有根瘤菌肥料、“5406”菌肥、磷細菌肥料、沼氣發(fā)酵肥料等。根瘤菌屬于真細菌目，根瘤菌科，根瘤菌屬，是一類能固定空氣中游離氮素的細菌，根瘤菌肥料是用人工選育出來的優(yōu)良根瘤菌菌種，通過大量繁殖制成的根瘤菌菌劑。將它接種于相應的豆科作物上，可以形成大量的有效根瘤，充分發(fā)揮固氮作用，促進豆科作物增產， 提高土壤氮素含量。根瘤菌肥料是我國推廣最早、效果最穩(wěn)定的一種高效微生物肥料。根據研究，每畝豆科植物的根瘤菌，每年固定的氮素約 616kg ,相當于2575kg硫

41、酸俊。所以根瘤菌肥料對于提高作物產量，提高土壤肥力的作用是很大的?，F以紫云英根瘤菌肥料的生產為例進行介紹。2 .菌體肥料生產的工藝流程保藏的菌種活化搖瓶種子培養(yǎng) 種子罐培養(yǎng)主發(fā)酵罐培養(yǎng) 檢測泥炭 干燥、粉碎、滅菌制成吸附劑吸附菌液 拌種 成品 檢測3 .菌體肥料生產的工藝參數(1)菌種活化將保藏的砂土管菌種，接種于試管斜面上，2530 C,培養(yǎng)35d,乳白半透明黏質狀的菌苔長豐滿后即可。斜面培養(yǎng)基配方I :蔗糖1 % 、磷酸氫二鉀0.05 %、硫酸鎂0.02 %、氯化鈉0.02 %、 碳酸鈣0.5%、酵母膏0.1 %、微量元素(0.01 %鋁酸鈉加0.5%硼酸)混合液0.4%、 水、瓊脂2% 。斜面培養(yǎng)基配方H: