實(shí)驗(yàn)七酵母RNA的提取及鑒定

1、.姓名：郭沈杰年級(jí)專業(yè) ：2012 級(jí)生物科學(xué)同組者：蔡萍萍學(xué)號(hào)：實(shí)驗(yàn)七酵母 RNA 的提取及鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆障A法提取酵母RNA 的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理酵母核酸中RNA 含量較多， DNA 含量則少于2% 。RNA 可溶于堿性溶液，當(dāng)堿被中和后，可加乙醇使其沉淀，有此可得粗RNA 制品。用堿液提取的RNA 有不同程度的降解。三、實(shí)驗(yàn)儀器1 、離心機(jī)2 、水浴鍋3 、電爐4 、燒杯5 、量筒6 、移液管7 、玻璃棒8 、濾紙9 、漏斗10 、試劑瓶11 、電子天平12 、 pH 試紙（ pH114 ）1 / 9.四、實(shí)驗(yàn)試劑1 、干酵母粉2 、 0.2% 氫氧化鈉溶液：2g 氫氧化鈉溶

2、于蒸餾水并稀釋至1000ml 。3 、乙酸（ A.R. ）4、95% 乙醇5 、 無(wú)水乙醚（ A.R. ）6 、 10% 硫酸：濃硫酸（比重1.84 ） 10ml ，緩緩傾于水中，稀釋至100ml 。7 、氨水（ A.R. ）8 、 5% 硝酸銀溶液： 5g 硝酸銀溶于蒸餾水并稀釋至100ml ，貯于棕色瓶中。五、實(shí)驗(yàn)步驟( 一)RNA的提取 ：1 、稱取 2g 干酵母粉于100ml燒杯中， 加入 0.2% 氫氧化鈉溶液10ml ，沸水浴加熱30分鐘，經(jīng)常攪拌（如沸水浴過(guò)程中溶液蒸干可再加58ml氫氧化鈉）。冷卻，然后加入乙酸數(shù)滴， 使提取液呈酸性（ pH 試紙檢驗(yàn)， pH56），離心 10-

3、15分鐘（ ）。倒取上清液，加入2 倍體積的 95% 乙醇，邊加邊攪，加畢，靜置，待完全沉淀，過(guò)濾。2、濾渣先用 95% 乙醇洗 2 次，每次約 5 毫升，再用無(wú)水乙醚洗2 次，每次也約 5ml 。3、洗滌時(shí)可小心地用玻璃棒攪動(dòng)沉淀。乙醚濾干后，濾渣即為粗RNA ，可鑒定和測(cè)定含量用。（二）鑒定：1、取上述 RNA 約 0.5g ，加 10% 硫酸 5ml, 加熱至沸 12分鐘，將 RNA 水解。2、水解液 2ml ，加入氨水 2ml 和 5% 硝酸銀溶液 1ml ，觀察是否產(chǎn)生絮狀嘌呤銀化合物。2 / 9.注意事項(xiàng)：1 、離心管回收2 、離心的時(shí)候，要兩兩對(duì)稱放置，且離心管中溶液的量基本一樣

4、。否則會(huì)遭成離心機(jī)轉(zhuǎn)子的損壞。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果( 一)RNA的提取：加入乙酸使溶液呈酸性，溶液呈土黃色。進(jìn)行離心后，沉淀沉于離心管的下部，上半部分上清液呈土黃色。取上清液，加入2 倍體積的 95% 乙醇后，溶液呈現(xiàn)白色渾濁狀3 / 9.完全渾濁后，上清液呈白色，沉淀為白色。過(guò)濾洗滌后，得RNA 粗品。4 / 9.（二）鑒定：（1 ）水解后，溶液呈無(wú)色透明狀。5 / 9.加入氨水后，溶液仍澄清，溶液中似有油狀物質(zhì)產(chǎn)生。加入硝酸銀后，仍似有油狀物質(zhì)產(chǎn)生。6 / 9.一段時(shí)間后，產(chǎn)生白色絮狀沉淀。（2）取水解液0.5ml ，加苔黑酚三氯化鐵試劑1ml ，加熱至沸1min ，觀察顏色變化7 / 9.七、實(shí)

5、驗(yàn)分析稱取干酵母粉：2.0096g最后得到的RNA 粗品： 0.034 gRNA 提取率（ % ） =RNA質(zhì)量（ g ）/ 干酵母粉質(zhì)量（g ） x100%本實(shí)驗(yàn)中RNA 提取率（ % ）= 0.0346 g / 2.0096g = 1.722%（稀堿法提取的RNA 為變性 RNA ）本實(shí)驗(yàn)為定性實(shí)驗(yàn)，提取酵母中的RNA 中，產(chǎn)生白色沉淀時(shí)可能因副反應(yīng)產(chǎn)生的其他沉淀，即最終的沉淀中可能混有其他雜質(zhì)，不適于進(jìn)行定量測(cè)定。依據(jù)：酵母細(xì)胞富含核酸，且核酸主要是RNA ，含量為干菌體的2.67%10.0%，而 DNA含量較少，僅為0.03%0.516%。為此提取RNA 多以酵母為原料。工業(yè)上制備RN

6、A 多選用低成本、 適于大規(guī)模操作的稀堿法或濃鹽法。這兩種方法所提取的核酸均為變性的RNA ，主要用作制備單核苷酸的原料，其工藝比較簡(jiǎn)單。八、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1. 過(guò)濾時(shí) , 洗滌不能帶水 , 否則沉淀粘在濾紙上取不下來(lái)。8 / 9.2. 有時(shí)絮狀沉淀出現(xiàn)較慢 , 可放十多分鐘。3. 利用等電點(diǎn)控制RNA 析出時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格控pH 。4. 稀堿法提取的 RNA 為變性 RNA ，可用于 RNA 組分鑒定及單核苷酸制備，不能作為RNA 生物活性實(shí)驗(yàn)材料。九、思考題? 1 、簡(jiǎn)述核酸分離純化的一般原則。保持核算一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；盡量排除其他分子的污染，保持核酸純度。? 2 、 RNA 提取過(guò)程中的關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)有哪些？過(guò)濾時(shí)，洗滌不能帶水，否則沉淀粘在濾紙上