組織芯片技術(shù)課件

1、組織芯片技術(shù)組織芯片技術(shù)組織芯片技術(shù)組織芯片技術(shù) 組織芯片是由生物芯片發(fā)展延伸而來(lái)的組織芯片是由生物芯片發(fā)展延伸而來(lái)的一種特殊的生物芯片技術(shù)一種特殊的生物芯片技術(shù),是生物芯片重要的是生物芯片重要的組成部分。組成部分。 組織芯片技術(shù) 生物芯片生物芯片(biochip) (biochip) 是將大量特定核酸片段、多是將大量特定核酸片段、多肽分子、細(xì)胞等按照一定的設(shè)計(jì)方案肽分子、細(xì)胞等按照一定的設(shè)計(jì)方案, ,通過(guò)微加工及微通過(guò)微加工及微電子技術(shù)固定在載體電子技術(shù)固定在載體( (如硅片、玻片、尼龍膜等如硅片、玻片、尼龍膜等) ) 的表的表面形成生物分子點(diǎn)陣。生物芯片包括基因芯片、蛋白面形成生物分子點(diǎn)陣

2、。生物芯片包括基因芯片、蛋白芯片和組織芯片。芯片和組織芯片。組織芯片技術(shù) 組織芯片組織芯片(tissue chip) 又稱組織微陣列又稱組織微陣列(tissue microarray) 技術(shù)技術(shù), 是由是由Kononen 等于等于1998 年首先年首先建立并報(bào)道建立并報(bào)道, 一般是將數(shù)十至一般是將數(shù)十至上百個(gè)甚至更多小的組織整齊上百個(gè)甚至更多小的組織整齊有序地排列在一張載玻片上而有序地排列在一張載玻片上而制成縮微組織芯片制成縮微組織芯片, 即組織切即組織切片。片。 組織芯片技術(shù) 組織芯片技術(shù)是以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的分子生組織芯片技術(shù)是以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)新技術(shù)物學(xué)新技術(shù), 可以做常規(guī)病理學(xué)的可

3、以做常規(guī)病理學(xué)的HE 染色、各染色、各種免疫組織化學(xué)染色、組織化學(xué)染色、原位雜交、種免疫組織化學(xué)染色、組織化學(xué)染色、原位雜交、熒光原位雜交、原位熒光原位雜交、原位PCR和原位和原位RTPCR 等等, 可在同一張切片上高通量獲得組織學(xué)、基因和蛋可在同一張切片上高通量獲得組織學(xué)、基因和蛋白的表達(dá)信息白的表達(dá)信息,這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用范圍涵括了整個(gè)這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用范圍涵括了整個(gè)生命科學(xué)中各個(gè)基礎(chǔ)研究、臨床研究、應(yīng)用研究生命科學(xué)中各個(gè)基礎(chǔ)研究、臨床研究、應(yīng)用研究以及藥物開(kāi)發(fā)的相關(guān)領(lǐng)域以及藥物開(kāi)發(fā)的相關(guān)領(lǐng)域, 組織芯片技術(shù)選取所需蠟塊選取所需蠟塊,常規(guī)切片做常規(guī)切片做HE 染色染色,顯微鏡下顯微鏡下 確定目標(biāo)區(qū)

4、并做定位標(biāo)記。確定目標(biāo)區(qū)并做定位標(biāo)記。1 組織芯片制備過(guò)程組織芯片制備過(guò)程組織芯片技術(shù)采用組織芯片儀在受體蠟塊上打孔采用組織芯片儀在受體蠟塊上打孔,并精確排成并精確排成 微孔陣列。微孔陣列。在做標(biāo)記的蠟塊上鉆取組織柱在做標(biāo)記的蠟塊上鉆取組織柱,按設(shè)計(jì)方案移到按設(shè)計(jì)方案移到 受體蠟塊上。受體蠟塊上。組織芯片技術(shù)組織芯片技術(shù)組織芯片技術(shù)組織芯片技術(shù)組織芯片技術(shù)組織芯片技術(shù)組織芯片技術(shù)組織芯片技術(shù)組織芯片技術(shù)把設(shè)計(jì)好的蠟塊放入溫箱把設(shè)計(jì)好的蠟塊放入溫箱,根據(jù)蠟質(zhì)根據(jù)蠟質(zhì),調(diào)定溫箱調(diào)定溫箱 溫度溫度,在半融狀態(tài)下取出在半融狀態(tài)下取出,室溫冷卻室溫冷卻,放入放入4 冰冰 箱中備用。箱中備用。借助特定切片

5、輔助系統(tǒng)借助特定切片輔助系統(tǒng)粘著包被帶卷片系統(tǒng)粘著包被帶卷片系統(tǒng), 對(duì)組織芯片蠟塊連續(xù)切片。切片厚度對(duì)組織芯片蠟塊連續(xù)切片。切片厚度2 3m , 一般可切片一般可切片50100 張。張。組織芯片技術(shù)全自動(dòng)組織芯片儀全自動(dòng)組織芯片儀1.采用軟件自動(dòng)控制，按照實(shí)驗(yàn)者的設(shè)計(jì)方便、快速和精確地創(chuàng)建采用軟件自動(dòng)控制，按照實(shí)驗(yàn)者的設(shè)計(jì)方便、快速和精確地創(chuàng)建高密度或低密度的組織芯片。高密度或低密度的組織芯片。2.界面友好便于操作：能顯示保存一些重要參數(shù)；提示用戶需界面友好便于操作：能顯示保存一些重要參數(shù)；提示用戶需要要 取樣的樣品塊代號(hào)及組織類型；配有攝像頭，原始臘塊的取樣的樣品塊代號(hào)及組織類型；配有攝像頭

6、，原始臘塊的圖像直接反映到屏幕上，取樣時(shí)可在屏幕上用鼠標(biāo)點(diǎn)取定位。圖像直接反映到屏幕上，取樣時(shí)可在屏幕上用鼠標(biāo)點(diǎn)取定位。3.可以進(jìn)行精確的可以進(jìn)行精確的3維自動(dòng)精確控制，坐標(biāo)打孔位置維自動(dòng)精確控制，坐標(biāo)打孔位置 ，打孔深度，打孔深度 ，4.可以同時(shí)制做多個(gè)相同設(shè)計(jì)組織芯片受體蠟塊?？梢酝瑫r(shí)制做多個(gè)相同設(shè)計(jì)組織芯片受體蠟塊。組織芯片技術(shù)組織芯片技術(shù)組織芯片技術(shù)常見(jiàn)的分類方法常見(jiàn)的分類方法: 2. 組織芯片分類組織芯片分類根據(jù)一張芯片上樣本含量的多少分為根據(jù)一張芯片上樣本含量的多少分為 低密度芯片低密度芯片( 600 點(diǎn)點(diǎn)) 組織芯片技術(shù)組織芯片技術(shù) 目前國(guó)際上常用的目前國(guó)際上常用的TMA的標(biāo)本量

7、多為的標(biāo)本量多為60-100個(gè)，組織片的直徑在個(gè)，組織片的直徑在2mm左右。一般情況左右。一般情況下，在直徑下，在直徑2mm的組織片上有約的組織片上有約100000個(gè)細(xì)胞，個(gè)細(xì)胞，而直徑而直徑0.6mm的組織片上僅有約的組織片上僅有約30000個(gè)細(xì)胞個(gè)細(xì)胞 。組織芯片技術(shù)按組織來(lái)源分為按組織來(lái)源分為人類組織芯片疾病組織芯片正常組織芯片胚胎組織芯片 惡性腫瘤組織芯片良性腫瘤組織芯片其它疾病組織芯片動(dòng)物組織芯片組織芯片技術(shù)預(yù)后組織芯片 由治療前后的腫瘤組織組成，用 于尋找與治療和預(yù)后有關(guān)的標(biāo)志物。 腫瘤組織芯片多腫瘤組織芯片 （由多種類型腫瘤組成，用于腫瘤 基因和/或相關(guān)基因的篩選）腫瘤進(jìn)展組織芯

8、片 （由不同發(fā)展階段的腫瘤組織組 成包括癌前病變、甚至正常組織）組織芯片技術(shù) 應(yīng)用組織芯片技術(shù)研究的腫瘤范圍很廣應(yīng)用組織芯片技術(shù)研究的腫瘤范圍很廣, 幾乎幾乎涉及全身涉及全身, 包括胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、包括胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、大腸癌、卵巢癌等肺癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、大腸癌、卵巢癌等 3.組織芯片的應(yīng)用組織芯片的應(yīng)用（1）組織芯片在腫瘤學(xué)研究中的作用組織芯片在腫瘤學(xué)研究中的作用組織芯片技術(shù)不同組織來(lái)源腫瘤的相關(guān)基因表達(dá)狀況不同組織來(lái)源腫瘤的相關(guān)基因表達(dá)狀況 有學(xué)者采用組織芯片技術(shù)有學(xué)者采用組織芯片技術(shù), 選用選用5 種常種常用抗體用抗體(AE1

9、/ 3、波形蛋白、波形蛋白、CD45、結(jié)蛋白、結(jié)蛋白和和S - 100 蛋白蛋白) 對(duì)對(duì)54 例正常組織和例正常組織和60 例腫例腫瘤標(biāo)本進(jìn)行了抗原檢測(cè)瘤標(biāo)本進(jìn)行了抗原檢測(cè), 結(jié)果證實(shí)了大部分結(jié)果證實(shí)了大部分正常組織與腫瘤組織之間可表達(dá)相同的抗正常組織與腫瘤組織之間可表達(dá)相同的抗原原,部分抗原具有特殊性。部分抗原具有特殊性。組織芯片技術(shù) 同一腫瘤不同發(fā)展階段的相關(guān)基因表達(dá)狀況同一腫瘤不同發(fā)展階段的相關(guān)基因表達(dá)狀況 用前列腺不同階段的病變組織（良性前列腺增用前列腺不同階段的病變組織（良性前列腺增生、原發(fā)癌、轉(zhuǎn)移癌及激素治療失敗后的局部復(fù)發(fā)生、原發(fā)癌、轉(zhuǎn)移癌及激素治療失敗后的局部復(fù)發(fā)癌）癌） 制成

10、組織芯片。制成組織芯片。 檢測(cè)檢測(cè)5 個(gè)基因個(gè)基因 （ 男性激素受體基因、男性激素受體基因、myc 、erbB - 2、細(xì)胞周期蛋、細(xì)胞周期蛋D1、N myc）。）。 證明前列腺組織不同階段的病變具有一些相關(guān)證明前列腺組織不同階段的病變具有一些相關(guān)的基因類型的基因類型, 轉(zhuǎn)移癌與轉(zhuǎn)移癌與myc 基因擴(kuò)增有關(guān)，基因擴(kuò)增有關(guān)， 激素治激素治療失敗后的局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移癌與男性激素受體基因療失敗后的局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移癌與男性激素受體基因擴(kuò)增有關(guān)擴(kuò)增有關(guān)。組織芯片技術(shù) 利用組織芯片技術(shù)和免疫組織化學(xué)技利用組織芯片技術(shù)和免疫組織化學(xué)技術(shù)術(shù)(SP法法)檢測(cè)檢測(cè)40例原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌例原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(HCC)及其

11、相應(yīng)癌旁、遠(yuǎn)離癌正常組織中及其相應(yīng)癌旁、遠(yuǎn)離癌正常組織中Rb蛋白蛋白的表達(dá)情況的表達(dá)情況,證明證明HCC的發(fā)生、發(fā)展與的發(fā)生、發(fā)展與Rb蛋白的缺失可能有關(guān)。蛋白的缺失可能有關(guān)。組織芯片技術(shù) 組織芯片與基因芯片聯(lián)合應(yīng)用組織芯片與基因芯片聯(lián)合應(yīng)用, 發(fā)現(xiàn)新發(fā)現(xiàn)新 的腫瘤相關(guān)基因的腫瘤相關(guān)基因, 揭示未知的生物功能揭示未知的生物功能 對(duì)激素治療失敗的前列腺癌的病因?qū)W進(jìn)對(duì)激素治療失敗的前列腺癌的病因?qū)W進(jìn)行行cDNA芯片表達(dá)譜研究，并對(duì)高表達(dá)基因作芯片表達(dá)譜研究，并對(duì)高表達(dá)基因作組織芯片驗(yàn)證，篩選到在前列腺癌激素治療組織芯片驗(yàn)證，篩選到在前列腺癌激素治療失敗的樣本中顯著表達(dá)的胰島素樣生長(zhǎng)因子失敗的樣本中

12、顯著表達(dá)的胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白2，提示胰島素樣生長(zhǎng)因子可能是前，提示胰島素樣生長(zhǎng)因子可能是前列腺癌發(fā)展過(guò)程中關(guān)鍵的信號(hào)調(diào)節(jié)途徑。列腺癌發(fā)展過(guò)程中關(guān)鍵的信號(hào)調(diào)節(jié)途徑。組織芯片技術(shù)（2）組織芯片在免疫組織化學(xué)質(zhì)量控制中的應(yīng)用）組織芯片在免疫組織化學(xué)質(zhì)量控制中的應(yīng)用 可根據(jù)質(zhì)控的需要設(shè)計(jì)出各種不同組織芯可根據(jù)質(zhì)控的需要設(shè)計(jì)出各種不同組織芯片片,同時(shí)對(duì)多種不同情況進(jìn)行檢測(cè)同時(shí)對(duì)多種不同情況進(jìn)行檢測(cè),如抗體染色是如抗體染色是否成功否成功,染色的強(qiáng)弱情況染色的強(qiáng)弱情況,有沒(méi)有內(nèi)源性生物素的有沒(méi)有內(nèi)源性生物素的干擾等。干擾等。 組織芯片技術(shù) 北京友誼醫(yī)院病理科制備標(biāo)準(zhǔn)化組織芯片進(jìn)北京友誼醫(yī)院病理

13、科制備標(biāo)準(zhǔn)化組織芯片進(jìn)行免疫組化質(zhì)控測(cè)定行免疫組化質(zhì)控測(cè)定 每張測(cè)試片中含每張測(cè)試片中含9 個(gè)組織芯個(gè)組織芯,而每個(gè)點(diǎn)都代表而每個(gè)點(diǎn)都代表不同的組織不同的組織,陰性和不同程度的陽(yáng)性都包含在內(nèi)陰性和不同程度的陽(yáng)性都包含在內(nèi),能充分反映染色質(zhì)量的優(yōu)劣。并且選用了含生物能充分反映染色質(zhì)量的優(yōu)劣。并且選用了含生物素高的肝和腎作為標(biāo)記點(diǎn)素高的肝和腎作為標(biāo)記點(diǎn), 同時(shí)又可檢測(cè)使用生同時(shí)又可檢測(cè)使用生物素標(biāo)記檢測(cè)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室在免疫組化染色前是物素標(biāo)記檢測(cè)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室在免疫組化染色前是否滅活內(nèi)源性生物素否滅活內(nèi)源性生物素 。組織芯片技術(shù)左：彌漫性大左：彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞淋巴瘤CD20染色（染色理想）染色

14、（染色理想）右：彌漫性大右：彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞淋巴瘤CD20染色（染色太淺）染色（染色太淺）組織芯片技術(shù)左：PR染色，由于未封閉內(nèi)源性生物素而導(dǎo)致肝細(xì)胞胞質(zhì)著色右：PR染色，由于未封閉內(nèi)源性生物素而導(dǎo)致腎細(xì)胞胞質(zhì)著色組織芯片技術(shù)左：乳腺癌PR染色（染色理想）右：乳腺癌PR染色（染色不理想）組織芯片技術(shù) 利用組織芯片技術(shù)制作特殊染色陽(yáng)性對(duì)照的組織芯片,將陽(yáng)性對(duì)照的組織芯片與待檢測(cè)的組織裱在同一張玻璃切片上,進(jìn)行特殊染色 （3）組織芯片技術(shù)在特殊染色陽(yáng)性對(duì)照中的應(yīng)用）組織芯片技術(shù)在特殊染色陽(yáng)性對(duì)照中的應(yīng)用組織芯片技術(shù)4 .組織芯片的優(yōu)點(diǎn)組織芯片的優(yōu)點(diǎn)（1）高通量 利用組織芯片技術(shù)和免疫組化技

15、術(shù)檢測(cè)120例胃粘膜病組織中13種細(xì)胞周期調(diào)控因子(Ubipuitin、p16、p21、p27、p53、p57、cyclinA、cyclinB、cyclinD1、cyclinE、CDK2、CDK4、CDK6)的表達(dá),僅用13張芯片就完成了全部實(shí)驗(yàn),并獲得了胃粘膜疾病中13種細(xì)胞周期調(diào)控因子表達(dá)的數(shù)據(jù)。組織芯片技術(shù)（2）平行性平行性 腫瘤組織芯片技術(shù)采用同一標(biāo)準(zhǔn)選材、操作和判定結(jié)果,所得結(jié)果均一可靠組織芯片技術(shù)（3）實(shí)驗(yàn)誤差?。?shí)驗(yàn)誤差小 組織芯片可同時(shí)檢測(cè)一種腫瘤不同階段的基因表達(dá)狀況,能在一張切片上同時(shí)看到一個(gè)腫瘤組織在原位、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)中的基因擴(kuò)增情況。它使分析成百乃至上千個(gè)腫瘤標(biāo)本中DNA

16、、mRNA、蛋白質(zhì)的工作在最短的時(shí)間內(nèi)完成。組織芯片中的眾多組織都處在相同條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn),因此較傳統(tǒng)的病理切片的實(shí)驗(yàn)誤差小。組織芯片技術(shù)（4）高效性）高效性 組織芯片因其體積小,信息含量高 省時(shí)、省力、節(jié)約經(jīng)費(fèi)、節(jié)省試劑（12 周之內(nèi)可完成數(shù)千個(gè)組織標(biāo)本的數(shù)十個(gè)基因表達(dá)或蛋白分子的定位、定量、定性分析。是傳統(tǒng)病理學(xué)方法所需費(fèi)用的1/ 101/ 100） 可最大限度地利用有限的標(biāo)本資源 ,易于開(kāi)展交流及合作組織芯片技術(shù)(5) 用途廣泛用途廣泛 既可用于基礎(chǔ)研究, 也可用于臨床研究?？捎糜诜肿釉\斷,預(yù)后指標(biāo)篩選、治療靶點(diǎn)定位、抗體和藥物篩選、基因和蛋白表達(dá)分析等等 組織芯片技術(shù)5.局限性局限性（1）組織標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題）組織標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題 檔案蠟塊組織的前期固定和處理不規(guī)范，處理方法不統(tǒng)一，尤其是對(duì)某些特殊標(biāo)本的處理不夠準(zhǔn)確，使其存在一定程度的蛻變，往往會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。這些在對(duì)組織芯片進(jìn)行分析時(shí)就不能采用同一標(biāo)準(zhǔn)去評(píng)價(jià)和分析，不利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的綜合評(píng)定,更不利于實(shí)驗(yàn)科室間的信息交流與合作。組織芯片技術(shù)（2）芯片中組織標(biāo)本的代表性）芯片中組織標(biāo)本的代表性 組織芯片雖然可制成高密度點(diǎn)陣，但其精確性并不與點(diǎn)陣數(shù)目呈完全正相關(guān)，主要問(wèn)題是取樣點(diǎn)小，在構(gòu)建腫瘤組織微陣列時(shí)所取樣本是否正確，并且