基因工程目基因分離和獲得及重組基因?qū)胫袊幙拼髮W(xué)生物工程所有

1、第四節(jié) 基因的分離和獲得目標(biāo)基因克隆的三大戰(zhàn)略：1.1.利用PCRPCR技術(shù)或化學(xué)合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆、表達(dá)；2.2.構(gòu)建感興趣的生物個(gè)體的基因組文庫或cDNAcDNA文庫；3.3.利用基因差異表達(dá)獲得目的基因?；虻姆蛛x和獲得的常用方法一、基因分離的物理方法二、鳥槍法(Shot gun) 又稱霰彈法三、cDNA文庫的建立與基因的分離四、基因組文庫法五、基因的化學(xué)合成六、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）一、基因分離的物理方法 根據(jù)DNA分子的兩條鏈存在著GC，A=T堿基配對。 如DNA分子中某段的GC堿基對含量高，則其熱穩(wěn)定性就高，其溶解溫度（Tm）就高。這樣，人們通過控制溶解溫

2、度使富A=T區(qū)解鏈變性，而富GC區(qū)仍維持雙鏈。當(dāng)利用單鏈核酸酶S，酶去除解開的單鏈部分，得到富GC區(qū)的DNA片段 。二、鳥槍法(Shot gun) 又稱霰彈法 用限制性內(nèi)切酶將基因組DNA進(jìn)行切割，得到很多在長度上與一般基因大小相當(dāng)?shù)腄NA片段（1000bp），然后，將這些片段混合物隨機(jī)地重組入適當(dāng)?shù)妮d體，轉(zhuǎn)化后在受體菌（如：E.Coli）中進(jìn)行擴(kuò)增，再用適當(dāng)?shù)暮Y選方法篩選出你所要的基因。優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，命中率較高。缺點(diǎn)：盲目性大，陽性片段不一定正好是基因，樣本多，可能會(huì)漏。+三、基因文庫法cDNA文庫（cDNA library) 則是將某生物特定的組織器官或發(fā)育時(shí)期的全部mRNA反轉(zhuǎn)錄成cD

3、NA，并全部克隆成重組子，在該重組子群集中包含了其全部表達(dá)基因的產(chǎn)物?；蚪M文庫(Genomic library)是將某一生物基因組DNA全部克隆后獲得的重組子群體的總稱。基因文庫(Gene library)是通過克隆的方法保存在適當(dāng)宿主中的某種生物、組織、器官或細(xì)胞類型的所有DNA片段而構(gòu)成的克隆集合體。構(gòu)建基因文庫的意義 1.通過基因文庫的構(gòu)建貯存和擴(kuò)增特定生物基因組的全部或部分片段，保存物種遺傳種質(zhì)。 2.從基因文庫中調(diào)出其中的任何DNA片段或目的基因。 3.構(gòu)建基因文庫是研究基因本身的需要,如基因結(jié)構(gòu)的分析、基因表達(dá)和調(diào)控的研究等。 基因組文庫的類型: 質(zhì)粒文庫、噬菌體載體文庫、粘粒文

4、庫、細(xì)菌人工染色體文庫和酵母人工染色體文庫。幾個(gè)物種基因組大小及基因數(shù)目物 種基因組大?。?10106 6bpbp）基因數(shù)目衣原體（M. M. genitaliumgenitalium）0.580.58470470大腸桿菌（E. coliE. coli）4.64.642884288酵母（S. cerevisiaeS. cerevisiae）13.513.560346034果蠅（D. D. melanogastermelanogaster）1651651360013600線蟲（C.elegansC.elegans）97971909919099擬南芥（A. thalianaA. thaliana）

5、1351352550025500人（H.sapinesH.sapines）330033003500035000構(gòu)建基因組文庫應(yīng)滿足的條件 基因組文庫的完備性：是從基因組文庫中篩選出含有某一目的基因的重組克隆的概率?；蚪M文庫的大小: 1: 1）基因組的大小； 2 2）克隆片斷的長度； 3 3）從中分離特定基因的置信度。 N=1n(1N=1n(1一P)P)ln1-L/Gln1-L/G式中P P為期望概率，L L為單個(gè)重組體的DNADNA片段的長度，G G為基因組DNADNA的總長度。N N是所需要的重組體數(shù)目 例如，某一哺乳動(dòng)物基因組G=3x10G=3x109 9bpbp，以17kb17kb的隨

6、機(jī)片段克隆構(gòu)建的文庫中，使任一給定DNADNA序列達(dá)9999的概率出現(xiàn)，則： N Nln(1-0.99)ln(1-0.99)ln1ln1一(17x10(17x103 33x103x109 9)=8.1x10)=8.1x105 5 如果克隆片斷長為20kb20kb，則N=6.5X10N=6.5X105 5果蠅的基因組約1.5X101.5X108 8bpbp，以20kb20kb克隆時(shí)，N=4X10N=4X105 5 基因組文庫的構(gòu)建 ( (一）基因組DNADNA的分離制備原核細(xì)胞的基因組包括其擬核的DNADNA和附加的遺傳體系如質(zhì)粒DNADNA，真核細(xì)胞的基因組包括其核基因組及細(xì)胞器如線粒體和葉綠

7、體的DNADNA。質(zhì)量必須滿足：1. 1. 結(jié)構(gòu)具有相對完整性；2. 2. 盡量排除其它大分子成分的污染( (蛋白質(zhì)、多糖及RNARNA等) )；3. 3. 保證提取樣品中不含對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑及離子等。 （二）基因組DNADNA的片段化1.1.限制性內(nèi)切酶對DNADNA分子的酶解兩種方式：DNADNA完全酶解和DNADNA不完全酶解。DNA完全酶解人基因組DNADNA酶解瓊脂糖凝膠M M：DNADNA分子markermarker；1 1：未酶解的人基因組DNADNA；2 2：Rsa IRsa I完全酶解后的DNADNAM 1 2DNADNA不完全酶解 人基因組DNADNA以Sau3AS

8、au3A酶進(jìn)行的不完全酶解M M：DNADNA分子markermarker；1 1：未酶解的基因組DNADNA；2-102-10：顯示酶解的程度逐步提高M(jìn)12345678910用DNADNA的隨機(jī)片斷克隆法來：機(jī)械剪切和部分酶切1)1)隨機(jī)片斷的重疊性，能夠沿某一克隆“步查”直至將整個(gè)染色體銜接起來（利用片段間重疊區(qū)的信息，可以將獨(dú)立的重組子加以銜接，最后整個(gè)染色體的順序連續(xù)出來：染色體步查 ）。 2)2)無須預(yù)知靶序列內(nèi)部及其周圍的限制酶切位點(diǎn)而仍能夠分離DNADNA片段。 3)3)文庫的規(guī)模減小。由于經(jīng)過挑選而用于克隆的DNADNA片段大，形成一個(gè)哺乳動(dòng)物基因組DNADNA文庫所需的重組體

9、數(shù)目顯著減少。DNADNA分子的物理剪切 運(yùn)用識(shí)別4 4對堿基的限制性內(nèi)切酶制備隨機(jī)性DNADNA片斷，具有了較高的隨機(jī)性，但相對隨機(jī)性更高的方式還是運(yùn)用不依賴堿基序列的物理剪切方法。DNADNA分子的物理剪切可以采用DNADNA溶液的小孔噴射、超聲波處理和高速攪拌等幾種方式。 選擇合適的構(gòu)建基因組文庫的載體： 1 1）要求有較大的克隆容量； 2 2）要求在置于宿主中擴(kuò)增時(shí)有較高而均等的轉(zhuǎn)化效率； 3 3）在重組子進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增的機(jī)會(huì)相近； 4 4）可以較方便地進(jìn)行文庫的篩選。 基因組文庫構(gòu)建的常用載體：LambdaLambda噬菌體載體、cosmidcosmid、BACBAC及YAC YA

10、C 。（三）載體制備 替換型載體進(jìn)行基因文庫的構(gòu)建示意圖 （四）重組連接制備出的適當(dāng)大小隨機(jī)性基因組DNADNA與載體左臂右臂進(jìn)行連接，實(shí)現(xiàn)左臂插入分子右臂的分子重組。構(gòu)建文庫時(shí)重組連接常采用相同粘性末端的連接，以 替換型載體構(gòu)建基因組文庫多采用BamH IBamH I酶切末端與插入外源DNA DNA Sau3A ISau3A I末端的互補(bǔ)連接。 （五）噬菌體離體包裝： 宿主菌蛋白支架狀前頭部前頭部A A蛋白結(jié)合在基因組共聚體的coscos位點(diǎn)尾部成熟噬菌體頭部功能 噬菌體自組裝及DNA包裝過程（六）重組噬菌體轉(zhuǎn)染大腸桿菌 噬菌體包裝物在宿主大腸桿菌菌苔上檢驗(yàn)效價(jià)及形成噬菌斑其他載體文庫的構(gòu)建

11、1.1.粘粒載體文庫 2.2.酵母人工染色體文庫 （yeast artificial chromosome,YACyeast artificial chromosome,YAC）: :YAC含有酵母染色體自主復(fù)制序列、著絲點(diǎn)(centromere)、四膜蟲的端粒（telesome以及酵母選擇標(biāo)記基因組成的能自我復(fù)制的克隆載體。并帶有大腸桿菌質(zhì)粒載體的復(fù)制元件和選擇標(biāo)記。 酵母選擇標(biāo)記基因：色氨酸合成酶基因（TRP1），組氨酸合成酶基因（HIS4），尿嘧啶合成酶基因（URA3），赭石突變校正基因（SUP4）。YAC 載體以環(huán)狀的方式存在，可插入長度達(dá)100-2000kb的外源DNA。與 YAC

12、YAC 載體配套工作的宿主酵母菌帶有一個(gè)赭石突變 ade ade 2 2。帶有這個(gè)突變的酵母菌在基本培養(yǎng)基上形成紅色菌落，當(dāng)帶有赭石突變抑制基因 supsup4 4 的載體存在于細(xì)胞中時(shí)，可抑制 ade ade 2-12-1基因的突變效應(yīng)，形成正常的白色菌落。無義突變：由于一對或幾對堿基對的改變而使決定某一氨基酸的密碼子變成一個(gè)終止密碼子的基因突變叫無義突變。其中密碼子改變?yōu)閁AGUAG的無義突變又叫琥珀突變，密碼子改變成UAAUAA的無義突變又叫赭石突變。 細(xì)菌人工染色體（Bacterial Artificial Chromosomes BACBacterial Artificial Chr

13、omosomes BAC） 細(xì)菌人工染色體通常是在大腸桿菌性因子F F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，命名為pBACspBACs，其裝載量范圍在50 - 300 kb50 - 300 kb之間。攜帶一個(gè)Cmr，嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制子oriS, 解旋酶基因repE, 確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細(xì)胞的基因座parA, parB, parC及多克隆位點(diǎn)重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞 以LambdaLambda噬菌體載體和cosmidcosmid載體構(gòu)建的重組分子在體外包裝成噬菌體顆粒，通過感染細(xì)菌的方式將重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。 以酵母人工染色體和細(xì)菌人工染色體載體構(gòu)建的重組分子采用電激轉(zhuǎn)化法將重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞?；蚪M文庫的擴(kuò)

14、增篩選 1.1.文庫的擴(kuò)增 lambdalambda載體的基因組文庫是以噬菌斑的形式獲得重組噬菌體的集合；cosmidcosmid載體的基因文庫是存在于細(xì)菌中的大分子重組質(zhì)粒，以獨(dú)立的轉(zhuǎn)化菌落形成集合； BACBAC文庫也是以細(xì)菌菌落形式存在； YACYAC文庫則以酵母菌形式出現(xiàn)。 噬菌體文庫的擴(kuò)增可以通過感染宿主，每一噬菌斑便是一個(gè)重組噬菌體擴(kuò)增后的產(chǎn)物。用緩沖液將這些噬菌斑中的病毒洗脫下來，便獲得了擴(kuò)增后的文庫。離心除出細(xì)菌碎片等雜質(zhì)后，上清液加1-21-2滴氯仿，置于4 40 0C C可以保存數(shù)年。 粘粒載體、BACBAC和YACYAC文庫，則對轉(zhuǎn)化的菌落單獨(dú)編號、擴(kuò)增和保存。 2.2.

15、文庫的篩選 硝酸纖維素膜或尼龍膜放射性標(biāo)記探針進(jìn)行文庫雜交篩選染色體步移(chromosome walking) 當(dāng)基因的位置已知，但沒有可用的探針，只知道同一染色體上的另外一個(gè)已經(jīng)克隆的基因，就可以通過染色體步移方法克隆所需的基因。其基本原理是用探針篩選文庫，得到陽性克隆后，將這個(gè)重組載體中的插入片段分離出來，然后用這個(gè)片段的末端部分(注意不能包含重復(fù)序列)作為新一輪篩查文庫的探針；得到新的重組載體中的插入片段，同上一個(gè)插入片段的末端部分(即探針序列)是重疊的，共有的。也就是這兩個(gè)片段是在同一條染色體上相互鄰接的。于是，再用新得的插入片段的末端部分作為探針，再去篩選文庫。通過一系列的操作，得

16、到的插入片段逐漸連接延伸，最后可以步移到待克隆的基因。 其基本策略是根據(jù)已知基因片段的末端序列合成探針，反復(fù)進(jìn)行基因文庫的篩選，知道滿足需要為止。染色體步移是一項(xiàng)復(fù)雜、繁瑣的技術(shù)，到目前為止，步移最大的距離時(shí)200-200-250kb250kb。然而成功的報(bào)道很多，如人類的囊腫性纖維化疾病基因。cDNA文庫的優(yōu)越性： 1 cDNA克隆以mRNA為材料，特別適用于某些RNA病毒，例如流感病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒和呼腸孤病毒等的基因組結(jié)構(gòu)研究及有關(guān)基因的克隆分離。 2 cDNA基因文庫的篩選比較簡單易行。 3 3每一個(gè)cDNAcDNA克隆對應(yīng)于一種mRNAmRNA序列，假陽性的概率就會(huì)比較低，因此陽性

17、的雜交信號一般都是有意義的，由此選擇出來的陽性克隆將會(huì)含有目的基因的序列。 4 4cDNAcDNA克隆可用于在細(xì)菌中表達(dá)基因的產(chǎn)物。 cDNA文庫的構(gòu)建與篩選cDNA文庫的大?。篶DNAcDNA基因文庫大小的估算公式 N=ln(l-P)/ln(l-f)N=ln(l-P)/ln(l-f)N N為cDNAcDNA基因文庫必需的克隆的數(shù)目；P P為文庫中含目的基因cDNAcDNA片段的出現(xiàn)概率，一般情況下，期望值為99%99%；f f是某種mRNAmRNA的豐度。 mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶cDNA復(fù)制雙雙鏈鏈c cD DN NA A載體重重組組D DN NA A分分子子受體菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌 cDNAcD

18、NA文庫的構(gòu)建：1.cDNA1.cDNA文庫構(gòu)建的載體cDNAcDNA是由mRNAmRNA反轉(zhuǎn)錄獲得的互補(bǔ)DNADNA，分子大小通常分布在0.5kb0.5kb10kb10kb間。 2. cDNA的獲得a.a.分離mRNAmRNA 分離總體RNARNA：利用guanidine thiocyanateguanidine thiocyanate（異硫氰酸胍） -mercaptoethanol-mercaptoethanol（- -巰基乙醇）使核糖體解體，而染色體不發(fā)生解體，再采用苯酚- -氯仿抽提和乙醇沉淀，獲得RNARNA。 利用mRNAmRNA分子的3 3端都含有一段由20-25020-250個(gè)

19、多聚腺核苷酸組成的poly(A)poly(A)尾巴將mRNAmRNA從細(xì)胞總RNARNA的混合物中分離出來。 GIT與巰基乙醇共同作用抑制RNase的活性；GIT與 十二烷基肌氨酸鈉 （Sarcosyl）作用使蛋白質(zhì)變性，從而釋放RNA；酸性條件下DNA極少發(fā)生解離，同蛋白質(zhì)一起變性被離心下來，RNA則溶于上清中。該法所提RNA純度高完整性好較適合純化mRNA，逆轉(zhuǎn)錄及構(gòu)建cDNA文庫，因此為大多數(shù)人采用。與氯化銫方法比較，雖然純度稍差一些，小分子RNA，如tRNA、snRNA不易去除，但產(chǎn)量高完整性好，鹽易去除。b. 對mRNA進(jìn)行富集 已知要分離的目的基因mRNA的分子大小，通過凝膠電泳或

20、蔗糖密度梯度離心，回收與目的基因mRNA分子大小相近的mRNA。 分離未知分子大小的目的基因cDNA,則可把最初制備的總mRNA先通過蔗糖密度梯度離心或凝膠電泳，按mRNA分子大小分部回收mRNA。隨后將每個(gè)分部回收的mRNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)譯，并結(jié)合使用免疫沉淀和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技木，鑒定出目的基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。再以此分部mRNA構(gòu)建cDNA基因文庫。通過離心和電泳的分部分離，可以使低豐度的mRNA得以富集。 細(xì)胞中的mRNA根據(jù)其在細(xì)胞中的拷貝數(shù)，可分為兩大類：一類為高豐度mRNA，通常有100種左右的不同的mRNA，每種mRNA的拷貝數(shù)在1,000至10,000間；另一類為低豐度mR

21、NA，包括約10,000種mRNA每種的拷貝數(shù)在1至10間。c. cDNAc. cDNA的合成 cDNAcDNA第一鏈的合成是以mRNAmRNA分子為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，利用適當(dāng)?shù)囊镆龑?dǎo)合成的。常用方法有，即oligo-(dT)oligo-(dT)引導(dǎo)的cDNAcDNA合成法和隨機(jī)引物引導(dǎo)的cDNAcDNA合成法。oligo-(dT)oligo-(dT)引導(dǎo)的cDNAcDNA合成法是利用12-2012-20個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷組成的oligo-(dT)oligo-(dT)短片段作為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNAmRNA為模板合成第一鏈cDNAcDNA，形成RNA-DNARNA-DN

22、A雜交分子。 G G G G G G G G G G G G G G d.粘性末端片斷與載體的連接人工接頭法克隆cDNAcDNA入 插入型載體e.離體包裝獲得重組噬菌體 文庫的篩選： 篩選文庫即指從文庫克隆的群體中將特定的克隆選擇出來的過程。分離基因的依據(jù)：根據(jù)目的基因的某些或某個(gè)特性來進(jìn)行克隆篩選及基因分離。對于編碼產(chǎn)物已知的目的基因： 1.1.可以根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列推導(dǎo)出核苷酸序列，并以該核苷酸序列作為探針進(jìn)行直接的分離。2.2.可以應(yīng)用特定的蛋白質(zhì)抗體及蛋白質(zhì)的功能測定來篩選相應(yīng)的目的基因。編碼產(chǎn)物未知的目的基因：需要用特殊的分離手段( (諸如差別顯示技術(shù)、差別雜交方法等) )獲得探

23、針，然后再進(jìn)一步從基因文庫中分離得到目的基因。運(yùn)用簡并探針篩選cDNAcDNA文庫1.1.運(yùn)用氨基酸序列信息進(jìn)行cDNAcDNA文庫篩選運(yùn)用簡并探針篩選cDNAcDNA文庫運(yùn)用標(biāo)記抗體對cDNAcDNA文庫進(jìn)行篩選2.2.運(yùn)用標(biāo)記抗體對cDNAcDNA文庫進(jìn)行篩選3.3.分子探針雜交的方法，通過分子雜交后的信號，將與探針特異結(jié)合的克隆釣取出來。噬菌斑的吸印與雜交利用差別雜交方法對文庫進(jìn)行篩選4 . 4 . 運(yùn)用PCRPCR方法進(jìn)行cDNAcDNA文庫篩選基因組文庫與鳥槍法的不同點(diǎn)1、克隆的DNA片段較大（1030Kb，平均20Kb)，而鳥槍法為1000bp;2、可以覆蓋宿主DNA的所有序列；3

24、、DNA片段要進(jìn)行分離： 分離方法如：蔗糖密度梯度離心 凝膠電泳4、載體不同?；蚪M文庫法為噬菌體，而鳥槍法為質(zhì)粒。值得注意的是，從基因組文庫所分離獲得的基因序列包含有內(nèi)含子，因此不能直接在原核細(xì)胞中表達(dá)，但更適合作為如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等的真核表達(dá)系統(tǒng)。四、基因的化學(xué)合成 隨著寡核苷酸化學(xué)合成的自動(dòng)化，基因的化學(xué)合成變得更經(jīng)濟(jì)、容易和準(zhǔn)確。前提條件：對基因的結(jié)構(gòu)序列清楚 。分為：基因片段的全化學(xué)合成 基因的化學(xué)酶促合成H HOHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeOHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeH基因的化學(xué)合成的優(yōu)點(diǎn)1、可以合成細(xì)菌偏愛的密碼子

25、2、可以定向改變個(gè)別氨基酸3、可以在兩端加上需要的限制酶切點(diǎn)4、可以通過自動(dòng)化儀器合成五、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCRPCR）定義：聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)是指在四種脫氧核苷三磷酸（dNTP）存在下，以寡聚核苷酸為引物，以單鏈DNA為模板，經(jīng)DNA聚合酶催化，合成DNA互補(bǔ)鏈達(dá)到基因擴(kuò)增目的的過程。 PCR技術(shù)反應(yīng)周期包括三個(gè)步驟：1、高溫變性：通過加熱使得復(fù)制雙螺旋DNA變性分 離為單鏈，作為模板。（91，1分鐘）。2、低溫退火：（約50，1分鐘）使專門設(shè)計(jì)的一 對寡核苷酸引物在此低溫條件下分別與單鏈模 板DNA兩端的互補(bǔ)區(qū)段互補(bǔ)結(jié)合。3、適溫延伸：將反應(yīng)混合物的溫度上升到72， 保溫1分鐘。 PCR原

26、理圖 PCR反應(yīng)的必要條件反應(yīng)的必要條件： 須知基因兩端的部分序列PCR反應(yīng)中的幾個(gè)關(guān)鍵因素1、Taq DNA聚合酶 2、引物的長度3、模板 4、Mg濃度5、溫度循環(huán)參數(shù)PCR反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)：1、操作簡單 2、通用性好 3、成功率高PCR主要參數(shù)確定：主要參數(shù)確定：退火溫度退火溫度MgMg2+2+反應(yīng)時(shí)間循環(huán)次數(shù)反應(yīng)時(shí)間循環(huán)次數(shù)RE1RE2Sequencing已知靶序列擴(kuò)增側(cè)翼序列的PCRPCR常規(guī)PCR衍生的幾種基因克隆技術(shù)（一）反向PCR (inverse PCR)（二）熱不對稱交錯(cuò)PCR (thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR)簡并引物是指用

27、來編碼一段短肽序列的不同堿基序列的混合物。 原理：根據(jù)目標(biāo)序列的側(cè)翼已知序列設(shè)計(jì)個(gè)嵌套的特異引物（sp1, sp2, sp3,約20bp），用它們分別和一個(gè)具有低Tm值的短隨機(jī)簡并引物（arbitrary degenerate primer, AD, 約14bp)相結(jié)合，以基因組為模板，根據(jù)引物長度及特異性的差異設(shè)計(jì)不對稱的溫度循環(huán)，通過分級反應(yīng)來擴(kuò)增特異引物。 TAIL-PCR分三輪反應(yīng)（1 1）提取基因組 total RNAtotal RNA（2 2）反轉(zhuǎn)錄合成總cDNAcDNA作模板（4 4）PCRPCR擴(kuò)增（3 3）根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物原核生物不易得到mRNAmRNA，也不含有po

28、lyApolyA尾。適合擴(kuò)增真核生物基因。目的基因 的引物1 1反轉(zhuǎn)錄成目的基因cDNAcDNA第一鏈目的基因 的引物2 2目的 基因cDNAcDNA第二鏈PCRmRNA（四）錨定PCR PCR （五）cDNAcDNA末端的快速擴(kuò)增cDNAcDNA末端的快速擴(kuò)增（rapid amplification of rapid amplification of cDNA ends, RACEcDNA ends, RACE）是克隆目標(biāo)基因cDNAcDNA的一種常用方法。這種方法根據(jù)基因編碼蛋白的同源性或者多個(gè)同源基因cDNAcDNA比較的變異情況，將同源性基因cDNAcDNA的核心區(qū)段分析出來，針對核心

29、區(qū)段保守性高的位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，然后運(yùn)用RT-PCRRT-PCR先擴(kuò)增和克隆核心序列區(qū)。在測定核心序列后，根據(jù)核心序列設(shè)計(jì)新的引物并分別進(jìn)行cDNA 3cDNA 3 端和5 5 端的擴(kuò)增。最后拼湊成cDNAcDNA全序列的信息并設(shè)計(jì)新的一對引物將其RT-PCRRT-PCR擴(kuò)增并克隆。GAAAAAAAAAAAReverse transcriptoligo(dT)dNTPsreverse transcriptaseGAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTmRNAcDNAPCRdegenerate primersTaq polymerasesequence and designRACE prime

30、rs5 RACE3 RACEAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTGAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTRACE RACE 示意圖 利用oligo(dT)oligo(dT)引物反轉(zhuǎn)錄cDNAcDNA第一鏈后，以核心區(qū)段引物擴(kuò)增出中間核心片段，測序后可以設(shè)計(jì)出3 3 RACERACE的上游引物和5 5 的下游引物，3 3 端上游引物結(jié)合oligo(dT)oligo(dT)下游引物將cDNA3cDNA3 端克隆出來。1.1.分析核心區(qū)段 利用已克隆的人和果蠅的基因資料，克隆蚊子的胰蛋白酶基因cDNAcDNA。先比較人和果蠅胰蛋白酶氨基酸序列的同源性 . .2.2.設(shè)計(jì)簡并引物和擴(kuò)增核

31、心區(qū)段 氨基酸序列 W(Trp)V(Val)L(Leu)T(Thr)A(Ala)密碼子UGGGTTTTAACTGCTCGCCACTTAAGCGGGA3.3.設(shè)計(jì)RACERACE引物擴(kuò)增的核心區(qū)段克隆和測序后，即獲得了目標(biāo)基因中間部分的序列，根據(jù)這一序列分別設(shè)計(jì)3 3 RACE RACE的上游引物和5 5 RACE RACE的下游引物。4.34.3 端RACERACEcDNA 3cDNA 3 的快速克隆比較簡單，根據(jù)中間核心序列設(shè)計(jì)出3 3 端RACERACE的上游引物后，利用oligo(dT)oligo(dT)作為下游引物，利用mRNAmRNA反轉(zhuǎn)錄體系作為模板，PCRPCR在兩引物間將cDN

32、A3cDNA3 端擴(kuò)增出來。 5. 5 5. 5 端RACERACE5 5 端RACERACE時(shí)，盡管其下游引物根據(jù)克隆的核心序列可以確定下來，但由于5 5 端上游序列還未知，上游的引物難以確定，因而5 5 RACE RACE要采用一些特殊方法確定其上游引物位點(diǎn)。 BDBD公司SMART cDNA 5SMART cDNA 5 端RACERACE試劑盒原理圖在反轉(zhuǎn)錄酶（RTRT）作用下，利用Oligo(dT)Oligo(dT)作引物合成cDNAcDNA第一鏈，RTRT在cDNAcDNA第一鏈末端延伸合成了幾個(gè)C C堿基，體系中加入的3 3 端為G G堿基的寡聚序列與cDNAcDNA末端互補(bǔ)，作為

33、cDNAcDNA繼續(xù)延伸合成的模板，在cDNAcDNA的末端合成出一段已知序列，形成5 5 RACERACE的引物位點(diǎn)。五、 根據(jù)基因差異表達(dá)獲得目的基因1.1.差異顯示PCRPCR（DD-PCRDD-PCR）差異顯示技術(shù)的原理和實(shí)驗(yàn)程序: : 19921992年，LiangLiang和PardeePardee首次提出差異顯示技術(shù)(DD-PCR)(DD-PCR)，其基本原理是，利用一系列的oligo(dT)oligo(dT)引物，逆轉(zhuǎn)錄真核生物細(xì)胞中全部表達(dá)的mRNAmRNA，通過PCRPCR擴(kuò)增的方法，轉(zhuǎn)換成cDNAcDNA雙鏈，再利用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，將有差異的片段分開，篩選出目的基

34、因。其技術(shù)一般包括下列步驟：(1)(1)從植物組織中提取總RNARNA，在這個(gè)步驟中注意不能有DNADNA污染，一般用無RNARNA酶的DNADNA酶在3737下處理30 min30 min；(2)在在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，以O(shè)ligo (dTMN)Oligo (dTMN)為引物(M(M為G G、A A、 C C中的任一種，N N為A A、C C、G G、T T任一種) )，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；(3)PCR(3)PCR反應(yīng)，擴(kuò)增cDNAcDNA的第一條鏈；(4)(4)擴(kuò)增后的cDNAcDNA進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，使差異表達(dá)的cDNAcDNA片段在6%6%測序膠上分開；(5)(5)找出不同處理間差異顯示的條

35、帶，從膠上切割下來，并回收，再進(jìn)行第二次擴(kuò)增；(6)(6)克隆差異片段，差異片段可作為探針；(7)Northern (7)Northern 雜交，驗(yàn)證目的片段，去掉假陽性片段；(8)(8)對目的片段進(jìn)行測序；(9)(9)以克隆的目的片段為探針，從基因組文庫中篩選出相應(yīng)的全長基因。DD-PCRDD-PCR法具有快速、靈敏、簡單和可分析低豐度mRMAmRMA的優(yōu)點(diǎn)已為植物的基因表達(dá)研究和基因克隆所證實(shí)。但也有一些缺點(diǎn)，如擴(kuò)增片段短、假陽性高、檢測全部mRMAmRMA工作量大、基因的克隆受mRMAmRMA表達(dá)的時(shí)效性影響等。 DD-PCRDD-PCR的技術(shù)流程mRNA differential di

36、splay RT-PCRmRNA differential display RT-PCR（1 1）3 3端的錨定引物Oligo(dT)Oligo(dT)引物的3 3端加兩個(gè)核苷酸（倒數(shù)第二個(gè)不再是T T）。AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA35NMTTTTTTTTM：A、GorCN:A、G、TorC53AGTTTTTTTT53CGTTTTTTTT53GGTTTTTTTT53TGTTTTTTTT53AATTTTTTTT53CATTTTTTTT53GATTTTTTTT53TA TTTTTTTT53ACTTTTTTTT53CCTTTTTTTT53GCTTTTTTTT53TCTTTTTTTT53

37、10merAAAAAAAAAAAAAAAAmRNA35NMTTTTTTTT53擴(kuò)增cDNAcDNA第一鏈。RTNMTTTTTTTT5cDNA 3NNNNNNNNNN53NNNNNNNNNN53cDNAcDNA第二鏈，并PCRPCR1212種錨定引物，若與2020種隨機(jī)引物，可組成240240組引物。引物組合：240240組在能分出2000020000多條帶！實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如果每條帶相當(dāng)于一種mRNAmRNA，20000 mRNA20000 mRNA基本上反映了一種特定細(xì)胞中全部的mRNAmRNA。在測序膠上，每組擴(kuò)出50-10050-100條長度為100-100-500bp500bp的帶。不同組織

38、的240240組引物組合PCRPCR產(chǎn)物在測序膠中電泳。選擇有差異的帶，進(jìn)一步PCRPCR作探針。篩選文庫，找到差別基因的全長序列。3.3.代表性差異分析 此法是由HubankHubank和Schatz1994Schatz1994年提出的。將合成的cDNAcDNA酶切，通過降低cDNAcDNA群體復(fù)雜度和多次更換cDNAcDNA兩端接頭等方法，特異擴(kuò)增目的基因片段，重復(fù)性好，假陽性低。其主要步驟是，提取總RMARMA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNAcDNA，用識(shí)別4 4個(gè)堿基的限制性內(nèi)切酶消化，連接接頭，擴(kuò)增出不同的代表子，進(jìn)行TesterTester與DriverDriver雜交，消減雜交富集，從而找出

39、差異cDNAcDNA片段。SchematicdiagramofimprovedcDNArepresentationaldifferenceanalysis(RDA)procedureBasicstrategyforcDNA-basedrepresentationaldifferenceanalysis. 第五節(jié)第五節(jié) 重組重組DNA向宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移技術(shù)向宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移技術(shù)由于外源基因與載體構(gòu)成的重組DNA分子性質(zhì)不同、宿主細(xì)胞不同，將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的具體方法也不相同。轉(zhuǎn)化：是指微生物細(xì)胞直接吸收外源DNA的過程。是使重組體DNA分子在熱休克的短暫時(shí)間內(nèi)被導(dǎo)入受體。熱休克后將受體菌在不含

40、抗生素的培養(yǎng)液中生長至少30分鐘以上，使其蛋白得到足夠表達(dá)，以便能在含抗生素的瓊脂培養(yǎng)平板上生長。由于E.coliX1776菌株用CaCl2處理后制備的感受態(tài)細(xì)胞長期冷藏仍能保持其攝取外源DNA的能力，故常用作受體菌。 轉(zhuǎn)染：是指噬菌體、病毒、或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)胞的過程。 (其中又分磷酸鈣沉淀法與體外包裝法)轉(zhuǎn)導(dǎo)：重組的噬菌體DNA或重組的粘粒DNA必須包裝成完整的噬菌體顆粒，通過溫和噬菌體顆粒的釋放和感染將重組DNA轉(zhuǎn)移至宿主內(nèi)的過程。重組DNADNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的途徑轉(zhuǎn)化：transfermationtransfermation，通過生物學(xué)或理化方法使質(zhì)粒DNADNA或以質(zhì)

41、粒DNADNA為載體構(gòu)建的重組DNADNA導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程，主要用于原核生物。轉(zhuǎn)染：transfectiontransfection，是轉(zhuǎn)化的一種特殊形式，指病毒或以病毒為載體構(gòu)建的重組DNADNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，并使宿主遺傳性狀發(fā)生改變的過程，其中包括DNADNA、RT-DNART-DNA及RNAiRNAi，主要用于原核生物。轉(zhuǎn)導(dǎo):( transduction ) 以噬菌體作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。1.直接轉(zhuǎn)化法有的微生物細(xì)胞在不加任何處理的情況下就能直接攝取外源DNA，只要外源DNA與這樣的細(xì)胞混合，在適宜的條件下懸浮培養(yǎng)，就能完成外源DNA的轉(zhuǎn)化。

42、細(xì)菌轉(zhuǎn)化：指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來自另一細(xì)菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳性改變的生命過程。這種提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫給體菌株，而接受轉(zhuǎn)化DNA的寄主菌株叫受體菌株。大腸桿菌是目前基因工程中最常用的受體細(xì)胞。通常采用的是大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞，即在冰浴中用一定濃度的CaClCaCl2 2處理對數(shù)生長期的大腸桿菌，以獲得高效轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。也有采用Rb+Rb+、Mn2+Mn2+、K+K+、二甲亞礬、二硫蘇糖醇(DTT)(DTT)或用氯化己胺鈷處理制備感受態(tài)細(xì)胞。感受態(tài)：是指受體細(xì)胞能吸收外源DNADNA分子而有效地作為轉(zhuǎn)化受體的某些生理狀態(tài)。一般受體細(xì)胞在對數(shù)生長期轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)。感受態(tài)細(xì)

43、胞(competent cell):具有易于接受外源DNA能力的細(xì)胞。基因工程中，宿主細(xì)胞需經(jīng)人工處理成能吸收重組DNA分子的敏感狀態(tài)，才能用于轉(zhuǎn)化，這種敏感細(xì)胞稱為人工感受態(tài)細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞的制取一般是將細(xì)菌（如大腸桿菌等）用一定濃度的冰冷CaCl2處理而得。1970年建立此技術(shù)，其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞變?yōu)楦惺軕B(tài)細(xì)胞。 為了得到較好的感受態(tài)細(xì)胞，需注意以下幾點(diǎn)：1、細(xì)胞要處于對數(shù)生長期2、整個(gè)制備過程要在低溫（04）進(jìn)行3、為了提高轉(zhuǎn)化率，可選用復(fù)合氯化鈣溶液操作程序：1處于對數(shù)生長期的細(xì)菌置于0的CaCl2低

44、滲溶液中，使細(xì)胞膨脹，同時(shí)Ca2+使細(xì)胞磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，使得外膜與內(nèi)膜間隙的部分核酸酶離開所在區(qū)域，構(gòu)成大腸桿菌人工誘導(dǎo)的感受態(tài)；2加入DNA，Ca2+與DNA形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基-磷酸鈣復(fù)合物，并粘附在細(xì)菌細(xì)胞膜外表面；3經(jīng)短暫42熱激處理后，細(xì)菌細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動(dòng)，出現(xiàn)許多間隙，導(dǎo)致通透性增加，DNA分子進(jìn)入細(xì)胞中。2.化合物誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法原理：外源DNA與多聚物（聚乙二醇(PEG)、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等）、二價(jià)陽離子（Mg、Ca、Mn等）混合，再與受體細(xì)胞或原生質(zhì)體混合，可使外源DNA進(jìn)入細(xì)胞。尤以PEG應(yīng)用最廣，可用于原核生物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和植物原生質(zhì)體的基因轉(zhuǎn)化。

45、PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 Davey1980年和Krens1985年首先建立的。 步驟 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：將制備的原生質(zhì)體懸浮液與重組DNA一起保溫培養(yǎng)，同時(shí)加入PEG在pH8-9下促進(jìn)原生質(zhì)體攝取DNA，從而使細(xì)胞轉(zhuǎn)化。 通常使用的PEG分子量3000左右。 轉(zhuǎn)化效率很低10-510-63.高壓電穿孔轉(zhuǎn)化法（1）Electroproration原理：利用高壓電脈沖作用，使細(xì)胞膜上產(chǎn)生可逆的瞬間通道，從而促進(jìn)外源DNA和高分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化，但不傷及細(xì)胞，切斷電場后，被擊穿的膜孔可以自行恢復(fù)。當(dāng)電場強(qiáng)度和脈沖時(shí)間結(jié)合導(dǎo)致50-70%細(xì)菌死亡時(shí)，轉(zhuǎn)化水平最高。（2）過程：把宿主細(xì)胞置于外加電場

46、中，通過電脈沖作用在細(xì)胞膜上打孔，DNA分子進(jìn)入細(xì)胞。（3）條件：電壓300600V、時(shí)間20100ms、溫度0。（4）適用范圍：酵母菌、霉菌等真核生物，適用于農(nóng)桿菌感染不敏感的植物。（5）形式：電穿孔電穿孔+PEG。轉(zhuǎn)化效率10-510-6，1.2%例如：高壓電穿孔法轉(zhuǎn)化細(xì)菌對數(shù)生長期的細(xì)菌對數(shù)生長期的細(xì)菌冷卻冷卻離心離心低鹽緩沖液清洗低鹽緩沖液清洗用用10%甘油懸浮細(xì)胞甘油懸浮細(xì)胞干冰速凍干冰速凍-70貯存貯存有效期有效期6W外加外加電場電場（300-600V維持維持20100ms）電脈沖電脈沖轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞0-4 4.微彈轟擊轉(zhuǎn)化法（microprojectilebombardment

47、,particlebombardment）該法亦稱基因槍法(particlegun)，粒子轟擊法，生物彈法（Biolistics）。（1）原理：金屬微粒在外力作用下，達(dá)到一定速度后，將包裹在金屬顆粒表面的外源DNA分子隨金屬顆粒一起進(jìn)入植物細(xì)胞，但又不引起細(xì)胞致命傷害而維持正常的生命活動(dòng)。（2）過程：外源DNA與鎢、金等金屬微?；旌希笵NA吸附在微粒表面；用基因槍轟擊，通過氦氣沖擊波使DNA隨金屬微粒進(jìn)入植物細(xì)胞。（3）適用范圍：植物細(xì)胞。（4）特點(diǎn)：操作簡單，轉(zhuǎn)化率高，省去了分離原生質(zhì)體的麻煩，耗資較大。DNA微粒載體的制備原理是CaCl2對DNA沉淀作用，亞精胺、聚乙二醇具有粘附作用、將

48、這些化合物與DNA混合后與鎢粉或金粉混合，吹干后，則DNA沉淀在載體顆粒上基因槍介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移基因槍法最早是由美國康奈爾大學(xué)的Sanford(1987)最先提出的。它通過高速飛行的金屬顆粒將包被其外的目的基因直接導(dǎo)入到受體細(xì)胞內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的方法。1992年，世界首例轉(zhuǎn)基因小鼠就是通過該法獲得的。 一類是以火藥爆炸力作為動(dòng)力加速微彈； 第二類是以高壓氣體(highpressuregas)作為動(dòng)力，如以氦氣、氫氣、氮?dú)獾?。其工作原理是把載有DNA的鎢(金)粉噴灑在一張微粒載片上，電極間懸滴著微水滴。在壓縮空氣的沖擊下，微水滴霧狀噴射，驅(qū)動(dòng)載片。當(dāng)載片受阻于金屬篩網(wǎng)時(shí),載有DNA的鎢(金)

49、粒繼續(xù)向下沖擊射入細(xì)胞。第三類是以高壓放電為驅(qū)動(dòng)力。其最大優(yōu)點(diǎn)是可以無級調(diào)速，通過變化工作電壓，粒子速度及射入濃度可準(zhǔn)確控制，使載有DNA的鎢(金)粉粒子能到達(dá)具有再生能力的細(xì)胞層。這一點(diǎn)非常重要，因?yàn)椴煌耐庵搀w需要不同的參數(shù)。采用該放電轟擊、已在大豆和水稻上成功地獲得了轉(zhuǎn)基因植株(Christou等，1992)5.顯微注射法（microinjection）（1）原理：利用顯微注射儀，通過機(jī)械方法把外源DNA直接注入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核（需用特制的玻璃微管）。倒置顯微注射儀（2）過程：將外源基因直接注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物受精卵原核，外源基因整合到動(dòng)物基因組，通過胚胎移植把含有外源基因的受精卵移植到受體子宮并

50、發(fā)育。（3）適用范圍：真核生物，早期用于動(dòng)物，現(xiàn)已應(yīng)用于植物。（4）特點(diǎn)：繁瑣耗時(shí)、轉(zhuǎn)化率高，但需專門的顯微注射儀，且要求操作者有精細(xì)的操作技術(shù)和低密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。受體細(xì)胞的固定動(dòng)物細(xì)胞具有獨(dú)特的貼壁生長待性，不存在固定細(xì)胞的問題植物細(xì)胞必須先建立細(xì)胞固定技術(shù)目前有三種方法：瓊脂糖包埋法：把低熔點(diǎn)的瓊脂糖熔化，冷卻到一定溫度后將制備的細(xì)胞懸浮液混合于瓊脂糖中。需要注意的問題是，在包埋時(shí)細(xì)胞約1/3-1/2暴露在瓊脂糖表面，即細(xì)胞體的一半埋在瓊脂糖中，起固定作用，暴露的一半細(xì)胞可一進(jìn)行微針注射、否則瓊脂固化后很難進(jìn)行。多聚-L-賴氨酸粘連法：先用多聚-L-賴氨酸處理玻片表面，由于聚賴氨酸對細(xì)胞

51、有粘連作用，因此當(dāng)分離的細(xì)胞或原生質(zhì)體與玻片接觸時(shí)被固定在玻片上。而且一個(gè)破片上可固定較多數(shù)量的細(xì)胞或原生質(zhì)體。吸管支持法：用一固定的毛細(xì)管將原生質(zhì)體或細(xì)胞吸著在管口起到固定作用，然后再用微針進(jìn)行DNA注射。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是吸管可以旋轉(zhuǎn)或移動(dòng)位置使操作者能選擇最佳位置進(jìn)行注射。顯微注射用的微針通常用拉針機(jī)制備，尖針直徑以0.5m左右為宜。一次注入細(xì)胞質(zhì)中的DNA量約為10-9ml。轉(zhuǎn)化率及影響因素顯微注射雖然操作繁瑣耗時(shí)，但其轉(zhuǎn)化效率很高已發(fā)展出一套完善的技術(shù)，在煙草、油菜、苜蓿等植物的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化率高達(dá)60以上。影響轉(zhuǎn)化率的因素。(1)原生質(zhì)體的成活率是轉(zhuǎn)化率的重要因素，只有注射那些能夠分裂

52、、成活的原生質(zhì)體才能得到轉(zhuǎn)化。因此，注射時(shí)要選擇啟動(dòng)分裂、細(xì)胞壁開始形成的原生質(zhì)體進(jìn)行注射。(2)線性DNA比環(huán)形DNA具有更高的轉(zhuǎn)化率。(3)操作要迅速敏捷，選擇最佳的注射強(qiáng)力和濃度，使細(xì)胞的損傷減少到最小程度。(4)固定技術(shù)要可靠，不能損傷細(xì)胞。顯微注射特點(diǎn)方法簡單、轉(zhuǎn)化率高；6-8%它是一種純粹的物理方法，適用于各種植物和各種材料，無局限性；整個(gè)操作過程對受體細(xì)胞無藥物等毒害，有利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長發(fā)育；轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)過程無需特殊的選擇系統(tǒng)。缺點(diǎn)是需要有精細(xì)操作的技術(shù)及低密度培養(yǎng)的基礎(chǔ)，注射速度慢、效率低，要求研究者有耐心。6. 6. 脂質(zhì)體（liposomeliposome）介導(dǎo)法（1）

53、原理：受體細(xì)胞的細(xì)胞膜表面帶負(fù)電荷，脂質(zhì)體顆粒帶正電荷，利用引力的作用把遺傳物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。即用脂類化學(xué)物質(zhì)包裹DNA成球體，通過植物原生質(zhì)體的吞噬或融合作用把內(nèi)含物轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。脂質(zhì)體是根據(jù)生物膜的結(jié)構(gòu)功能特性合成生物膜，然后把DNA包裹在人工膜內(nèi)。（2）過程：在形成脂質(zhì)體時(shí)，把用來轉(zhuǎn)染的目的DNA分子包裹在其中；脂質(zhì)體與細(xì)胞接觸；外源DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。（3）適用范圍：真核細(xì)胞。（4）特點(diǎn)：包在脂質(zhì)體內(nèi)的DNA可免受細(xì)胞內(nèi)核酸酶的降解，所以可直接轉(zhuǎn)化外源DNA；對植物病毒RNA的轉(zhuǎn)化率高；如用PEG誘導(dǎo)脂質(zhì)體與原生質(zhì)體融合可獲得高的轉(zhuǎn)化率。410-5(5)影響脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化率的因素很多：脂

54、質(zhì)體的制備類型、方法均有明顯差異；PEG的濃度、加入時(shí)間、PH值及ca”濃度均起到重要作用；保溫培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化時(shí)的條件同樣十分重要。7.花粉管通道法（1）原理：在花粉管通道形成之后封閉之前一段時(shí)間，使外源DNA能沿著花粉管通道進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具正常細(xì)胞壁的卵細(xì)胞、合子或早期胚胎細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。（2）適用范圍：植物（3）特點(diǎn)：直接得到轉(zhuǎn)化種子，不經(jīng)過組培，減少了基因型的影響；操作簡單經(jīng)濟(jì)，無需昂貴儀器和化學(xué)藥品，可直接在大田操作；大量快捷，性狀穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化率高；可獲得110-2110-1的高遺傳轉(zhuǎn)化率。 不僅可以導(dǎo)入供體的總DNA，而且可導(dǎo)入含目的基因的質(zhì)粒，甚至可將化學(xué)誘變劑導(dǎo)入胚囊。缺

55、點(diǎn)：工作時(shí)間受自然花期限制，田間操作受環(huán)境影響大，基因組以隨機(jī)方式結(jié)合，要求工作人員經(jīng)濟(jì)性要強(qiáng)，工作效率較低。 我國科學(xué)家周光宇在1983年首次在“MethodsinEn-zymology”報(bào)道的研究成果。 現(xiàn)該技術(shù)主要在蔬菜育種上應(yīng)用。（白菜、茄子、黃瓜、番茄、辣椒等操作步驟: 1.外源DNA的制備 2.分析受體植物的受精過程及時(shí)間，確定導(dǎo)入外源DNA的時(shí)間方法（3種） 柱頭涂抹法 柱頭切除法 花粉粒吸入法 3.后代材料處理8.超聲波介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法（1）原理：利用低音強(qiáng)脈沖超聲波的物理作用，可逆性的擊穿細(xì)胞膜并形成過膜通道，使外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞。（2）特點(diǎn)：避免脈沖變電壓對細(xì)胞的損傷，有利于

56、細(xì)胞存活整個(gè)操作轉(zhuǎn)化率較高，如在轉(zhuǎn)化反應(yīng)中加入DMSO或攜帶DNA則轉(zhuǎn)化率更高。60-70%（3）適用范圍：微生物、植物過程:無菌材料的制備質(zhì)粒DNA的提取超聲波緩沖液配置超聲波處理（去無菌材料切成小塊，放入無菌超聲波小室，同時(shí)加入5%DMSO緩沖液，質(zhì)粒DNA20ug/ml及鮭魚精DNA40ug/ml，室溫下超聲波處理30min）處理后用緩沖液洗3次接種在MS或其他培養(yǎng)基上培養(yǎng)9.激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法 早在1984年Tao等首先利用激光微束對動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、此庸Web等利用激光微束技術(shù)對原生質(zhì)體、花粉以及活細(xì)胞內(nèi)的葉綠體進(jìn)行外源DNA導(dǎo)入獲得成功，并用熒光標(biāo)記的大腸桿菌pBR322

57、質(zhì)粒DNA在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中得到檢測。（1）原理：利用直徑很小、能量很高的激光微束能引起細(xì)胞膜可逆性穿孔的原理。在熒光顯微鏡下找適合的細(xì)胞，然后用激光代替熒光光源，聚焦后發(fā)出激光微束脈沖，造成膜穿孔外于細(xì)胞周圍的外源DNA分子隨之進(jìn)入受體細(xì)胞。（2）特點(diǎn)：操作簡便快捷，轉(zhuǎn)化效率高10-3-10-4，無宿主限制，但需要貴重儀器，技術(shù)條件要求高，穩(wěn)定性和安全性不如電穿孔法和基因槍法。（3）適用范圍：動(dòng)植物細(xì)胞、組織、器官及線粒體、葉綠體。過程1）DNA的提取2)受體植物樣品制備：將欲照射的植物細(xì)胞或組織用高滲緩沖液浸泡數(shù)分鐘，不同作物不同外植體所用高滲液不同，浸泡時(shí)間也不同。3)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞懸浮液準(zhǔn)備：激光

58、照射前洗去高滲液，加新鮮培養(yǎng)液。吸取0.5mI細(xì)胞懸浮液，加50ul質(zhì)粒DNA或植物外源DNA(濃度5ugml)一起注入激光微束系統(tǒng)的Rose小室。4)激光微束照射：激光微束顯微照射裝置如為NdYAG四集倍頻脈沖激光冠微照射系統(tǒng)、即輸出波長技需要選擇，脈寬10-15ns。激光束引入一臺(tái)相差顯微鏡，用40物鏡聚焦Y于欲照射的細(xì)胞。光斑直徑為1.3nm。照射時(shí)移動(dòng)載物臺(tái)，使激光脈沖在植物細(xì)胞團(tuán)上進(jìn)行掃描照射，照射時(shí)間每個(gè)佯品60分鐘，約打7000個(gè)脈沖。5)培養(yǎng)：激光照射后，將樣品用新鮮的培養(yǎng)液沖洗1-2次，然后接種在裝有液體培養(yǎng)基的小培養(yǎng)皿中，25度條件下懸浮培養(yǎng)2-3天或固體培養(yǎng)。10.病毒顆

59、粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法（1）原理：用病毒(噬菌體)DNA(或RT-DNA)構(gòu)建的克隆載體或攜帶目的基因的克隆體，在體外包裝成病毒(噬菌體)顆粒后，感染受體細(xì)胞，使其攜帶的重組DNA進(jìn)入受體細(xì)胞，將此過程稱為病毒(噬菌體)顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法。（2）適用范圍：主要用于構(gòu)建基因文庫和目的轉(zhuǎn)基因，早期也用于植物的轉(zhuǎn)基因。（3）類型：帶有目的基因的病毒顆粒直接感染受體細(xì)胞，目的基因打隨同病毒DNA分子整合到受體細(xì)胞染色體DNA上，這樣以后不需要再包裝成病毒顆粒。帶有目的基因的病毒是缺陷型的，需同另一輔助病毒一起感染受體細(xì)胞，在受體細(xì)胞內(nèi)包裝成新的病毒顆粒。雖然帶有目的基因的SV40早期轉(zhuǎn)錄是缺陷型的，但被感染的cos細(xì)胞系的

60、基因組中整合的SV40早期轉(zhuǎn)錄區(qū)段DNA，所以無需輔助病毒做混合感染。11.磷酸鈣轉(zhuǎn)染法（1）原理：哺乳動(dòng)物細(xì)胞能捕獲黏附在細(xì)胞表面的DNA-磷酸鈣沉淀物，使DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞。（2）基本操作過程：將待轉(zhuǎn)染的外源DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液，逐滴加入到不斷攪拌的Hepers-磷酸鈣溶液中，形成DNA-磷酸鈣共沉淀復(fù)合物；用吸管將沉淀復(fù)合物黏附在哺乳動(dòng)物單層培養(yǎng)細(xì)胞表面；保溫幾小時(shí)后，用新鮮培養(yǎng)液洗凈細(xì)胞，再用新鮮培養(yǎng)茹繼續(xù)培養(yǎng)，直至外源基因表達(dá)。（3）特點(diǎn)：多使用高濃度的DNA，1050g/ml；保溫時(shí)間隨受體細(xì)胞而異；Hepers-磷酸鈣溶液應(yīng)不斷攪拌，DNA溶液則應(yīng)緩慢加入